坡耕地-桑樹系統(tǒng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的PLFA分析

樊芳玲，謝德體,*，魏朝富，倪九派，唐振亞

1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶　400715 2 重慶市三峽庫區(qū)農(nóng)業(yè)面源污染控制工程技術(shù)研究中心，重慶　400715

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坡耕地-桑樹系統(tǒng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的PLFA分析

樊芳玲1,2，謝德體1,2,*，魏朝富1,2，倪九派1,2，唐振亞1,2

1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400715 2 重慶市三峽庫區(qū)農(nóng)業(yè)面源污染控制工程技術(shù)研究中心，重慶400715

摘要:土壤微生物群落對土壤生態(tài)環(huán)境敏感，能夠指示土壤質(zhì)量變化，決定土壤的生態(tài)功能。利用磷脂脂肪酸(PLFA)法分析了不同配置模式的坡耕地-桑樹系統(tǒng)對旱坡地紫色土土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，種植桑樹籬能顯著提高土壤Phospholipid-derived fatty acids (PLFA)含量，改善微生物群落結(jié)構(gòu)：T1處理(兩帶等高桑)土壤微生物的PLFA總量(20.54 nmol/g)顯著高于CK處理(常規(guī)農(nóng)作)；T1處理顯著提高了土壤細(xì)菌含量，T5處理(兩帶縱坡桑)土壤中真菌的豐富度相對較高。T1的多樣性指數(shù)(H′)和均勻度指數(shù)(J)最高，T2(三帶等高桑)的豐富度指數(shù)(R)最高。主成分分析表明，第一主成分(PCI)主要包括a17:0、16:1 ω5c和17:0等直鏈飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸，占PC1的58.15%；第二主成分(PC2)包括i12:0 3OH、20:1 ω9c和cy19:0 ω8c等直鏈單不飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸，占PC2的77.50%；T1與T2微生物群落結(jié)構(gòu)相似，與CK差別較大。冗余分析(RDA)表明：微生物群落結(jié)構(gòu)主要受全磷、pH、全氮、有機質(zhì)、硝態(tài)氮含量影響；全磷、全氮對支鏈飽和脂肪酸、G+、細(xì)菌等影響較大，pH對G-影響較大。相關(guān)性分析表明，徑流量與i16:0、10Me17:0、a17:0、18:3 ω6c (6,9,12)呈顯著正相關(guān)，與20:1 ω9c呈極顯著正相關(guān)；泥沙量與i16:0、i17:0呈顯著正相關(guān)，與18:3 ω6c (6,9,12)呈顯著負(fù)相關(guān)，與20:1 ω9c呈極顯著正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：土壤微生物; 磷脂脂肪酸; 紫色土; 坡耕地-桑樹系統(tǒng)

三峽庫區(qū)大部分地區(qū)處于川東褶皺地帶，地貌類型以低山丘陵為主，60%以上的土地為坡耕地，70%以上的土壤為抗蝕性較差的紫色土，森林覆蓋率低，人為破壞嚴(yán)重。氣候四季分明，降雨集中，這些生態(tài)環(huán)境條件十分易于水土流失的發(fā)生，引起土壤退化[1]。其特殊的生態(tài)環(huán)境條件、人口資源、社會經(jīng)濟狀況使農(nóng)業(yè)面源污染問題十分尖銳[2]。針對這一問題，學(xué)者們提出源頭控制、過程阻截和末端治理的解決方案[3- 5]。其中，植物籬作為一種源頭攔截技術(shù)，在降低坡面徑流及氮磷流失[6- 7]、降低化肥農(nóng)藥使用量[8]、增加作物產(chǎn)出[9]等方面均顯示出不俗的效果。同時，植物籬落葉中的營養(yǎng)元素可促進土壤微生物的生長，而且植物的根系可改善土壤質(zhì)地、增加土壤團粒結(jié)構(gòu)，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[10- 11]。

