回流法提取菠蘿皮中多酚及其含量的測定

宋 力，薛靈芬，李 森，謝 燦，張克立

(1.信陽師范學院 化學化工學院，河南 信陽 464000；2. 武漢大學 化學與分子科學學院，湖北 武漢 430072)

0 引言

我國南方是菠蘿的盛產(chǎn)地，菠蘿中所含的糖、酶有利尿作用，對腎炎和高血壓者有益.由于菠蘿不耐貯藏，多用以加工為罐頭，加工產(chǎn)生的菠蘿皮占菠蘿全果重量的60%以上，多被作為廢物丟棄，而菠蘿皮中富含菠蘿酶，有豐富的藥用價值.因此，減少菠蘿在加工中的損失，提高菠蘿皮的利用率和產(chǎn)品附加值[1]，已經(jīng)成為近幾年菠蘿產(chǎn)業(yè)發(fā)展中迫切需要解決的問題，尤其是對菠蘿皮中多酚類抗氧化物質(zhì)的研究越來越受到人們的關注[2].

本實驗以菠蘿皮為原料，采用沸水浴法，回流法，超聲波法，微波法不同的四種方法作對比，從而篩選出提取菠蘿皮中多酚的最好方法，通過正交試驗法優(yōu)化工藝條件，利用酒石酸亞鐵對多酚的顯色反應[3-4]，以沒食子酸為標準物，表征提取物中多酚的含量，以期為有效利用菠蘿皮和菠蘿皮工業(yè)化提取生產(chǎn)多酚類化合物提供新的實驗依據(jù)和參考價值，并有效減少菠蘿皮對環(huán)境的污染.

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

菠蘿皮(市售菠蘿削皮).

主要試劑：95%乙醇，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；沒食子酸標準樣品，成都市科龍化工試劑廠；硫酸亞鐵，天津市大茂化學試劑廠；30%過氧化氫、酒石酸鉀鈉、還原鐵粉，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠.以上所有試劑均為分析純.

主要儀器：KQ-2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；明秀光波GB023CT-K3，佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；UV80003雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；VIS-7220分光光度計，北京第二光學儀器廠.

1.2 抗氧化成分的不同提取方法

1)沸水浴法 將菠蘿皮自然晾干，于60 ℃干燥8 h，粉碎過60目篩，稱取菠蘿皮粉末1.000 g，于沸水浴中提取1.5h.減壓抽濾，靜置，移取上層清液測定吸光度計算清除率值.

2)回流法 稱取上述菠蘿皮粉末1.000 g，加入50 mL80%乙醇溶液回流1.5h.減壓抽濾，靜置，移取上層清液測定吸光度計算清除率值.

3)超聲波法 稱取上述菠蘿皮粉末1.000 g，加入50 mL60%乙醇溶液，在超聲波清洗儀中于80 ℃下提取21 min.減壓抽濾，靜置，移取上層清液測定吸光度計算清除率值.

4)微波法 稱取上述菠蘿皮粉末1.000 g，加入40 mL75%乙醇溶液，在微波爐中于80 W下提取2min.減壓抽濾，靜置，移取上層清液測定吸光度計算清除率值.

1.3 抗氧化性的測定

按照文獻[7]通過測定吸光度計算清除率值比較羥自由基的清除效果.測出采用不同方

法提取的抗氧化成分的吸光度，計算出自由基清除率(P，%)的數(shù)據(jù).

1.4 菠蘿皮提取物中抗氧化物質(zhì)含量的測定

準確稱取菠蘿皮粉末2.000 g，在540 nm波長處，測定吸光度A值，對照沒食子酸標準曲線，計算總酚含量[5].

配制不同濃度的沒食子酸標準溶液，在相同條件下測定其吸光度值，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線.根據(jù)不同提取條件下的吸光度值，對照標準曲線，得到提取物中的多酚含量.吸光度A值越大，提取物中的多酚含量越多[6].

2 結(jié)果與分析

2.1 四種方法對清除率的影響

采用四種方法提取的抗氧化成分的吸光度與自由基的清除率(P,%)的數(shù)據(jù)列于表1.

