miR-93、miR-191、 miR-499在顱腦損傷患者血清中的表達(dá)及其臨床意義

周小龍 宋建榮 呂新文 張鵬

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miR-93、miR-191、 miR-499在顱腦損傷患者血清中的表達(dá)及其臨床意義

周小龍 宋建榮 呂新文 張鵬

目的 探討miR-93、miR-191、miR-499在創(chuàng)傷性腦損傷患者中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR)方法檢測(cè)本院2010年9月～2015年9月收治的96例創(chuàng)傷性腦損傷患者以及招募的49例健康者中miR-93、miR-191、miR-499的表達(dá)水平，分析其與腦損傷的損傷程度、臨床療效以及診斷價(jià)值的關(guān)系。 結(jié)果 miR-93、miR-191、miR-499在創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；輕度，中度和重度三種不同程度腦損傷患者血清中miR-93、miR-191、miR-499水平都顯著性上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而且重度腦損傷患者血清中的miRNAs水平最高；治療后臨床療效好的患者血清中miR-93，miR-191，miR-499水平顯著低于臨床療效差的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； miR-93，miR-191，miR-499三種miRNAs ROC曲線(xiàn)下面積(area under the curve，AUC)分別為0.952 0(95%CI，0.906 5～0.997 4；P<0.001)，0.874 6(95%CI，0.793 3～0.955 8；P<0.001)，0.780 7(95%CI，0.671 9～0.889 5；P<0.001)。 結(jié)論 miR-93，miR-191，miR-499 在創(chuàng)傷性腦損傷患者中高表達(dá)，可以作為創(chuàng)作性腦損傷患者的預(yù)后和損傷程度指標(biāo)以及診斷靶標(biāo)。

創(chuàng)傷性腦損傷 miRNAs 診斷 預(yù)后 qRT-PCR

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)是受外部壓力導(dǎo)致腦功能減弱的一種疾病，具有很高的致死和致殘率[1]。TBI根據(jù)Glasgow coma scale (GCS)評(píng)分可分為輕度、中度和重度腦損傷三種[2]。TBI 包括異質(zhì)性損傷，可導(dǎo)致神經(jīng)功能和行為功能發(fā)生紊亂，因此很難評(píng)價(jià)相關(guān)損傷的預(yù)后和監(jiān)測(cè)相關(guān)損傷。

微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是一類(lèi)可調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)的小非編碼RNA。越來(lái)越多的證據(jù)表明許多疾病的患者血液中miRNAs 具有特異性表達(dá)模式[3]。大量研究也表明TBI后患者血清中miRNA 的表達(dá)發(fā)生改變。已有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)miR-93、miR-191、miR-499 在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷之大腦皮層以及海馬中顯著上調(diào)[4]。但是這些miRNA的表達(dá)程度在TBI患者中的表達(dá)情況、與TBI的嚴(yán)重程度、臨床治療效果以及診斷價(jià)值還沒(méi)有相關(guān)研究。

本研究旨在探討血清中miR-93、miR-191、miR-499在TBI患者中的表達(dá)水平以及與臨床治療效果的相關(guān)性，并且進(jìn)一步評(píng)價(jià)作為T(mén)BI生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集從2010年9月～2015年9月經(jīng)本院診治的創(chuàng)傷性腦損傷患者96例，所有患者都經(jīng)過(guò)本院兩名專(zhuān)家的診斷，而且經(jīng)確認(rèn)無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病史、無(wú)酗酒及濫用藥物史、無(wú)腦損傷史。平均住院時(shí)間(1.14±0.25)個(gè)月，平均年齡(48.5±16.5)歲。從本院體檢健康的人群中招募了49名身體健康者作為對(duì)照，平均年齡(46.6±8.6)歲。神經(jīng)功能狀態(tài)的損傷程度通過(guò)Glasgow coma scale(GCS)[2]評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，GCS評(píng)分為13～15分作為輕度創(chuàng)傷性腦損傷，評(píng)分為9～12分作為中度創(chuàng)傷性腦損傷，評(píng)分為3～8分作為重度創(chuàng)傷性腦損傷?；颊吲R床治療效果在損傷后9個(gè)月通過(guò)Glasgow outcome scale (GOS)評(píng)價(jià)體系進(jìn)行打分，3～5分表示治療效果好，1-2分表示治療效果差。所有參與該項(xiàng)研究的患者和健康者都簽署了知情同意書(shū)，同時(shí)本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清樣本收集

