光周期對葛仙米生長和光合系統(tǒng)活性的影響

安彥君，饒本強，鄭春杰，代真真，李敦海，劉其芳，劉永定

(1.中國科學(xué)院 水生生物研究所，湖北 武漢 430072；2.常德炎帝生物科技有限公司，湖南 常德 415707；3.信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000)

0 引言

葛仙米(NostocsphaeroidesKutzing)學(xué)名擬球狀念珠藻,俗稱水木耳、天仙菜、珍珠菜、田木耳，藍藻綱，念珠藻科.藻體呈膠質(zhì)狀、由多數(shù)細胞連成念珠狀群體，外觀呈球狀，藍綠色或黃褐色.葛仙米是我國傳統(tǒng)出口的一種珍貴野生食藥兩用藍藻[1].

據(jù)古醫(yī)書記載，葛仙米有治療夜盲癥、脫肛、燙傷等功效，另外還具有明目益氣、解熱清膈、利腸胃、久食延年、消除疲勞、收斂等功效.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)動物試驗表明，葛仙米不但能夠顯著促進小鼠的生長發(fā)育，而且具有抗氧化、提高免疫力的功效，此外，還具有一定的抗癌功效[2，3]；現(xiàn)代營養(yǎng)檢測分析技術(shù)表明，葛仙米富含蛋白質(zhì)、維生素和微量元素，還可分泌多種具生物活性的胞外多糖；其中，葛仙米藻膽蛋白抗氧化[4]和提高免疫力[5]的功效已得到驗證，已有學(xué)者開始開展葛仙米藻膽蛋白的消化特性研究[8].

據(jù)調(diào)查，葛仙米常見于河溪石塊和水稻田中，在我國大部分地區(qū)有分布，其中湖北省鶴峰縣產(chǎn)量之多，尤為罕見，而在世界范圍內(nèi)其分布稀少，產(chǎn)量甚微.隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，葛仙米的大部分生境已遭到破壞，鶴峰縣葛仙米年產(chǎn)量已從20年前的25×103kg銳減至0.5×103kg[7].因此開發(fā)葛仙米人工培植技術(shù)勢在必行.本文通過研究光周期對葛仙米生長和光合系統(tǒng)活性的影響，探索較佳的光暗周期比，旨在提高葛仙米產(chǎn)量，降低能耗，為室內(nèi)人工培植技術(shù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葛仙米(NostocsphaeroidesKutzing)藻種由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供.實驗采用過80目篩后的小群體作為初始接種材料，群體直徑≤0.5 mm.

1.2 實驗處理

按照表1設(shè)置3個不同的光暗周期比處理組，每組處理設(shè)置3個平行.

表1 3個不同的光周期處理組

培養(yǎng)容器為500 mL錐形瓶中.采用BG110液體培養(yǎng)基，置于23 ℃±1 ℃恒溫培養(yǎng)間靜止培養(yǎng)，光源為冷白熒光燈，光照強度為40～50 μmol·m-2·s-1.

實驗為3個批次的連續(xù)培養(yǎng).第一個批次將過80目篩后直徑小于0.5 mm的小群體分裝于500 mL錐形瓶中，另取500 mL錐形瓶，加入300 mL BG110培養(yǎng)基，接入鮮質(zhì)量為2.5 g的葛仙米小群體，培養(yǎng)25 d后，將所有葛仙米收獲.將每組處理的葛仙米過80目篩后再次分裝于500 mL錐形瓶中，另取500 mL錐形瓶，加入300 mL BG110培養(yǎng)基，接入2.5 g葛仙米小群體，用相同的光周期設(shè)置開始第二個批次的培養(yǎng)，第二個批次培養(yǎng)17 d后，將所有葛仙米收獲.將每組處理的葛仙米過80目篩并再次分裝于500 mL錐形瓶中，另取500 mL錐形瓶，加入300 mL BG110培養(yǎng)基，接入2.5 g葛仙米小群體，用相同的光周期設(shè)置開始第三個批次的培養(yǎng)，第三個批次的培養(yǎng)持續(xù)20 d結(jié)束.

1.3 生物量測定

采用鮮質(zhì)量法表示葛仙米的生物量.每次均勻取20 mL藻液，濾去水分，稱量鮮質(zhì)量.在第一個批次的培養(yǎng)中，每6～7 d取一次樣，測定鮮質(zhì)量.最后，在每個批次的培養(yǎng)結(jié)束時收集葛仙米，測定鮮質(zhì)量進行比較.

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

采用脈沖調(diào)制熒光儀Phyto-PAM(WALZ,Germany)測定葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和光合系統(tǒng)Ⅱ天線色素含量.測量Fv/Fm之前將樣品暗適應(yīng)20 min.

