來曲唑構(gòu)建濕熱型多囊卵巢綜合征大鼠模型及對卵巢StAR蛋白質(zhì)因子的影響

鄭慧穎，李慶端，蔡雪紅，李麗娜（.漳州市中醫(yī)院，福建 漳州 363000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065）

來曲唑構(gòu)建濕熱型多囊卵巢綜合征大鼠模型及對卵巢StAR蛋白質(zhì)因子的影響

鄭慧穎1，2，李慶端1，蔡雪紅1，李麗娜1
（1.漳州市中醫(yī)院，福建 漳州 363000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065）

目的用來曲唑構(gòu)建多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠模型，研究其對StAR蛋白質(zhì)因子的影響。方法將22只6周齡SPF級雌性SD大鼠隨機分為空白組和模型組，空白組大鼠用1%羧甲基纖維素灌胃，模型組大鼠用1 mg/kg來曲唑加1%羧甲基纖維素灌胃，連續(xù)21 d，建立來曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型，造模結(jié)束后觀察大鼠體質(zhì)量、陰道脫落細胞涂片、睪酮、空腹胰島素、卵巢HE染色、StAR免疫組化病理涂片。結(jié)果模型組大鼠體質(zhì)量增加，陰道脫落細胞涂片提示排卵障礙，睪酮升高，空腹胰島素升高，卵巢呈多囊樣改變，卵巢StAR表達活躍。結(jié)論來曲唑成功構(gòu)建了PCOS大鼠模型，StAR表達的活躍度與高雄激素血癥程度呈正相關(guān)。

來曲唑；多囊卵巢綜合征；StAR蛋白質(zhì)因子

多囊卵巢綜合征 （polycystic ovarian syndrome，PCOS）是以持續(xù)性排卵障礙、高雄激素血癥、卵巢多囊樣變和胰島素抵抗為特征的內(nèi)分泌癥候群，PCOS是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌和代謝疾病，發(fā)病原因不明，治療較為棘手，是婦科領(lǐng)域的研究熱點和難點。PCOS病因不明，至今無公認的最佳造模方法。因此，尋找一個更符合人類PCOS臨床表現(xiàn)及病理特征的動物模型至關(guān)重要。近年來中醫(yī)藥治療PCOS受到越來越多的學(xué)者認可，尋找具有中醫(yī)特色的PCOS動物模型倍受關(guān)注。P450芳香化酶抑制劑來曲唑連續(xù)灌胃21 d誘導(dǎo)PCOS大鼠模型是Kafali等［1］創(chuàng)立的，來曲唑能阻止雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致高雄激素血癥。本實驗采用來曲唑誘導(dǎo)PCOS大鼠模型，觀察來曲唑是否能構(gòu)建更符合人類PCOS的動物模型，觀察其對卵巢STAR蛋白質(zhì)因子的影響。

1材料與方法

1.1動物6周齡SD大鼠22只，SPF級，雌性，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，合格證號：2013001805081。動物飼養(yǎng)及實驗地點設(shè)在廈門大學(xué)實驗動物中心。

1.2試劑來曲唑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：15120958）；大鼠胰島素試劑盒（上海閎巨實業(yè)有限公司，批號：23029720）；血睪酮試劑盒（雅培貿(mào)易（上海）有限公司，批號：10478UP00）；StAR一抗試劑盒（美國Santa Cruz公司，批號：C0615）。

1.3儀器FZ-10002電子天平 （上海凡展衡器有限公司）；DW-40L288超低溫冰箱 （杭州碩聯(lián)儀器有限公司）；TDZ4-WS/TDZ4WS臺式低速自動平衡離心機 （湖南湘儀離心機廠）；I2000全自動化學(xué)發(fā)光儀（美國雅培公司）；7600全自動生化分析儀（日本日立公司）；BX951光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司）；HM525冷凍切片機（德國Microm公司）；電熱保溫箱（上海陽光實驗儀器有限公司）；全封閉自動脫水機（MTM，SLEE）；GHP-9270隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海賀德實驗設(shè)備有限公司）；圖像分析軟件（Image J，NIH）。