創(chuàng)傷性腦損傷患者從發(fā)生損傷到24 h內(nèi)的血清，從第1次收集完后每隔24 h收集1次，共收集21次。血液樣本樣集后立刻進(jìn)行處理。分離血清3 000 r/min,離心15 min，-80 ℃保存待測(cè)。

1.3 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitive PCR，qRT-PCR)

用1步法phenol/chloroform RNA提取試劑盒從100 μL血清中提取總RNA，Nanodrop測(cè)定總RNA的含量和濃度，所有RNA測(cè)量吸光度(A)值，保證RNA的完整性(A260/A280>2.0)?？俶RNA按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用TaqMan miRNA探針試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：1 μL cDNA (500 ng/20 μL)，0.6 μL primer (10 pmol/L)，9 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，無(wú)RNase水8.4 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃ 2 min 預(yù)熱，95 ℃ 15 s 變性，55 ℃ 30 s 退火，68 ℃ 30 s延伸，40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。miRNAs數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示，其他計(jì)量資料采用平均值±SD表示；采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各組間差異；用接受者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線(xiàn)分析評(píng)價(jià)miRNAs在創(chuàng)傷性腦損傷診斷中的價(jià)值。其中以α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中miR-93，miR-191，miR-499 表達(dá)情況

三種miRNA與對(duì)照組相比表達(dá)都顯著性升高。這三種miRNAs 在受傷后24 h之內(nèi)表達(dá)都顯著性升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.87，P<0.001；t=6.73，P<0.001；t=6.05，P<0.01)；在2～7 d，這三種miRNAs 在血清中濃度達(dá)到峰值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.54，P<0.001；t=7.86，P<0.001；t=8.45，P<0.001)；在8～14 以及15～21 d患者血清中三種miRNAs濃度下降，但與對(duì)照組相比，差異還具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 創(chuàng)傷性腦損傷后患者血清中三種miRNAs的表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，?P<0．05，??P<0．01，???P<0．001

2.2 miR-93，miR-191，miR-499表達(dá)水平與患者損傷程度的關(guān)系

如圖2所示，與對(duì)照組相比，三種不同程度腦損傷患者血清中三種miRNAs濃度都顯著性上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而且重度腦損傷患者血清中的miRNAs濃度最高，與輕度和中度腦損傷患者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 miR?93，miR?191，miR?499表達(dá)與患者損傷程度的關(guān)系 與對(duì)照組相比，?P<0．05，??P<0．01，???P<0．001；與輕度腦損傷相比，#P<0．05；與中度腦損傷相比，▽P<0．05

2.3 miR-93，miR-191，miR-499 表達(dá)水平與患者治療后臨床療效的相關(guān)性

如圖3所示，miR-93，miR-191，miR-499在A(yíng)組中濃度高于B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.62，P<0.001；t=5.39，P<0.01；t=5.25，P<0.01)。

圖3 miR?93，miR?191，miR?499表達(dá)與患者治療臨床療效的相關(guān)性 與B組相比，??P<0．01，???P<0．001

2.4 miR-93，miR-191，miR-499表達(dá)水平與其診斷價(jià)值的關(guān)系

如圖4所示，其中miR-93，miR-191，miR-499三種miRNAs ROC曲線(xiàn)下面積(area under the curve，AUC)分別為0.952 0(95%CI=0.906 5～0.997 4；P<0.001)，0.874 6(95%CI=0.793 3～0.955 8；P<0.001)，0.780 7(95%CI=0.671 9～0.889 5；P<0.001)。

圖4 創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中miR?93，miR?191andmiR?499表達(dá)水平的ROC分析