土壤微生物是土壤物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化的動力，推動著土壤有機質(zhì)的礦化分解和土壤養(yǎng)分的循環(huán)與轉(zhuǎn)化[12]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物促使土壤團聚體形成，其中真菌和放線菌等以菌絲將土壤彼此機械的纏繞在一起而形成團聚體；而另一些類群是以其生活的代謝產(chǎn)物——多糖和其它有機物對土壤顆粒的膠結(jié)作用而形成穩(wěn)定性團聚體[13]，微生物群落結(jié)構(gòu)變化將影響土壤團粒結(jié)構(gòu)、有效養(yǎng)分等理化性質(zhì)以及土壤酶活性特征，進而改變土壤質(zhì)地，影響水土流失效應(yīng)。

不同植物下的土壤微生物有不同的群落結(jié)構(gòu)，如秦紅靈等[14]利用T-RFLP和RT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，紅壤坡地土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)農(nóng)田>茶園>自然恢復(fù)，但茶園土壤細(xì)菌數(shù)量是農(nóng)田的8.76倍；薛冬等[15]采用DGGE方式研究了杭州西湖梅家塢茶園、荒地和林地的土壤微生物群落基因多樣性指數(shù)荒地>茶園>林地。用傳統(tǒng)的瓊脂培養(yǎng)法往往會低估土壤微生物的真實情況[16]，而磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA) 能夠快速準(zhǔn)確的提取并測定土壤活體微生物細(xì)胞膜的PLFA，鑒定微生物種類、識別微生物類群和測定土壤微生物量[17- 18]。因此，本文選取庫區(qū)廣泛種植的桑樹作為研究對象，旨在探討不同桑帶配置模式下坡耕地-桑樹系統(tǒng)對紫色土坡地土壤微生物群落特征，并明確微生物與環(huán)境因子、水土流失量間的相互關(guān)系，以揭示微生物在水土流失中的作用及機理，為紫色土區(qū)坡耕地的綜合利用提供有效措施及理論支撐。

1材料與方法

1.1試驗區(qū)概況

王家溝小流域位于三峽庫區(qū)腹心地區(qū)，長江北岸，地理位置位于東經(jīng)107°29′43″—107°31′1″，北緯29°53′27″—29°54′37″，行政位置在重慶市涪陵區(qū)珍溪鎮(zhèn)渠溪村二組(圖1)。該流域氣候?qū)儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，年平均氣溫22.1℃。年平均地面溫度為19.8℃，太陽輻射量年平均為337081.97J cm-1a-1，年平均降水量1130mm，夏秋兩季降雨量分配最多，占全年的66%。試驗區(qū)種植業(yè)發(fā)達(dá)，是涪陵區(qū)榨菜和桑蠶重點種植區(qū)，土壤類型為紫色土，土壤pH在5.2—8.0之間變化。

圖1　研究區(qū)試驗點位置圖Fig.1　Location of study site in Chongqing, China

1.2土壤樣品采集

試驗位于三峽庫區(qū)庫周丘陵區(qū)王家溝小流域，共設(shè)16個野外徑流小區(qū)，分為5個處理(圖2)，分別記為T1(兩帶等高桑樹+橫坡農(nóng)作，3個重復(fù))、T2(三帶等高桑樹+橫坡農(nóng)作，4個重復(fù))、T3(地埂桑+一帶等高桑樹+橫坡農(nóng)作，3個重復(fù))、T4(地埂桑+橫坡農(nóng)作，3個重復(fù))、T5(兩帶縱坡桑樹+縱坡農(nóng)作，2個重復(fù))和CK(常規(guī)農(nóng)作，無重復(fù))。徑流小區(qū)之間及小區(qū)邊界采用磚埋砌，水泥抹面而成，小區(qū)下方修筑有2m×1m的集水池。種植模式為榨菜-玉米輪作。各處理施肥量一致，每年玉米季施N為143.9kg/hm2，P2O5為94 kg/hm2，K2O為131 kg/hm2，榨菜季施N為156.8 kg/hm2，P2O5為206 kg/hm2，K2O為184 kg/hm2。

