潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血CD1d(hi) CD5+ CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的變化和臨床意義

劉玲玲，金小晶，楊　勤，崔占清

(江蘇省南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

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潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的變化和臨床意義

劉玲玲，金小晶，楊勤，崔占清

(江蘇省南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

[摘要]目的檢測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞含量的變化，探討其在 UC病情活動(dòng)性與嚴(yán)重性評(píng)價(jià)中的價(jià)值。方法采用ELISA法檢測(cè)43例活動(dòng)期UC患者、33例緩解期UC患者及30例健康對(duì)照者的外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞含量，并評(píng)價(jià)活動(dòng)期UC患者病情輕重程度，規(guī)范治療后復(fù)查血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞含量。結(jié)果活動(dòng)期UC患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞含量和CRP水平顯著高于緩解期UC患者和正常組(P均<0.05)，緩解期UC患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞含量和CRP水平與正常組比較無明顯升高(P>0.05)；外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞含量與活動(dòng)期UC病情活動(dòng)性、病情輕重程度均呈正相關(guān)(r=0.638,0.541，P<0.05)。結(jié)論活動(dòng)期UC患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞含量顯著升高，其可作為病情活動(dòng)性、嚴(yán)重性及療效評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]潰瘍性結(jié)腸炎；炎癥性腸??；調(diào)節(jié)性B細(xì)胞

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種非特異性的腸道炎癥性疾病，其確切發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與環(huán)境、遺傳、感染、免疫、精神緊張及過敏等因素有關(guān)。目前認(rèn)為，免疫異常及腸道持續(xù)的炎癥損傷是其基本發(fā)病機(jī)制[1]。B細(xì)胞作為機(jī)體中一類重要的免疫細(xì)胞，在免疫和炎癥反應(yīng)中行使著多種功能，B細(xì)胞不僅可以介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)揮正性免疫調(diào)節(jié)作用，近年來的研究顯示B細(xì)胞中還存在著發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞亞群[2]。CD1d(hi)CD5+CD19+B細(xì)胞是新近報(bào)道的一種發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞，其免疫調(diào)節(jié)作用已在多種疾病模型中得到證實(shí)[3-4]。然而有關(guān)這類細(xì)胞在UC患者中的研究不多，尤其在疾病過程中其數(shù)量比例以及功能的動(dòng)態(tài)變化尚不清楚。本研究檢測(cè)UC活動(dòng)期和緩解期CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的變化，評(píng)價(jià)其在UC病情活動(dòng)性與嚴(yán)重性中的臨床意義。

1臨床資料

1.1一般資料選擇本院2014年1—6月住院治療的UC患者76例，其中活動(dòng)性患者43例，男24例，女19例；年齡30～61(44.6±13.8)歲。緩解期患者33例，男15例，女18例；年齡29～58(40.5±15.2)歲。診斷及臨床分度符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病分化炎癥性腸病學(xué)科組制定的診斷指南[5]，并均排除近期急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤性疾病、慢性纖維化增生性疾病和播散性血管內(nèi)凝血，并均未接受任何免疫抑制劑治療。采用Rachmilewitz UC臨床活動(dòng)指數(shù)評(píng)估系統(tǒng)(CAI評(píng)分)評(píng)價(jià)病情活動(dòng)性，>4分為活動(dòng)性，<4分為緩解期[6]?；顒?dòng)期患者按病情嚴(yán)重程度分為輕型、中型、重型。 緩解期患者：3例接受氨基水楊酸制劑治療，30例曾使用過激素和氨基水楊酸制劑聯(lián)合治療。選擇健康志愿者30例作為正常組，男17例，女13例；年齡 29～59(42.5±10.5)歲。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集用肝素鋰抗凝管抽取早晨時(shí)UC患者和健康對(duì)照者外周靜脈血自采血完畢后3 h內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2單個(gè)核細(xì)胞的提取和培養(yǎng)將2 mL全血和2 mL PBS按1∶1充分混勻后沿管壁緩慢加入3 mL淋巴細(xì)胞提取液ficoll離心管中。1 500 r/min水平離心30 min。離心后可見試管內(nèi)容物可分為4層：第一層為血漿層，第二層為分離液層，單個(gè)核細(xì)胞層處于血漿層和分離液層中間，底層為紅細(xì)胞層。紅細(xì)胞層上為粒細(xì)胞層；用一次性吸管吸取單個(gè)核細(xì)胞層收集到另一離心管中；加入6 mL PBS以1 500 r/min，10 min，洗滌2次，棄上清后加RPMI 1640，將細(xì)胞數(shù)調(diào)至2×106個(gè)/mL，吸取0.5 mL，加入falcon流式管中，加入刺激劑Golgi(含刀豆蛋白A，脂多糖，離子霉素，葡萄球菌腸毒素B等)2 μL置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3血清CRP測(cè)定血清CRP測(cè)定使用德林公司提供的型號(hào)為Behring Nephelometer 100分析儀，以散射光比濁法定量測(cè)定其濃度。