3 討 論

到目前為止，只有Redell 團(tuán)隊(duì)報(bào)道發(fā)現(xiàn)重度創(chuàng)傷性腦損傷患者血液中miRNAs 表達(dá)發(fā)生改變，其中33個(gè)表達(dá)下調(diào)，19個(gè)表達(dá)上調(diào)[5]。但是在這項(xiàng)研究中TBI 患者樣本數(shù)較少，而且miRNAs 長(zhǎng)期表達(dá)的變化也未進(jìn)行研究，特別是miRNAs 和患者臨床治療效果的關(guān)系也未進(jìn)行研究。某些miRNA miR-93，miR-191和miR-499已經(jīng)在大鼠大腦皮層以及海馬被發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。但這幾個(gè)miRNAs 在創(chuàng)傷性腦損傷患者中的表達(dá)情況還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究目的是探討miR-93，miR-191，miR-499 在TBI 患者中的表達(dá)情況以及這三個(gè)miRNAs 與患者腦損傷程度、臨床治療效果、診斷價(jià)值的關(guān)系。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中這三個(gè)miRNA顯著上調(diào)，而且在2～7 d，這三種miRNAs在血清中濃度達(dá)到峰值。另外，可通過(guò)這三個(gè)miRNAs 表達(dá)情況判斷患者腦損傷的嚴(yán)重程度。結(jié)果表明miR-93，miR-191，miR-499可作為創(chuàng)傷性腦損傷患者診斷和進(jìn)展監(jiān)控的新型標(biāo)志物以及可能參與到創(chuàng)傷性腦損傷患者病理發(fā)生過(guò)程中。

miRNAs表達(dá)失調(diào)與細(xì)胞增殖、凋亡、周期進(jìn)展、腫瘤發(fā)生等生理和病理過(guò)程有關(guān)。幾項(xiàng)研究已表明創(chuàng)傷性腦損傷后在大鼠大腦皮層、海馬以及血液中的miRNAs表達(dá)發(fā)生改變[4, 6]。Ping等[7]研究發(fā)現(xiàn)大鼠在創(chuàng)傷性腦損傷后48和72 h大腦皮層中miR-93表達(dá)上調(diào)2倍多。另外，也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)大鼠的大腦皮層和海馬在創(chuàng)傷性腦損傷后miR-191，miR-499表達(dá)上調(diào)[8]。也有越來(lái)越多證據(jù)表明血清中miRNAs主要來(lái)自于組織中，特別是受疾病影響的組織，比如腦組織等。由損傷腦組織釋放的miRNAs很可能是創(chuàng)傷性腦損傷患者血液中miRNAs差異表達(dá)的主要原因[9]。最近也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)由細(xì)胞或者組織分泌到血液中的miRNAs在細(xì)胞通訊過(guò)程中具有重要作用[10]。這些外分泌miRNAs通過(guò)微管，Ago蛋白以及高密度脂蛋白的運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞，然后由靶細(xì)胞轉(zhuǎn)化成激活形式發(fā)揮功能[11-12]。因此，本研究推斷創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中miR-93，miR-191以及miR-499持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)可能是由于患者大腦皮層或者海馬發(fā)生損傷，然后外分泌進(jìn)入到血清中。但是對(duì)該問(wèn)題很有必要進(jìn)一步深入研究。

本研究也發(fā)現(xiàn)與輕度和中度腦損傷患者相比，重度創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中的miR-93，miR-191以及miR-499存在顯著性高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且這三種miRNAs表達(dá)在臨床治療效果差的患者血清中要顯著高于臨床治療效果好的患者。因此，這三種miRNAs或許參與到創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生、進(jìn)展以及修復(fù)過(guò)程。創(chuàng)傷性腦損傷的病理復(fù)雜，與炎癥，凋亡和神經(jīng)元再生等有關(guān)。Montalban等[13]發(fā)現(xiàn)miR-93受神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素調(diào)控，靶向與神經(jīng)元相關(guān)的信號(hào)通路蛋白。另外，Brett等[14]報(bào)道發(fā)現(xiàn)miR-93與FoxO3結(jié)合，調(diào)控胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，在神經(jīng)干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。同時(shí)，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)miR-191可抑制腦源性神經(jīng)因子表達(dá)，從而抑制腦發(fā)育和大腦海馬神經(jīng)再生[15-16]。Li 等[17]報(bào)道m(xù)iR-499主要參與到細(xì)胞增殖、凋亡、周期、骨架重塑等生理過(guò)程。因此，推斷這三種miRNAs是重要的基因調(diào)空因子，在創(chuàng)傷性腦損傷后的病理以及腦修復(fù)過(guò)程中具有重要功能，但這三種miRNAs在創(chuàng)傷性腦損傷中的具體功能以及機(jī)制還需要進(jìn)一步深入的研究。