表1 四種方法對清除率的影響Tab. 1 The influence of four methods for clearance

由表1可知，從菠蘿皮中提取抗氧化成分采用回流法的清除率最高，其抗氧化效果最好.

2.2 沒食子酸標準曲線的制作

準確移取標準溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00 mL于50mL容量瓶中，加入酒石酸亞鐵溶液和 pH=7.5的磷酸緩沖溶液各10.00 mL，加蒸餾水定容，靜置15 min，在540 nm處用分光光度計分別測定吸光度A值.以沒食子酸標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線.根據(jù)空白溶液和各樣品測定液的吸光度，從標準曲線上查出各樣品測定液中多酚的含量.酚的含量為10～180 mg/L，其濃度與吸光度A呈線性關系，其線性回歸方程為y= 0.006x-0.022，R2= 0.999，由此表明線性關系良好[7].

2.3 回流提取法浸取單因素實驗

對可能影響菠蘿皮多酚得率的幾個因素(提取劑濃度、提取時間、提取溫度、料液比)分別作單因素試驗，測定浸取液的吸光度，平行測定6次，計算總酚含量.

2.3.1 提取溶劑濃度的選擇

稱取菠蘿皮粉末10.000 g，分別加入體積分數(shù)20%、45%、70%、80%、95%的乙醇，在30 ℃水浴下按料液比為1∶4 (g∶mL)回流提取30 min，按照1.3法測定吸光度A值.對照沒食子酸標準曲線，計算總酚含量，選取提取效果最佳的提取溶劑濃度.測得不同體積分數(shù)乙醇為提取溶劑條件下的吸光度數(shù)據(jù)計算出總酚含量，以乙醇濃度為橫坐標，總酚含量為縱坐標作圖，見圖1.

圖1 乙醇濃度對提取率的影響Fig. 1 Effect of alcohol concentration on extraction ratio

由圖1可以看出，乙醇的體積分數(shù)對菠蘿皮中多酚提取率的影響是不同的.開始時提取液中的多酚含量隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增大，當乙醇體積分數(shù)為70%時，提取液中多酚的含量達到最大值，隨后提取液中多酚含量呈現(xiàn)下降的趨勢，說明多酚在乙醇中的溶解度是有限的，當乙醇濃度過高時，形成了過飽和溶液使提取液中多酚含量隨之降低.單因素實驗表明：乙醇體積分數(shù)為70%時，提取液中的抗氧化物質(zhì)含量最大.

2.3.2 提取溫度對提取率的影響

稱取菠蘿皮粉末10.000 g ，用70%的乙醇做提取溶劑，料液比為1∶4 (g∶mL)，分別在不同溫度30 ℃、50 ℃、70℃、90 ℃、100 ℃回流提取30 min，按照1.3法測定吸光度A，對照沒食子酸標準曲線，計算總酚含量，選取總酚含量最大值為提取溫度.

測得不同提取溫度下的吸光度值計算出總酚含量，以提取溫度為橫坐標，總酚含量為縱坐標作圖，見圖2.

由圖3可知，不同的提取溫度對菠蘿皮中多酚的提取率有不同的影響.當提取溫度由30 ℃增加到50 ℃時，提取液中的多酚質(zhì)含量隨之增大，而后隨著溫度的升高，溶劑發(fā)生揮發(fā)現(xiàn)象，使多酚含量呈現(xiàn)下降的趨勢.單因素實驗表明：提取溫度為50 ℃時，提取液中的抗氧化物質(zhì)含量最大.

圖2 提取溫度對提取率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on extraction ratio

2.3.3 提取時間對提取率的影響

稱取菠蘿皮粉末10.000 g，用70%的乙醇做提取溶劑，提取溫度為50 ℃，料液比為1 ∶4(g∶mL)，分別在不同時間15、30、45、60、70 min條件下回流提取，按照1.3法測定吸光度A，對照沒食子酸標準曲線，計算總酚含量，選取總酚含量最大值為提取時間.

