缺氧對乳鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元外向電流的影響及其環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥苷含量變化的研究*

王艷萍，朱賀，劉歡，馬克濤，司軍強，李麗

[石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室（新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室），新疆 石河子 832000]

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論著

缺氧對乳鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元外向電流的影響及其環(huán)磷酸腺苷、環(huán)磷酸鳥苷含量變化的研究*

王艷萍，朱賀，劉歡，馬克濤，司軍強，李麗

[石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室（新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室），新疆 石河子 832000]

摘要：目的觀察缺氧時間對體外培養(yǎng)的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（SGNs）外向電流的影響及其細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量變化。方法體外原代培養(yǎng)新生1～3d SD大鼠SGNs并進(jìn)行免疫熒光鑒定。用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式觀察缺氧外液灌流SGNs時，外向電流的變化趨勢和特點。用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測缺氧5、15和20min時SGNs內(nèi)cAMP和cGMP的濃度變化。結(jié)果①酶解分離可獲得生存狀態(tài)良好的神經(jīng)元，經(jīng)免疫熒光鑒定為SGNs。②當(dāng)電壓鉗制在-60mV時，急性缺氧增強SGNs外向電流，主要增強0～+60mV電壓區(qū)間的激活電流幅度。缺氧5min時，+60mV激活電流幅度從（971.2±50.3）pA增強到（2361.0±207.4）pA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。隨后出現(xiàn)下降趨勢，11～15 min時，增強的電流幅度與對照組基礎(chǔ)電流比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。③分別檢測缺氧5、15和20min后SGNs中cAMP和cGMP的含量變化。缺氧5min組與正常對照組比較，cAMP濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。缺氧15min組與正常對照組比較，cAMP濃度變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義；缺氧20min組與正常組對照組比較，cAMP濃度水平下降（P<0.01）。cGMP濃度隨著缺氧時間的延長，總體呈下降趨勢，但在20min后有部分回升（缺氧15minvs缺氧20min，P<0.01）。結(jié)論在SGNs急性缺氧損傷過程中，外向電流增強，增強幅度隨缺氧時間變化先升后降，推測在短期缺氧時細(xì)胞通過降低興奮性，影響聽覺信息的傳導(dǎo)，且該過程與胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP濃度的改變相關(guān)。

關(guān)鍵詞：缺氧；SGNs；環(huán)磷酸腺苷；環(huán)磷酸鳥苷

聽覺障礙是指聽覺系統(tǒng)中的傳音、感音、聽神經(jīng)和/或其各級聽覺中樞發(fā)生病變，導(dǎo)致聽功能出現(xiàn)障礙，而發(fā)生不同程度的聽力下降[1]。圍生期窒息缺氧導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損害是影響新生兒聽力的高危因素[2]。耳蝸及聽覺中樞對缺氧極為敏感，當(dāng)缺氧、缺血時首先累及耳蝸組織，使耳蝸產(chǎn)生類似于腦缺氧時興奮性氨基酸受體過度激動而引起的神經(jīng)中毒。有研究表明，缺氧、缺血可造成耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞下傳入神經(jīng)樹突末梢腫脹、變性、空泡樣變[3]。另外聽覺中樞因缺氧引起損傷可壓迫血管，從而影響耳蝸的供血，造成耳蝸功能異常[4]。在感覺神經(jīng)性聽力障礙發(fā)生過程中，聽覺傳導(dǎo)通路中各級神經(jīng)元的損害是其重要因素。螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（spiral ganglion neurons，SGNs）是位于蝸軸螺旋管內(nèi)、聽覺傳導(dǎo)通路的第一級神經(jīng)元，起著將聲音的機械信號轉(zhuǎn)變成化學(xué)沖動傳送到神經(jīng)節(jié)，再由中樞軸突組成的聽覺神經(jīng)束將信號進(jìn)一步向上一級的聽覺中樞傳遞的作用。本實驗的前期研究發(fā)現(xiàn)，急性缺氧可增強SGNs的外向電流，且該電流可能主要為大電導(dǎo)鈣激活鉀(large conductance Ca2+-activated K+-channel，BKCa)電流。本實驗通過建立體外SGNs缺氧模型[5]，進(jìn)一步研究缺氧時電流的變化特點及造成電流變化的胞內(nèi)機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