本研究有以下面幾方面的缺陷。第一方面，樣本數(shù)較小，主要是納入標(biāo)準(zhǔn)所限，體現(xiàn)在兩點(diǎn)：一是本研究所有的患者的血清樣本收集都是患者在醫(yī)院注冊(cè)完成后進(jìn)行的；二是患者的住院時(shí)間為至少1個(gè)月，因此血清樣本收集的時(shí)間截至到第21 d；第二方面，對(duì)miRNAs的變化檢測(cè)評(píng)價(jià)是一個(gè)短期而不是長(zhǎng)期過(guò)程，長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)更有利于確定miRNAs與創(chuàng)傷性腦損傷的相關(guān)性。本研究創(chuàng)傷性腦損傷患者的臨床治療效果是在損傷后9個(gè)月用GOS評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)的，而血清中miRNAs濃度的檢測(cè)是在1個(gè)月內(nèi)(21 d)，這主要是因?yàn)榛颊叱鲈汉笱鍢颖静蝗菀撰@取。盡管存在上面的一些缺陷，與其他一些僅檢測(cè)3～7 d內(nèi)患者血清中生物標(biāo)志物濃度的相關(guān)研究[18]相比，本研究已經(jīng)做了很大改善；第三方面， miR-93，miR-191以及miR-499也有可能由其他細(xì)胞和組織分泌產(chǎn)生，因此不能排除來(lái)自腦外組織釋放這三種miRNAs的可能。

總之，結(jié)果表明外傷性腦損傷患者血清中miR-93，miR-191，miR-499表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，這三個(gè)miRNA與外傷性腦損傷的嚴(yán)重程度以及患者臨床病理特征有關(guān)。所以，miRNAs在創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，而且可以作為T(mén)BI潛在的診斷與預(yù)后指標(biāo)。

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(2016-04-08收稿)

The expression and clinical significance of miR-93,miR-191,miR-499 in the serum of patients with traumatic brain injury

ZhouXiaolong,SongJianrong,LvXinwen,etal.

DepartmentofNeurosurgery,BaojiCentralHospital,Baoji721008

Objective To investigate the expression and clinical significance of miR-93, miR-191, miR-499 in the serum of patients with traumatic brain injury (TBI).Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR) was used to evaluate these miRNAs levels of TBI patients (n=96) and healthy controls (n=49), who admitted in our hospital from Sep. 2010 to Sep. 2015,and the severity and clinical outcome of TBI was further analyzed.Results The serum miR-93, miR-191, and miR-499 levels significantly elevated in the TBI patients compared with the controls and these levels were much higher in the patients with severe TBI than those with moderate or mild TBI (P<0.05);After treatment,the serum miR-93, miR-191, and miR-499 levels were lower in the patients with good outcome than those with poor outcome (p<0.05);The AUCs of miR-93, miR-191, and miR-499 were 0.952 0 (95%CI, 0.906 5-0.997 4;P<0.001), 0.874 6 (95%CI, 0.793 3-0.955 8;P<0.001), 0.780 7 (95%CI, 0.671 9-0.889 5;P<0.001), respectively,all the differences of above had statistical significance.Conclusion miR-93, miR-191, and miR-499 express distinctly in the TBI patients,can be viewed as potentially valuable indicators of the diagnosis, severity, and prognosis of TBI.

Traumatic brain injury miRNAs Diagnosis Prognosis qRT-PCR

721008 陜西省寶雞市中心醫(yī)院神經(jīng)外科[周小龍 宋建榮 呂新文 張鵬(通信作者)]

R743

A

1007-0478(2016)06-0399-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.06.004