1.4來曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型構(gòu)建6周齡SPF級雌性SD大鼠22只，喂以顆粒飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。隨機分為2組：空白組11只，模型組11只?？瞻捉M大鼠用1%羧甲基纖維素灌胃，模型組大鼠用1 mg/kg來曲唑加1%羧甲基纖維素灌胃，連續(xù)灌胃21 d。

1.5檢測指標①大鼠體質(zhì)量。大鼠造模前后各稱重、記錄1次。② 陰道脫落細胞涂片。大鼠自造模第11天開始陰道開口，陰道脫落細胞涂片檢查2個性周期（1個性周期5 d），觀察各組大鼠動情周期變化。③ 血清睪酮、空腹胰島素。大鼠于抽血前1天晚20：00禁食不禁水，次日乙醚麻醉，眼眶靜脈取血2mL送檢，測血清睪酮、空腹胰島素。④ 卵巢形態(tài)學(xué)。末次灌胃結(jié)束，取血完畢，將各組大鼠頸椎脫臼處死，剖腹，摘取雙側(cè)卵巢，將大鼠的卵巢組織放入10%富爾馬林溶液中固定，脫水，石蠟包埋，制作HE染色病理片，光鏡下組織學(xué)觀察。⑤StAR蛋白檢測。制作StAR蛋白因子的免疫組化病理片，光鏡下觀察，以卵泡膜細胞的細胞膜附近棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，用Image J軟件分析相應(yīng)圖片。

2結(jié)果

2.1大鼠一般情況造模期間空白組大鼠的一般情況良好，進食狀況好，體態(tài)均勻，神態(tài)自如，精力旺盛，反應(yīng)敏捷，不易抓取，被毛光澤貼身，小便清爽，墊料干爽。模型組大鼠在造模開始后1周即出現(xiàn)飲食飲水量增加，形體較臃腫，精神萎靡，懶于活動，反應(yīng)遲鈍，被毛松散無光澤，尿色黃，墊料粘膩，清洗時墊料偶有結(jié)塊現(xiàn)象。

2.22組大鼠造模前后體質(zhì)量比較見表1。

表1　2組大鼠造模前后體質(zhì)量比較g

2.3血清睪酮、空腹胰島素見表2。造模后模型組與空白組睪酮及空腹胰島素比較有明顯差異（P＜0.01），說明來曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠睪酮顯著升高，存在高雄激素血癥。同時說明模型大鼠空腹胰島素也升高，存在胰島素抵抗。

表2　2組大鼠造模后睪酮、空腹胰島素比較

2.4陰道脫落細胞涂片觀察見圖1。

從圖1可見：① 空白組大鼠陰道脫落細胞涂片可見到周期性變化，提示有排卵。圖1-A為排卵前期，以基底層細胞為主，可見散在角化細胞，呈圓形或橢圓形，見深染的核，說明角化不完全，提示大鼠排卵即將開始。圖1-B為排卵期，大鼠動情周期為5 d，與圖1-A相隔5 d后陰道脫落細胞涂片見角化細胞滿布整個視野，基本見不到基底層細胞，角化細胞形狀不規(guī)則且見不到細胞核，說明角化完全，提示大鼠已進入排卵期。② 造模大鼠陰道脫落細胞涂片未見到周期性變化，提示無排卵。圖1-C為早卵泡期，基底層細胞滿布整個視野，可見散在的白細胞，見不到角化上皮，提示大鼠尚無優(yōu)勢卵泡發(fā)育。圖1-D為早卵泡期，大鼠動情周期為5 d，與圖1-C相隔5 d后陰道脫落細胞涂片仍未見角化上皮，提示排卵障礙。

2.5卵巢形態(tài)觀察見圖2。

圖2-A為空白組：大鼠卵巢體積較小，存在不同發(fā)育階段卵泡，可見排卵后的黃體，提示有排卵。圖2-B為造模型組：大鼠卵巢體積較大，呈多囊樣改變，無黃體，提示無排卵。