測得不同提取時間下的吸光度數(shù)據(jù)計算出總酚含量，以提取時間為橫坐標，總酚含量為縱坐標作圖.由圖3可知，不同的提取時間對菠蘿皮中抗氧化物質(zhì)提取率有不同的影響.當提取時間由15 min增加到45 min時，提取液中的多酚含量隨之增大，隨著時間增加，溶劑揮發(fā)現(xiàn)象加重，而且菠蘿皮粉末中更多的多酚被氧化而呈現(xiàn)下降的趨勢.單因素實驗表明：提取時間為45 min時，提取液中的抗氧化物質(zhì)含量最大.

圖3 提取時間對提取率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on extraction ratio

2.3.4 料液比對提取率的影響

稱取菠蘿皮粉末10.000 g，用70%的乙醇做提取溶劑，提取溫度為50 ℃，提取時間為45 min，分別以料液比為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10(g∶mL)條件下回流提取，按照1.3法測定吸光度A，對照沒食子酸標準曲線，計算總酚含量，以料液比為橫坐標，總酚含量為縱坐標作圖，見圖4.

圖4 料液比對提取率的影響Fig. 4 Effect of the ratio of material to liquid on extraction ratio

由圖4可知，不同的料液比對菠蘿皮中抗氧化物質(zhì)的提取率的影響是不同的.當料液比由1∶2(g∶mL)增加到1∶6(g∶mL)時，提取液中的抗氧化物質(zhì)含量隨著增大，提取時間為1∶6(g∶mL)時，提取液中的抗氧化物質(zhì)含量最多，而后隨著時間增加呈現(xiàn)下降的趨勢.單因素實驗表明：料液比為1∶6(g∶mL)時，提取液中的抗氧化物質(zhì)含量最大.

2.4 浸提條件的優(yōu)化

以提取劑濃度、提取溫度、提取時間、料液比為考察因素，總酚得率為響應值,選擇L9(43) 正交表進行四因素三水平試驗設計，確定總酚的最佳提取條件.表2是因素與水平表，正交試驗結(jié)果見表3.

本實驗的四個因素對菠蘿皮中抗氧化成分的提取有不同的影響.由表3中的極差R值得知，乙醇濃度A、提取溫度B、提取時間C、料液比D各因素對實驗結(jié)果的影響主次排序為：乙醇濃度A，提取溫度B，料液比D，提取時間C.綜合考慮極差R值、平均值、經(jīng)濟成本、利潤最大化等因素，確定最佳工藝條件為：提取劑乙醇濃度70%，提取溫度30 ℃，料液比1∶8(g∶mL)，提取時間45 min，總酚得率最高.

表2 正交試驗的因素與水平Tab. 2 Factors and levels orthogonal experiment

表3 正交試驗結(jié)果Tab. 3 The results of orthogonal experiment

2.5 菠蘿皮中多酚含量的測定

稱取菠蘿皮粉末10.000 g，在優(yōu)化條件下進行回流，測定濾液吸光度A，對照沒食子酸標準曲線，計算總酚含量.結(jié)果為菠蘿皮中乙醇提取物多酚含量為12.65 mg/g.

2.6 菠蘿皮提取液的紫外可見吸收光譜分析

稱取菠蘿皮粉末10.000 g，在優(yōu)化條件下進行回流，靜置，取上層清液，在UV80003雙光束紫外可見分光光度計上在200～700 nm范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果出現(xiàn)兩個主要吸收帶，帶Ⅰ位于218 nm處為較強的吸收峰，帶Ⅱ位于在300 nm處為弱的吸收峰，符合多酚類物質(zhì)中酚羥基的吸收.

3 結(jié)論

以菠蘿皮為原料，采用沸水浴法，回流法，超聲波法，微波法四種不同方法提取其中多酚，回流法從菠蘿皮中提取抗氧化成分的清除率最高；以提取劑濃度、提取溫度、提取時間、料液比為考察因素，總酚得率為響應值,通過單因素實驗和正交試驗對提取工藝條件進行優(yōu)化，利用酒石酸亞鐵對多酚的顯色反應表征提取物中多酚的含量,結(jié)果表明： 乙醇濃度對多酚提取影響最大, 其次為浸取溫度和料液比, 浸取時間影響較小.本實驗具有方法、設備簡單、操作快捷、靈敏度高、結(jié)果準確、省時且成本低廉等優(yōu)點，是提取并測定菠蘿皮中多酚含量的較好方法，具有在行業(yè)推廣的意義.