選用出生1～3 d的新生Sprague Dawley乳鼠，動物標(biāo)準(zhǔn)為清潔級，雌雄不拘，新疆自治區(qū)疾病控制中心動物飼養(yǎng)科提供，許可證編號：SCXK新2003-0001。動物使用遵守醫(yī)院倫理委員會要求。

1.2主要實驗材料及儀器

達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）/F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶、Ⅰ型膠原酶、胎牛血清、青鏈霉素、B27神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑（B27 NeuroMix）購自美國Gibco公司，環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）的酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒為美國BioVison公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。Axon 700B放大器購自美國Axon公司，P-97拉制儀購自美國Sutter公司，生物電信號記錄計算機（Axoscope 10.2軟件）購自美國Axon公司。

1.3SGNs的分離與培養(yǎng)

取出生0～3 d的新生Sprague Dawley乳鼠，75%酒精浸泡消毒3～5 min，麻醉后斷頭處死，沿正中線矢狀剪開皮膚及顱骨，去除頂骨及腦組織，分離雙側(cè)顳骨，浸入預(yù)冷（4℃）的D-Hanks液（含100u/ml青霉素+100 u/ml鏈霉素）中。從耳蝸底部開始，用顯微鑷輕輕撥開蝸底還未骨化的組織，充分暴露聽泡。取出膜迷路，仔細(xì)剝除螺旋韌帶及基底膜后，將含有螺旋神經(jīng)節(jié)的蝸軸螺旋管組織迅速移入1 ml含有0.125%Ⅰ型膠原酶和0.125%胰酶的已高壓的Eppendorf離心管中。在37℃溫箱內(nèi)溫育17 min，超凈臺上用移液槍移除部分消化液上清，加入300μl種植培養(yǎng)液（90%DMEM/F12，10%胎牛血清，100 u/ml青霉素，已復(fù)溫）3min終止消化。將終止消化的細(xì)胞懸液輕輕吹打20次，放入離心機，1 000 r/min離心8min。棄上清液，加入1ml細(xì)胞種植培養(yǎng)液輕輕吹打50次制成細(xì)胞混懸液。取一小滴SGNs混懸液，用細(xì)胞計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行單位面積內(nèi)神經(jīng)元計數(shù)。以密度為1×106/ml種植在預(yù)先用0.05%多聚賴氨酸包被過爬片的6孔板中。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗時選取培養(yǎng)8 h的SGNs，此時細(xì)胞活性最好。用神經(jīng)Ⅲ類β-微管蛋白單克隆抗體（neuronal classⅢβ-tubulin，TUJ1）為特異性標(biāo)記物鑒別神經(jīng)元。

1.4急性缺氧模型制備

在室溫條件下（22～25℃）對培養(yǎng)的SGNs標(biāo)本，使用多管灌流給藥系統(tǒng)持續(xù)灌注無糖低氧的生理鹽溶液（physiological saline solution，PSS）（20%CO2和80%氮氣N2混合氣體充分飽和，pH值=6.5）5～15min。