2013年5月到2014年3月試驗期內(nèi)，在徑流產(chǎn)生后，測定徑流量、泥沙量，并采集樣品用于測定徑流水與泥沙中的總氮、總磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮及正磷酸根鹽。在榨菜收獲后(2014年3月)在徑流小區(qū)的上籬、上坡、中籬、下坡、下籬5個坡位采集0—20 cm土層原狀土，每個坡位重復(fù)3點，混合后取約500 g混合土樣帶回室內(nèi)，除去土壤中植物殘體、石塊等，部分鮮土過2 mm篩后，放在-80℃冰箱保存用于測定土壤PLFA；取部分土風(fēng)干，過1mm篩后用于測定土壤有效氮磷、pH等，過0.25 mm篩后用于測定土壤全氮磷、有機質(zhì)等；同時每個采樣點附近用環(huán)刀(體積200 cm3)取0—20 cm土層原狀土，重復(fù)2點，用于測定土壤容重。

圖2　各處理桑樹布設(shè)示意圖Fig.2　Arrangement of mulberry belts of each treatment

1.3樣品測定方法

磷脂脂肪酸采用修正的Blight-Dyert方法[18]。(1)提?。悍Q取相當(dāng)于8g烘干土壤質(zhì)量的濕潤土壤3份，用進口色譜純CHCl3、CH3OH、磷緩沖液按2∶1∶0.8的比例混合浸提液在<25℃下振蕩2 h(285 r/min)后離心10 min(3500 r/min)，收集上層離心液，如此反復(fù)一次提取后加入磷緩沖液和氯仿各12 mL，于黑暗中靜置12 h，吸取下層溶液，在30—32℃水浴鍋中用氮氣吹干。(2)分離：取1000 μL CHCl3轉(zhuǎn)移濃縮的磷脂到萃取小柱，向小柱加5 mL CHCl3用于洗去中性脂，加2次5 mL丙酮用于洗去糖性脂，用1 mL甲醇清洗萃取小柱底部，收集5 mL甲醇淋洗硅膠小柱溶液，加入4 μL C19:0內(nèi)標(biāo)，在32℃水浴鍋中用氮氣吹干。(3)甲脂化：用1 mL甲醇∶甲苯混合液(體積比為1∶1)和1 mL 0.2 mol/L KOH溶解干燥的磷脂樣品，在37℃水浴中加熱15 min，加入0.3 mL 1 mol/L的醋酸溶液，2 mL正己烷，2 mL超純水，低速振蕩(120 r/min)10 min，吸取上層正己烷溶液，氮氣吹干，加入200 μL正己烷沖洗試管，將溶液吸入小柱保存。用Agilent 6850氣相色譜儀(FID檢測器)測定脂肪酸，色譜條件為：HP- 5柱(25 m×200 μm×0.33 μm)，進樣量1 μL，分流比10∶1，載氣為氫氣，尾吹氣高純氮氣，助燃?xì)饪諝猓魉?.8 mL/min，汽化室溫度250℃，檢測器溫度300℃，柱前壓10.0 psi(1psi=6.895kPa)。二階程序升高柱溫：170℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升溫至310℃，維持1.5 min。各成分脂肪酸通過MIDI Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)(Version 6.1, MIDI, Inc, Newark, DE)進行，標(biāo)準(zhǔn)品購于美國MIDI公司的C9-C20脂肪酸甲酯，PLFA用C19：0做內(nèi)標(biāo)換算絕對含量。

土壤有機質(zhì)用外加熱重鉻酸鉀容量法，全氮用半微量開式法，全磷用NaOH熔融-鉬銻抗比色法，pH用電極法測定(1∶2.5土水比)，堿解氮用堿解擴散法，有效磷用NaHCO3浸提法，有效鉀采用醋酸銨浸提法[19]。所有測定結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值，用烘干土壤質(zhì)量表示。

水總磷用過硫酸鉀氧化-鉬藍(lán)比色法，水正磷酸根鹽用鉬酸銨分光光度法，水總氮用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度計比色法，水銨態(tài)氮用靛酚藍(lán)比色法，水硝態(tài)氮用紫外分光光度計比色法。所有測定結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值。

1.4分析及數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)分析使用SPSS18.0、OriginPro 8、Canoco 5等軟件，為減小誤差，確保結(jié)果的可靠性，僅分析含量高于0.1%的脂肪酸[20]，每個小區(qū)PLFA值取各個坡位平均值進行分析。