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)運用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，通過單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較各處理組同一時間采樣點間差異的顯著性，通過兩配對樣本t檢驗(Paired-Samples t test)比較同一處理組不同時間采樣點之間差異的顯著性，顯著性水平為0.05.

2 實驗結(jié)果

2.1 光周期對葛仙米生長的影響

在第一個培養(yǎng)批次中，3個光周期處理下的葛仙米鮮質(zhì)量在第6 d、第12 d和第19 d 3個處理組均沒有顯著性差異(P>0.05)，到第一個批次結(jié)束時，3個處理組均具有顯著性差異(P<0.05)，24 h連續(xù)光照組單位體積的鮮質(zhì)量最高，光暗比為1處理組次之，光暗比為0.5處理組最低(圖1).在第一個批次結(jié)束時收獲的每瓶葛仙米的鮮質(zhì)量也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果(P<0.05)(圖2).

圖2為每個培養(yǎng)批次結(jié)束時各處理組總鮮質(zhì)量比較.第一培養(yǎng)批次結(jié)束時，24 h光照處理組總鮮質(zhì)量顯著高于光暗比為1和光暗比為0.5處理組(P<0.05).第二批培養(yǎng)結(jié)束時，24 h光照處理組的總鮮質(zhì)量降到最低水平，光暗比為1處理組的總鮮質(zhì)量處于最高，此時3個光周期處理組的總鮮質(zhì)量兩兩之間沒有顯著性差異(P>0.05)；第三批培養(yǎng)結(jié)束時，24 h光照處理組的總鮮質(zhì)量仍然最低，光暗比為1處理組的總鮮質(zhì)量顯著高于24 h光照處理組和光暗比為0.5處理組，光暗比為0.5處理組的總鮮質(zhì)量也顯著高于24 h處理組(P<0.05)；3個培養(yǎng)批次結(jié)束時24 h光照處理組總鮮質(zhì)量表現(xiàn)出顯著的依次降低的趨勢(P<0.05).

圖1 第一個培養(yǎng)批次鮮質(zhì)量隨時間的變化趨勢(平均值±標準誤)

圖2 每個培養(yǎng)批次結(jié)束時各處理組每瓶總鮮質(zhì)量之間的比較

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圖3對每個培養(yǎng)批次每個處理組的始末鮮質(zhì)量和始末鮮質(zhì)量的增加量進行了對比.第一個培養(yǎng)批次末每瓶收獲的鮮質(zhì)量以及鮮質(zhì)量的始末增加量與光照時長成正比，并且處理組之間的差異顯著(P<0.05)(圖3a).第二個培養(yǎng)批次中則不存在這種正比關(guān)系，光暗比為1光周期處理組的終止鮮質(zhì)量和增加量最高，但是3個光周期處理組之間不存在顯著差異(P>0.05)(圖3b).而在第三個培養(yǎng)批次中3個光周期處理組之間又出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，光暗比為1光周期處理組的終止鮮質(zhì)量和增加量都顯著高于其他兩組，并且24 h連續(xù)光照組的鮮質(zhì)量出現(xiàn)了負增長(圖3c).從圖3d中可以看出，24 h連續(xù)光照處理組的始末鮮質(zhì)量增加量在第一個培養(yǎng)批次中最高，而光暗比為1和光暗比為0.5光周期處理組的最高值都出現(xiàn)在第二個培養(yǎng)批次中.

圖3 3個光周期下不同培養(yǎng)批次鮮質(zhì)量初始值、終止值和增加量及平均日增加量的比較Fig. 3 Fresh weight comparison of the beginning value,ending value,increasing amount and the average daily increasing amount in each culture batch culture

2.2 光周期對葛仙米光合系統(tǒng)活性的影響

光合系統(tǒng)Ⅱ的最大光合量子產(chǎn)率Fv/Fm在第一個批次的培養(yǎng)過程中呈顯著下降的趨勢，第25 d和第6 d的數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(P<0.05)，每個采樣點的各處理組之間沒有顯著性差異(P>0.05)(圖4).在此培養(yǎng)階段，光合系統(tǒng)Ⅱ的天線色素含量總體呈現(xiàn)小幅度下降的趨勢，光暗比為1處理組的數(shù)值有些不穩(wěn)定波動，24 h光照處理組和光暗比為0.5處理組之間沒有顯著性差異(P>0.05)(圖5).每個培養(yǎng)批次結(jié)束時，各處理組的Fv/Fm均沒有顯著差異(P>0.05)，第二批和第三批結(jié)束時每個處理組的Fv/Fm均顯著高于第一批(P<0.05)，第二批和第三批之間沒有顯著性差異(P>0.05)(圖6).