1.5全細(xì)胞膜片鉗記錄

在室溫條件下（22～25℃）使用Axon 700B放大器進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實驗。記錄電極尖端直徑約為1μm，電極阻抗約為3～5MΩ。電極內(nèi)液成分是：氯化鉀KCl 140.0 mmol/L，二水氯化鎂MgCl2·2H2O 2.0 mmol/L，氯化鈣CaCl21.2 mmol/L，乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸10.0mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸10.0 mmol/L，以氫氧化鉀（KOH）將pH值調(diào)至7.3，滲透壓300mOsm/L。細(xì)胞外液成分：氯化鈉NaCl 137.0mmol/L，磷酸氫二鈉Na2HPO40.2mmol/L，氯化鉀KCl 5.4mmol/L，磷酸二氫鉀KH2PO40.4mmol/L，氯化鎂MgCl21.0 mmol/L，氯化鈣CaCl21.2 mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸10.0 mmol/L。通過微操縱器使記錄電極的尖端接觸到神經(jīng)元后，給予負(fù)壓形成G歐封接。補償電極電容后，給予瞬時較強負(fù)壓或者電刺激擊破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞膜片鉗記錄模式。待電流穩(wěn)定5 min后開始記錄。膜電流用5或10 kHz （3dB）低頻濾過。生物電信號通過PC計算機記錄。采樣間隔為10、20或100μs。

1.6酶聯(lián)免疫吸附法

用缺氧外液灌流培養(yǎng)細(xì)胞造成缺氧模型，在不同時間點，用胰酶消化，離心收集細(xì)胞。取適量磷酸緩沖鹽溶液重懸細(xì)胞，超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，再將細(xì)胞置入-20℃冰箱冷凍，反復(fù)3次，使細(xì)胞進(jìn)一步破碎。將標(biāo)本置于2～8℃溫度下1 500 r/min離心10 min，收集上清液備用。按照cAMP和cGMP的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，若方差齊則兩兩比較用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1　SGNs培養(yǎng)與鑒定 （×400）

2　結(jié)果

2.1SGNs培養(yǎng)與免疫熒光鑒定

大約在接種8h后耳蝸SGNs貼壁。鏡下可見形態(tài)不一的細(xì)胞，貼壁的SGNs細(xì)胞胞體多呈橢圓形，有的呈球形，邊緣清晰光滑，折光性好，周邊可見明顯光暈，胞體兩側(cè)未見突起生長。培養(yǎng)至24h后，大部分細(xì)胞長出突起，背景細(xì)胞中可見神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。但是其形態(tài)卻大不一樣，SGNs由之前的橢圓形延伸出突起，突起長度僅有胞體的1～2倍。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的突起伸出較短一些，胞體呈梭形，突起伸出后靠近胞體部分稍寬，進(jìn)而逐漸變細(xì)。另一些為成纖維細(xì)胞，胞體稍大，多呈不規(guī)則形，多邊形或者星型，且分裂速度較快，光澤度不高。TUJ1免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下可見神經(jīng)元胞體和突起均呈綠色，背景下可見少許非特異性染色，未見其他背景細(xì)胞著色（見圖1）。

2.2SGNs外向電流隨缺氧時間的變化

鉗制電壓-60 mV，隨著缺氧時間的延長，激活的SGNs外向電流先增強后逐漸減弱。其中缺氧致5min時，外向電流幅度增強最大，+60 mV電流幅度與對照組基礎(chǔ)電流比較由（971.2±50.3）pA增加到（2361.0±207.4）pA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，t= 4.430，P=0.007）。5min以后增強幅度呈下降趨勢，缺氧11～15 min，缺氧對外向電流的增強作用基本消失。+60mV電流幅度為（1024.6±232.2）pA，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，t=1.030，P= 0.350）。隨著缺氧時間的延長，SGNs外向電流逐漸增大，5min時外向電流最大。（見圖2）。