磷脂脂肪酸含量計算公式：

式中，A和SA分別為樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積，S為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度(ng/μL)，D為稀釋倍數(shù)，R為分取倍數(shù)，V為樣品的測定體積(μL)，W為烘干土壤質(zhì)量(g)。

微生物種群的Shannon多樣性指數(shù)(H′)、Pielou均勻度指數(shù)(J)和Margalef豐富度指數(shù)(R)計算公式如下:

J=H′/lnS

R= (S-1)/lnN

式中，pi是第i種微生物的個體數(shù)占總個體數(shù)的比例，可以用Ni/N求出，Ni為第i種物種個體數(shù)，N為總個體數(shù)，S為每個樣品中的物種總數(shù)。

脂肪酸采用Frostegard方法命名[21]，分子式以“X:YωZ(c/t)”表示，其中“X”代表脂肪酸分子的碳原子總數(shù)，“Y”代表不飽和烯鍵的數(shù)目，“ω”代表烯鍵距離羧基的位置，“Z”為烯鍵或環(huán)丙烷鏈的位置。前綴“i”(iso)代表異構(gòu)甲基支鏈(距甲基端的第二個碳原子)，“a”(anteiso)代表前異構(gòu)甲基支鏈(距甲基端的第三個碳原子)，“cyc”代表環(huán)丙基支鏈，“br”表示甲基支鏈的位置未知。后綴“c”和“t”分別代表順式和反式同分異構(gòu)體，“OH”前的數(shù)字表示羥基的位置(從羧基端計數(shù)，第二個碳為α、第三個碳β)[22]。

2結(jié)果與分析

2.1坡耕地-桑樹系統(tǒng)對土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可知，種植桑樹植物籬后，T1—T5處理0—20cm土層土壤pH逐漸增大，比種植前增大2.30%—10.85%，CK則出現(xiàn)相反的趨勢，比種植前減小0.81%。T1—T5處理的土壤容重均有所減小，比種植前減小1.43%—7.16%，CK則增大0.76%。各處理土壤全氮、全磷、全鉀、有機質(zhì)均比種植前有所增加，增幅分別為8.84%—25.31%、54.55%—73.17%、17.85%—34.10%和25.20%—42.53%。T1—T5土壤堿解氮比種植前增加2.92—33.70%，CK則減少1.40%。有效磷和有效鉀的增幅分別是25.92—49.58%和4.17—60.07%。由此可見，桑樹帶種植后，植物的機械阻攔作用與落葉等生物量返給土壤致使土壤蓄積效應(yīng)提高。

表1　桑樹種植前后土壤化學(xué)性質(zhì)比較

2.2坡耕地-桑樹系統(tǒng)對土壤磷脂脂肪酸數(shù)量的影響

由圖3可知，5個處理共檢測出46種磷脂脂肪酸，其中16:0的含量最高，16:0、19:0、18:1 ω9c和i15:0的總和占脂肪酸總量的37.20%。構(gòu)成脂肪酸的主要是4種直鏈飽和脂肪酸(SFA)，絕對含量占總量的19.50%，其中16：0最多；其次是3種多不飽和脂肪酸(PFA)和2種直鏈單不飽和脂肪酸(MFA)，絕對含量占總量的21.20%，其中主要是18:1 ω9c和16:1 ω5c；支鏈飽和脂肪酸(BFA)4種，絕對含量占總量的9.17%；環(huán)丙烷脂肪酸(CFA)2種，絕對含量占總量的5.96%。

圖3　坡耕地-桑樹系統(tǒng)土壤磷脂脂肪酸的組成及絕對含量Fig.3　PLFA compositions and their amount of sloping crop-mulberry systems

由圖4所示， T1處理各種脂肪酸含量均高于其他處理，其直鏈單不飽和脂肪酸含量顯著高于CK，支鏈飽和脂肪酸含量顯著高于T2、T3和T4，環(huán)丙烷脂肪酸顯著高于T2，而直鏈飽和脂肪酸雖較其他處理高，但沒有達(dá)到顯著性水平。其余處理各脂肪酸含量之間均沒有顯著差異。