1.2.4細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞儀測(cè)定向falcon管中分別加入10 μL CD5-FITC和CD19-PE充分混勻，室溫避光15 min，加入FIX RERM Reagent(A)100 μL，混勻，室溫避光15 min，加3 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清加FIX RERM Reagent(B)100 μL，同時(shí)向管中加IL-10APC 5 μL混勻,室溫避光15 min，加3 mL PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清,加500 μL PBS上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用Spass 18.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間整體比較采用單因素方差分析。2組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson等級(jí)相關(guān)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組CAI評(píng)分、CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及C反應(yīng)蛋白比較活動(dòng)期UC患者血CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞水平高于緩解期UC組和正常組(P均<0.05)，與正常組相比，緩解期UC組CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及C反應(yīng)蛋白含量升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；顒?dòng)期UC組CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞數(shù)量與CAI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.568,P<0.05)，與C反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)(r=0.532,P<0.01)。見表1。

表1　3組CAI評(píng)分、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及CRP比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與緩解期UC組比較，P<0.05。

2.2活動(dòng)期UC期患者CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與病情嚴(yán)重性的關(guān)系活動(dòng)期UC期患者CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與病情嚴(yán)重性呈正相關(guān)(r=0.638,P<0.05),CRP含量與病情嚴(yán)重性呈正相關(guān)(r=0.541,P<0.05)。輕型活動(dòng)期UC患者CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及CRP水平明顯低于中型和重型患者，中型上述指標(biāo)水平明顯低于重型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2　活動(dòng)期UC患者各型調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及

注：①與輕型活動(dòng)期UC組比較，P<0.05；②與重型活動(dòng)期UC組比較，P<0.05。

3討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種主要累及直腸的非特異性炎性疾病, 腸道局部炎性損傷是其重要病理改變,以大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)腸壁和持續(xù)活化為特征[7-8]。盡管有關(guān)炎性細(xì)胞向炎癥部位募集的具體機(jī)制尚不十分清楚,但可以肯定的炎癥細(xì)胞在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。評(píng)價(jià)潰瘍性結(jié)腸炎的活動(dòng)性和嚴(yán)重性，是制定正確治療方案和評(píng)估預(yù)后所必須。臨床上內(nèi)鏡檢查和病理活檢是評(píng)價(jià)潰瘍性結(jié)腸炎的活動(dòng)性和嚴(yán)重性的金標(biāo)準(zhǔn)，但是內(nèi)鏡檢查和病理活檢不易重復(fù)進(jìn)行，活檢具有創(chuàng)傷性。臨床迫切需要尋找新的反應(yīng)潰瘍性結(jié)腸炎的活動(dòng)性和嚴(yán)重性的標(biāo)記物。臨床上測(cè)評(píng)UC治療過程需要客觀指標(biāo)來評(píng)價(jià)病情的活動(dòng)性、嚴(yán)重性，然而目前缺乏一些簡(jiǎn)單實(shí)用、客觀敏感的評(píng)價(jià)指標(biāo)[9]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，表型為CD1d(hi)CD5+CD19+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞是一種新型具有負(fù)向調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞，其數(shù)量和功能的異?？赡苁亲陨砻庖卟“l(fā)生的重要機(jī)制[2]。目前，對(duì)Bregs抑制免疫炎癥的機(jī)制通過如下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn)：①Bregs主要通過分泌IL-10和TGF-β等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。Bregs產(chǎn)生的IL-10通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化影響疾病過程[10]， 如在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)中，可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡抑制有害免疫應(yīng)答[11]。 巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞也是IL-10是發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用的主要靶細(xì)胞，減少巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞炎癥因子的釋放,減輕炎癥反應(yīng)[12]。②Bregs通過細(xì)胞間接觸發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究表明，Bregs通過直接的MHC和B7這2條途徑，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖和活性，通過fas/fasl介導(dǎo)的凋亡機(jī)制來抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖[13-14]。③與其他調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞之間的相互作用研究表明，Bregs可與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)能數(shù)量依賴性地降低CD4+T細(xì)胞的增殖能力[15]。

本研究顯示活動(dòng)期UC患者血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及CRP含量高于緩解期UC患者和正常者;緩解期UC患者調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及CRP含量較正常組無明顯升高，活動(dòng)其UC患者CAI評(píng)分顯著高于緩解期UC患者。活動(dòng)期UC患者血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞數(shù)量和病情嚴(yán)重性一致，與病情活動(dòng)指數(shù)CAI評(píng)分呈正相關(guān)，與正常組相比，輕型活動(dòng)其UC患者CRP含量無明顯升高，而血調(diào)節(jié)性調(diào)節(jié)性B細(xì)胞數(shù)量顯著升高，提示輕型活動(dòng)期UC患者中血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞較CRP更加敏感地反映出病情嚴(yán)重性的變化。

本研究結(jié)果表明活動(dòng)期UC患者調(diào)節(jié)性B細(xì)胞變化可作為評(píng)價(jià)病情活動(dòng)性與嚴(yán)重性的良好指標(biāo)，有助于判斷臨床治療效果，評(píng)價(jià)預(yù)后。

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doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.22.018

[中圖分類號(hào)]R574.62

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)22-2447-03

[收稿日期]2015-07-15