2.3酶聯(lián)免疫吸附法

使用自制灌流系統(tǒng)，將預(yù)充20%CO2和80%N2混合氣體充分飽和的PSS持續(xù)灌流培養(yǎng)的SGNs。缺氧5、15和20 min時，SGNs中cAMP的濃度分別為（278.39±0.69）、（220.37±1.05）和（174.40± 0.26）pg/ml（見表1）。缺氧5min時，SGNs內(nèi)cAMP濃度明顯升高，20min后明顯下降（見圖3）。缺氧5、15 和20 min時cGMP的濃度分別為（2.49±0.05）、（2.30±0.09）和（3.83±0.15）pmol/ml（見表2）；缺氧后SGNs內(nèi)cGMP濃度總體呈下降趨勢，20 min時，其濃度有部分回升（見圖4）。缺氧5min時，cAMP濃度出現(xiàn)增加（缺氧5 min vs對照組，t=57.533，P= 0.000），15 min時cAMP濃度與對照組水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.441，P=0.865），20min后繼續(xù)下降（缺氧20minvs對照組，t=44.584，P=0.000）。5和15 min時，cGMP濃度下降（缺氧5和15 minvs對照組，t=21.698和23.302，P=0.000），20 min時又出現(xiàn)升高現(xiàn)象（缺氧15minvs缺氧20min，t=17.816，P=0.000）。

圖2　SGNs外向電流隨缺氧時間的變化

表1　不同缺氧時間下SGNs內(nèi)cAMP濃度的變化（n=6，pg/ml±s）

表1　不同缺氧時間下SGNs內(nèi)cAMP濃度的變化（n=6，pg/ml±s）

注：方差分析F=1249.126，P=0.000；t、P值：與對照組比較

組別P值對照組　219.92±0.59缺氧5min　278.39±0.69　57.533　0.000缺氧15min　220.37±1.05　0.441　0.865缺氧20min　174.40±0.26　44.584　0.000 cAMP濃度t值

圖3　不同缺氧時間對SGNs內(nèi)cAMP濃度的影響

表2　不同缺氧時間下SGNs內(nèi)cGMP濃度的變化（n=6，pmol/ml±s）

表2　不同缺氧時間下SGNs內(nèi)cGMP濃度的變化（n=6，pmol/ml±s）

注：方差分析F=210.937，P=0.000；1）與對照組比較；2）與缺氧15min比較

組別P值對照組　5.76±0.18缺氧5min　2.49±0.03　21.6981）　0.0001）缺氧15min　2.29±0.06　23.3021）　0.0001）缺氧20min　3.83±0.09　20.6151），17.8162）　0.0001），0.0002）cGMP濃度t值

圖4　不同缺氧時間對SGNs內(nèi)cGMP濃度的影響

3　討論

在聽覺系統(tǒng)中，很多聽力喪失都與缺血、缺氧有關(guān)。新生兒缺氧，包括新生兒窒息、呼吸暫停、難產(chǎn)、持續(xù)機械通氣史等，子宮內(nèi)缺氧和分娩時間過長都會影響新生兒的聽覺器官，引起耳蝸，腦干或者皮質(zhì)可逆或不可逆的變化[6]。研究表明，缺氧是導(dǎo)致聽力障礙的一個相當(dāng)明確的危險因素[7]。本研究利用免疫熒光技術(shù)、電生理膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法等研究缺氧對耳蝸SGNs電流的影響。研究結(jié)果顯示，本實驗中分離培養(yǎng)的SGNs生長狀態(tài)良好，經(jīng)免疫熒光檢測確定為SGNs，能滿足后續(xù)實驗要求。膜片鉗實驗證實急性缺氧增加SGNs的外向電流，且該外向電流的增強作用隨缺氧時間變化而改變。胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP水平在急性缺氧過程中發(fā)生變化，cAMP的濃度隨著缺氧時間的延長，出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。cGMP濃度隨著缺氧時間的延長，總體呈下降趨勢，但在20 min后有部分回升，可能與鉀離子通道的開放有關(guān)，從離子通道方面進(jìn)一步闡釋缺氧對聽力的影響。