圖4第一個培養(yǎng)批次不同光周期處理的Fv/Fm隨時間的變化趨勢(平均值±標準誤)Fig. 4 The variation trend of Fv/Fm during the first batch culture(mean±SE)

圖5 第一個培養(yǎng)批次光系統(tǒng)Ⅱ天線色素含量隨時間的變化趨勢(平均值±標準誤)Fig. 5 The variation trend of the content of light-harvesting pigment in the antenna of PSⅡduring the first batch culture(mean±SE)

圖7對每個培養(yǎng)批次結(jié)束時各處理組光合系統(tǒng)Ⅱ天線色素的含量進行了比較.第一批培養(yǎng)結(jié)束時各處理組光合系統(tǒng)Ⅱ的天線色素含量沒有顯著差異(P>0.05).第二批培養(yǎng)結(jié)束時24 h光照處理組光合系統(tǒng)Ⅱ的天線色素含量最低，顯著低于光暗比為1和光暗比為0.5處理組(P<0.05).第三批培養(yǎng)結(jié)束時仍然是24 h光照處理組的含量最低，光暗比為0.5處理組的最高，三個處理組之間差異顯著(P<0.05).24 h光照處理組光合系統(tǒng)Ⅱ的天線色素含量從第二個培養(yǎng)批次開始顯著降低(P<0.05)，之后一直處于最低水平.光暗比為1處理組光合系統(tǒng)Ⅱ的天線色素含量在第三個批次培養(yǎng)時出現(xiàn)顯著降低(P<0.05).光暗比為0.5處理組光合系統(tǒng)Ⅱ的天線色素含量在三個批次的培養(yǎng)中一直維持在較高的水平，沒有顯著差異(P>0.05).

圖6 每個培養(yǎng)批次結(jié)束時各個處理組Fv/Fm之間的比較

圖7 每個培養(yǎng)批次結(jié)束時各處理組光合系統(tǒng)Ⅱ天線色素含量之間的比較

3 討論

3.1 光周期對葛仙米生長的影響

光抑制是自然界植物生長中普遍存在的一種現(xiàn)象，這種現(xiàn)象也同樣普遍存在于藻類的室內(nèi)培植.降低光抑制的程度對提高葛仙米產(chǎn)量具有重要意義.自然界中在較長的日照時長和較低的光照強度下植物的生長速率最高，淡水紅藻在低光照強度下的生長狀態(tài)最好[8].因此選擇相對較低的光照強度40～50 μmol·m-2·s-1作為葛仙米室內(nèi)的培養(yǎng)光強.在本研究中，24 h光照處理組在第一個培養(yǎng)批次末具有顯著的生長優(yōu)勢，光暗比為1光周期處理組次之，光暗比為0.5光周期處理組的生物量增長最慢.但24 h連續(xù)光照的生長優(yōu)勢很快消失，在第二個和第三個培養(yǎng)批次，光暗比為1光周期處理組的生長超過了24 h連續(xù)光照處理組，處于最高水平，而24 h連續(xù)光照處理組的生長降至最低，說明在第二個和第三個培養(yǎng)批次中連續(xù)光照對葛仙米的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用.在第三個批次的培養(yǎng)中，光暗比為1光周期處理組的生物量顯著高于光暗比為0.5光周期處理組，說明在一定范圍內(nèi)生物量的累積和光照時長成正比，而24 h連續(xù)光照處理組僅在第一個培養(yǎng)批次遵循這一正比關(guān)系，在后來兩個批次的培養(yǎng)中表現(xiàn)出明顯的后勁不足，甚至出現(xiàn)顯著的生物量負增長，足以表現(xiàn)24 h連續(xù)光照培養(yǎng)對葛仙米的生長抑制是不可逆的.24 h連續(xù)培養(yǎng)帶來的生長上的抑制，可能是由于過長的光照使得光合系統(tǒng)持續(xù)運轉(zhuǎn)，造成細胞內(nèi)部影響生長的代謝秩序紊亂.孫歲寒等[9]在四列藻(Tetraselmistetrathele)對光周期改變的響應(yīng)研究中也認為過長的光周期影響了藻細胞的代謝過程，擾亂了其正常的分裂模式，導(dǎo)致衰亡加快，壽命縮短.在相同的光照強度和培養(yǎng)溫度下，錐狀斯氏藻和塔瑪亞歷山大藻也表現(xiàn)出與本實驗葛仙米第一個培養(yǎng)批次相似的特性，在一定的光暗周期范圍內(nèi)，這兩種藻生物量的累積與光照時間基本成正比，所不同的是，連續(xù)光照條件下，這兩種藻生物量的累積也進一步增加，但并沒有隨光照時間的延長呈比例增加[10].此外，還有很多學(xué)者進行了24 h連續(xù)光照培養(yǎng)和光暗周期培養(yǎng)的比較研究，Price和Yin等人通過比較海洋球石藻(Emilianiahuxleyi)等11種海洋浮游植物對光周期的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)其結(jié)果具有很大的物種特異性，有的在連續(xù)光照培養(yǎng)下具有顯著的生長優(yōu)勢，有的在一定的光暗周期培養(yǎng)下具有生長優(yōu)勢[11].由于上述報道中藻類的培養(yǎng)實驗都只進行了10～25 d，僅相當(dāng)于本實驗的第一個培養(yǎng)批次，所以并不知道是否會在后期培養(yǎng)批次中表現(xiàn)出類似本實驗中連續(xù)光照培養(yǎng)條件下葛仙米生長上的負增長以及不可逆的生長抑制.