2.6StAR蛋白因子檢測見圖3。

圖3-A為空白組，卵泡膜細胞層較薄，體積較小呈梭形。圖3-B為模型組，卵泡膜細胞層增厚，體積明顯增大，呈圓球形，且卵泡膜細胞靠近細胞膜附近呈褐色深染（S-P免疫組化法將目的蛋白StAR染為深褐色），提示PCOS大鼠卵泡膜細胞增生、功能亢進，StAR數(shù)量增多，功能活躍。

2.7卵巢StAR蛋白相對表達量見表3。

表3　2組卵泡膜細胞StAR表達比較

3討論

3.1來曲唑構(gòu)建PCOS大鼠模型的理論依據(jù)卵泡膜細胞產(chǎn)生的雄激素經(jīng)過基底膜進入顆粒細胞，在顆粒細胞中FSH誘導(dǎo)P450芳香化酶活性，P450芳香化酶催化卵泡膜細胞轉(zhuǎn)運來的雄激素生成雌酮，雌酮又在17β-羥甾脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為雌二醇。芳香化酶缺乏使雄激素?zé)o法轉(zhuǎn)化為雌激素，血中雄激素水平升高。降低的雌激素對下丘腦和垂體的負反饋減弱，導(dǎo)致 Gn異常升高［2］，卵巢出現(xiàn)PCO樣變。另一方面，來曲唑在卵巢組織內(nèi)阻斷雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，引起卵泡發(fā)育微環(huán)境中雄激素積聚，雄激素在卵巢局部刺激胰島素樣生長因子等自分泌和/或旁分泌因子等的表達，改變卵泡發(fā)育微環(huán)境，促卵泡生長［3］。目前常用的芳香化酶抑制劑是來曲唑，文獻報道采用來曲唑造?？墒勾笫蟪霈F(xiàn)血清睪酮升高，胰島素抵抗，卵巢多囊樣變，大鼠病理生理特征接近人類PCOS特征，是研究該病較為理想的動物模型，且該造模方法與其它注射藥物或皮下埋埴的方法比較，對大鼠創(chuàng)傷性更小，操作更簡便［4-5］。

3.2根據(jù)PCOS鹿特丹診斷標準［6］，本實驗來曲唑造模大鼠出現(xiàn)典型的PCOS表現(xiàn)：①體質(zhì)量增加；② 排卵障礙；③ 血清睪酮升高；④ 空腹胰島素升高，提示存在胰島素抵抗；⑤ 卵巢呈多囊樣改變，說明本實驗用來曲唑成功制作了PCOS大鼠模型，屬濕熱證；⑥ 體質(zhì)量增加。朱丹溪在《格致余論》中說：“肥人濕多……”。清代章虛谷指出：“體豐者，本多痰濕。”古往今來中醫(yī)學(xué)家對肥胖的論述甚多，但始終不離痰濕內(nèi)盛的病機。病機分析：① 精神萎靡，懶于活動，反應(yīng)遲鈍。濕為陰邪，易阻遏氣機，損傷陽氣，清陽不升，神疲體倦。② 尿色黃，墊料粘膩，清洗時墊料偶有結(jié)塊現(xiàn)象。濕性粘滯、重濁、趨下，故見小便粘膩，墊料結(jié)塊，尿色黃屬熱。③ 高雄激素血癥。雄屬陽，雌屬陰，雄激素升高則陽氣亢盛，陽盛則熱，可見高雄激素血癥屬熱證。④ 胰島素抵抗。孫剛等［7］檢測了46名非痰濕體質(zhì)者和35名痰濕體質(zhì)患者的空腹胰島素、血糖、血脂，計算胰島素抵抗指數(shù)，發(fā)現(xiàn)非痰濕體質(zhì)者的上述指標明顯低于痰濕體質(zhì)患者（P＜0.05或 P＜0.01）。⑤ 卵巢多囊樣改變。夏桂成認為腎陰不足，天癸匱乏，卵子無以充養(yǎng)，發(fā)育停滯，痰濕蘊結(jié)于卵巢，使卵巢呈多囊樣改變。