由于耳蝸特殊的生理結(jié)構(gòu)和位置，SGNs位于耳蝸骨螺旋板與蝸軸相接處的Rosenthal隧道中，位置較深，分離難度較大。因此，筆者選用出生后1～3d的乳鼠進(jìn)行培養(yǎng)。此時的乳鼠顳骨尚未骨化，在鏡下用顯微鑷即可從分離出的基底膜上剝離SGNs。如果大鼠>5 d，其顳骨開始部分骨化，在分離SGNs時可能會將蝸軸螺旋管遺留在蝸軸螺旋管內(nèi)，影響取材的數(shù)量[8]。所以原代培養(yǎng)耳蝸SGNs是有一定難度的。培養(yǎng)的SGNs一般4～6h即可貼壁，8 h貼壁較牢固。同時本實驗中應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的鑒定。鑒定結(jié)果表明，熒光顯色可見胞體呈圓形或者橢圓形，核著藍(lán)色且較大。本實驗成功培養(yǎng)出原代SGNs，且培養(yǎng)的神經(jīng)元能滿足后續(xù)細(xì)胞實驗的基本需要。

本研究中的電生理實驗結(jié)果顯示，急性缺氧時，外向電流發(fā)生一個時間相關(guān)性變化，缺氧5 min時，外向電流增強幅度最大，10～15 min時逐漸回降至基礎(chǔ)水平。本實驗前期研究結(jié)果初步分析該增強的電流成分可能主要是BKCa電流[9]。有研究證實，BKCa通道參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程[10]。缺氧對不同種屬、不同部位、不同種類細(xì)胞的BKCa電流影響不盡相同。在豚鼠耳蝸螺旋動脈[11]、大鼠大腦皮層神經(jīng)元[12]中缺氧增強BKCa電流，但是在小鼠前庭核神經(jīng)元[13]、大鼠頸動脈體細(xì)胞[14]及足細(xì)胞[15]中抑制BKCa電流。LIU等[16]應(yīng)用內(nèi)面向外式膜片鉗技術(shù)，證實缺氧引起B(yǎng)KCa電流變化是通過胞內(nèi)機制完成的。BKCa通道除可以被胞內(nèi)Ca2+和去極化電壓激活以外，還可以通過胞內(nèi)磷酸化調(diào)節(jié)。有研究顯示，圍產(chǎn)期缺氧可增強成年小鼠肺動脈中cAMP介導(dǎo)的BKCa通道電流[17]。另外，腺苷可以增大海馬神經(jīng)元BKCa電流幅值[18]。缺氧早期Ca2+內(nèi)流，隨著缺氧的時間增加，更多的Ca2+流向細(xì)胞內(nèi)，加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣的釋放，造成鈣離子超載[19]，一些興奮性神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生，通過與神經(jīng)元胞外G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，激活胞內(nèi)第二信使通路，進(jìn)而激活下游的蛋白激酶，使BKCa通道發(fā)生磷酸化，通道開放。

實驗結(jié)果表明，BKCa通道受細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、三磷酸鳥苷調(diào)控[20-21]。本實驗為從胞內(nèi)機制進(jìn)一步觀察和解釋SGNs外向電流變化的原因，分別檢測胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP的含量。cAMP由ATP經(jīng)腺苷酸環(huán)化酶（Adenylatecvclase，Ac）轉(zhuǎn)化而來，又在磷酸二酯酶（Phosphodiesterases，PDE）的催化下不斷水解成AMP。其含量的穩(wěn)定主要依靠Ac與PDE之間的平衡。本實驗中cAMP濃度變化的可能機制為：糖氧剝奪時，細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，Ac等迅速合成cAMP致其增高，隨后ATP耗竭，酶系統(tǒng)受抑等因素使Ac下降[22]。另一方面，由于缺氧導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，使ATP合成原料不足，影響cAMP的濃度。隨著cAMP濃度的下降，對BKCa通道的磷酸化程度降低，出現(xiàn)該電流先升后降的現(xiàn)象。有研究顯示，缺氧時間可影響神經(jīng)元鉀通道的開放頻率，進(jìn)而使神經(jīng)元的興奮性產(chǎn)生變化[11]。通道開放頻率的改變與第二信使密切相關(guān)。cAMP與其他兩種第二信使cGMP、Ca2+密切相關(guān)，其相互間錯綜復(fù)雜的關(guān)系有助于擴(kuò)大細(xì)胞內(nèi)信號通路激活路徑[23-24]。本實驗結(jié)果中，cGMP 與cAMP的濃度變化不盡相同，隨著缺氧時間的延長，先出現(xiàn)一個明顯的下降，隨后在缺氧20 min時回升，雖然cGMP也與BKCa通道的開放相關(guān)，但是其濃度變化與cAMP的濃度變化相反。有資料表明，cAMP和cGMP在細(xì)胞內(nèi)的濃度?；ハ嘞L[25]，其引起的生物學(xué)效應(yīng)也常常相反[26]。該過程是胞內(nèi)復(fù)雜的信號通路的聯(lián)系變化，需要筆者進(jìn)一步研究。但是可以推測，缺氧可以通過胞內(nèi)第二信使影響通道的開放，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的興奮性。加快細(xì)胞受損凋亡的過程，進(jìn)一步使SGNs損傷，造成永久性聽力喪失。