由此可見，24 h連續(xù)光照在連續(xù)批次培養(yǎng)的早期階段最有利于生長進行，但是更容易使細胞的內(nèi)部資源耗竭，雖然后期的批次培養(yǎng)中每次都更換新鮮培養(yǎng)基，但是卻無法扭轉(zhuǎn)其生長速率降低的趨勢，可見24 h連續(xù)光照對細胞的確造成了不可逆的光損傷.與24 h連續(xù)光照相比，光暗比為1和光暗比為0.5光周期處理組的生長速率均在第二個培養(yǎng)批次中出現(xiàn)最高值，但在第三個培養(yǎng)批次中也表現(xiàn)出一定程度的下降.可見葛仙米在三個光周期的長期連續(xù)批次培養(yǎng)下都會或早或晚地表現(xiàn)出生長速率的下降，可能和藻細胞的衰亡有關(guān).

3.2 光周期對葛仙米光合系統(tǒng)活性的影響

從Fv/Fm在第一個培養(yǎng)批次中全部顯著下降的趨勢來看，光抑制已經(jīng)在3個光周期處理組中普遍存在.然而Fv/Fm在第二個培養(yǎng)批次結(jié)束時全部顯著上升，說明光抑制在第二個培養(yǎng)批次中開始得到緩和，葛仙米光合系統(tǒng)應(yīng)對光抑制的調(diào)控機制已經(jīng)開始發(fā)揮作用.24 h光照處理組在第二個批次的培養(yǎng)中光合系統(tǒng)Ⅱ天線色素含量開始出現(xiàn)顯著下降，因此認為該處理組的葛仙米為了應(yīng)對長時間的光照,及時降低了其吸收光能并將能量傳遞到反應(yīng)中心的捕光天線色素含量.光暗比為1光周期處理組接受光照的時間是24 h光照處理組的一半，并且由于其具有與光照期相同時長的暗周期進行恢復(fù)，因此在第三個批次的培養(yǎng)中，該處理組的光合系統(tǒng)Ⅱ天線色素含量才開始出現(xiàn)顯著降低.光暗比為0.5光暗比處理組接受光照的時長最短，其光合系統(tǒng)Ⅱ天線色素含量在三個批次的培養(yǎng)中沒有顯著的變化，僅在第一個批次的培養(yǎng)中和其他兩個處理組一樣小幅度的下調(diào)了其光合系統(tǒng)Ⅱ天線色素的含量.可見對光合色素含量的調(diào)整是藻類植物光合系統(tǒng)中存在的較為普遍的一種重要調(diào)控手段，當(dāng)光能的供應(yīng)超過了藻類的利用能力時下調(diào)捕光色素含量；當(dāng)光能供應(yīng)不能滿足藻類的利用時則增加捕光色素含量.從光合系統(tǒng)Ⅱ天線色素含量的變化趨勢和光照時長來判斷，24 h連續(xù)光照處理組的光抑制程度最深，但是葛仙米能夠通過下調(diào)其光合系統(tǒng)Ⅱ天線色素的含量來降低光抑制對光合系統(tǒng)的破壞，從而獲得較高的光合作用效率.

4 結(jié)論

從長期連續(xù)批次培養(yǎng)的結(jié)果來看，雖然24 h的連續(xù)光照使得葛仙米在第一個培養(yǎng)批次中具有顯著的生長優(yōu)勢，但此生長優(yōu)勢在接下來的培養(yǎng)批次中很快受到抑制.盡管葛仙米具有應(yīng)對光抑制的調(diào)控機制，但是24 h光照處理組在第二個和第三個批次生長上的抑制是不可逆的，倘若將24 h連續(xù)光照應(yīng)用于室內(nèi)生產(chǎn)中，在后期的批次培養(yǎng)中將會出現(xiàn)嚴重的生物量上的損失.相比之下，光暗比為1和光暗比為0.5光周期下培養(yǎng)的葛仙米，其生長比24 h連續(xù)光照培養(yǎng)更具潛力，可見暗周期的運行在葛仙米的生長中發(fā)揮著重要作用，本實驗結(jié)果表明，光暗比為1光周期下葛仙米的生長狀態(tài)最佳.