3.3StAR蛋白質(zhì)因子甾體類生成快速調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenetic acute regulatory protein，StAR）。人類的StAR是由285個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，存在于產(chǎn)生甾體激素細胞的線粒體外膜上，它促進膽固醇從線粒體外膜向內(nèi)膜移動，這個重要過程建立了2層膜之間的聯(lián)系位點，允許膽固醇流向低一級的濃度梯度中。在卵泡膜細胞內(nèi)，膽固醇從線粒體外膜向甾醇相對較少的內(nèi)膜轉(zhuǎn)運，是甾體激素產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟［8］，決定了雄激素產(chǎn)生的速度和數(shù)量。本實驗的免疫組化結(jié)果顯示來曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠卵泡膜細胞的細胞膜附近StAR密度明顯升高，表達活躍。大量的StAR將更多膽固醇轉(zhuǎn)運進卵泡膜細胞線粒體去合成雄激素，從而導(dǎo)致高雄激素血癥。

3.4本實驗發(fā)現(xiàn)雄激素合成過程中的關(guān)鍵蛋白StAR在來曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠卵泡膜細胞內(nèi)高表達，雄激素合成的原料膽固醇被大量轉(zhuǎn)運入卵泡膜細胞線粒體內(nèi)去合成雄激素，同時卵泡膜細胞增生、體積明顯變大成圓球狀，提示卵泡膜細胞功能亢進，而卵泡膜細胞是合成雄激素的場所，雄激素在這里被大量合成。說明來曲唑升高雄激素的機理是通過阻礙雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化使雄激素消耗減少，還通過激素間的反饋作用及細胞旁分泌等作用使雄激素合成增加。來曲唑使雌激素生成減少，降低的雌激素對下丘腦和垂體的負反饋減弱，導(dǎo)致LH異常升高。LH受體/cAMP/蛋白激酶A（PKA）信號通路可誘導(dǎo)雄激素生物合成通路中特定基因的表達，包括StAR基因、膽固醇側(cè)鏈裂解酶基因等［9］。綜上所述，來曲唑誘導(dǎo)PCOS大鼠模型，符合人類PCOS西醫(yī)診斷標準、臨床表現(xiàn)和病理特征，符合中醫(yī)濕熱證表現(xiàn)，來曲唑成功構(gòu)建了濕熱型PCOS大鼠模型。本實驗StAR升高說明雄激素合成量增加，這一發(fā)現(xiàn)為研究PCOS治療藥物降低雄激素的機制提供了一個較新的研究指標。

［1］KAFALI H，IRIADAM M，OZARDAL I，et al.Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat：a newmodel for cystic ovarian disease［J］.Arch Med Res，2004，35（2）：103-108.

［2］WALLACE KL，JOHNSON V，SOPELAK V，et al.Clomiphene cit-rate versus letrozole：molecular analysis of the endometri-um in women with polycystic ovary syndrome［J］.FertilSteril，2011，96（4）：1051-1056.

［3］林春蓮.來曲唑促排卵的研究進展 ［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6（16）：129-132.

［4］李進，胡平，段迎春，等.兩種多囊卵巢綜合征大鼠模型比較［J］.湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2010，29（5）：413-416.

［5］李明明，潘文，康開彪.不同造模方法對大鼠多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗模型的影響［J］.西部中醫(yī)藥，2015，28（4）：11-14.

［6］郁琦.婦科內(nèi)分泌診治指南［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：93.

［7］孫剛，李曉玲.痰濁證型患者糖、脂等代謝指標檢測及其臨床意義［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1997，19（3）：60.

［8］斯特勞斯.Yen&Jaffe生殖內(nèi)分泌學(xué)［M］.5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：129-131.

［9］楊增明，孫青原，夏國良.生殖生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2005：91.

R285.5

B

1000-338X（2016）03-0024-03

2016-05-12

漳州市科技局自然科學(xué)基金資助課題（ZZ2014J24）

鄭慧穎（1980—），女，主治醫(yī)師，2013級中西醫(yī)結(jié)合婦科內(nèi)分泌專業(yè)博士研究生，主要從事中醫(yī)婦科基礎(chǔ)與臨床研究。