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（童穎丹編輯）

中圖分類號：R 764.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.003

文章編號：1005-8982（2016）13-0012-06

收稿日期：2015-11-18

*基金項目：國家自然科學(xué)基金（No：81260159、31460264、81460098、81560175）；石河子大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃優(yōu)秀青年項目（No：2013ZRKXYQ-YD20）

[通信作者]李麗，E-mail：lily7588@163.com

Effect of hypoxia on outward current and change in content of cAMP and cGMP in cochlear spiral ganglion neurons*

Yan-ping Wang，He Zhu，Huan Liu，Ke-tao Ma，Jun-qiang Si，Li Li
［Department of Physiology，Medical College of Shihezi University（the Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases），Shihezi，Xinjiang 832000，China］

Abstract:Objective To observe the effect of hypoxia time on outward current in spiral ganglion neurons （SGNs）culturedin vitroand changes in the intracellular second messenger systems.Methods SGNs of 1-3 d neonatal Sprague Dawley rats were cultivatedin vitroand identified by immunofluorescence.Whole-cell patch clamp technique was used to record the variation trends and characteristics of outward current in SGNs perfused with hypoxic external solution.The changes in concentrations of cAMP and cGMP in SGNs were detected by enzyme-linked immunosorbent assay at 5，15 and 20 min of hypoxia.Results Good neurons could be isolated by enzyme which were identified by immunofluorescence to be SGNs.Acute hypoxia mainly enhanced outward current at 0-（+60）mV with the holding potential of-60 mV.At 5 min of hypoxia，the ampli－tude of outward current was increased from（971.2±50.3）pA to（2361.0±207.4）pA at+60 mV（P＜0.01）；then tended to decline.From 11 to 15 min of hypoxia，the increasing amplitude of outward current had no significant difference from the base current in the control group（P＞0.05）.Compared with the control group，the concentration of cAMP in SGNs significantly increased in the 5-min hypoxia group（P＜0.01），but was not statistically different in the 15-min hypoxia group（P＞0.05）；however，the concentration of cAMP decreased in the 20-min hypoxia group（P＜0.01）.The concentration of cGMP was totally in a downward trend with prolonged hypoxia time，but partially went up after 20 min（15-min hypoxia group vs 20-min hypoxia group，P＜0.01）.Conclusions In the process of acute hypoxia injury in SGNs，outward current increases and the enhancing amplitude increases at first and then decreases along with hypoxia time.So we deduced the conduction of auditory information is influenced by reduced excitability in short-term hypoxia of SGNs，which is related to the change in the concentrations of intracellular second messengers cAMP and cGMP.

Keywords:acute hypoxia；SGN；cyclic adenosine monophosphate；cyclic guanosine monophosphate