由表2可以看出，T1土壤脂肪酸總量最高，為20.54 nmol/g，顯著高于CK、T2、T3和T4，與T5沒有顯著性差異。T1、T3和T5的脂肪酸總量分別比CK增加了66.99%、6.02%和21.95%，而T2和T4則減少了1.38%和1.54%。由此可見，桑樹根系過于密集，反而不利于土壤脂肪酸累積。

關(guān)于如何修身，陸九淵心學(xué)完全采取了另一種路徑。首先他認(rèn)為天理就是“本心”，“本心”就在每一個人的內(nèi)心當(dāng)中。因此要體認(rèn)天理不用去向外求，只要向內(nèi)去“發(fā)明本心”就可以了。其次，關(guān)于修身的具體方法，陸九淵也認(rèn)為很簡單，就是“先立其大”“發(fā)明本心”“收拾精神，自作主宰”就行了?！跋攘⑵浯蟆钡摹按蟆本褪侵浮氨拘摹?。“收拾精神”就是把精神收攝向里，不要把精神花費在對外部事物的求索上面。[3]就是陸九淵認(rèn)為要修身只要在自己的內(nèi)心當(dāng)中發(fā)現(xiàn)“本心”，然后把“本心”作為自己的主宰就可以了。

2.3坡耕地-桑樹系統(tǒng)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)菌細(xì)胞膜一般含有飽和、不飽和、支鏈或直鏈脂肪酸，其中革蘭氏陰性細(xì)菌(G-)主要含有羥基、單烯和環(huán)丙烷脂肪酸，而革蘭氏陽性細(xì)菌(G+)主要含有支鏈脂肪酸[23]，偶數(shù)和多烯脂肪酸是大部分真菌細(xì)胞膜的成分[24]。由圖5可見，各處理土壤細(xì)菌含量均顯著高于真菌和放線菌的含量，是土壤微生物的主要群落形態(tài)。處理間土壤細(xì)菌(B)生物量存在顯著差異，T1最高(10.12 nmol/g)，比CK高37.31%；其次是T3和T5，比CK高9.5%和15.33%，而T2和T4比CK少54.41%和3.93%。各處理真菌(F)和放線菌(A)則沒有顯著性差異。T1土壤中代表G-、G+的脂肪酸含量顯著高于其他處理，分別比CK高出2.66和1.40倍。

圖4　坡耕地-桑樹系統(tǒng)土壤磷脂脂肪酸類型及絕對含量　Fig.4　PLFA types and their amount of sloping crop-mulberry systems

圖5　坡耕地-桑樹系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)及絕對含量　Fig.5　Microbial community structure and their amount of sloping crop-mulberry systems

由表3可知，各處理土壤G+/G-的脂肪酸含量比例為1.14—2.16，T1最低。真菌/細(xì)菌的比例可反映真菌和細(xì)菌含量的變化范圍[25]和兩個種群的相對豐富程度[26]。真菌/細(xì)菌的脂肪酸含量比例為0.11—0.18，CK最低，T5最高，說明T5處理土壤中真菌的豐富度相對較高。放線菌/細(xì)菌的脂肪酸含量比例為0.013—0.018，T1最低，T4最高。放線菌/真菌的脂肪酸含量比例為0.083—0.13，T1最低，CK最高。說明不同配置桑樹系統(tǒng)對土壤真菌和細(xì)菌的生長有不同的影響，T1處理(2帶桑)細(xì)菌絕對含量最高，但是其真菌和放線菌豐富度卻沒有四邊桑模式的T4和樹齡較大的T5高。

表2　坡耕地-桑樹系統(tǒng)土壤磷脂脂肪酸含量

數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；數(shù)據(jù)采用ducan分析法，同一行中不同字母表示差異顯著(P<0.05)

表3　坡耕地-桑樹系統(tǒng)微生物菌群比例

供試土壤的46種脂肪酸可以分成兩個主要類型(圖3)，PC1和PC2兩個主成分合計達(dá)到土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的86.85%，其余的13.15%為其他種類微生物。其中PC1主要由直鏈飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和支鏈飽和脂肪酸組成，占微生物群落結(jié)構(gòu)變異的64.71%；其中a17:0、a15:0、i15:0、18:0等9個含量較高，占第一主成分的58.15%。PC2包括直鏈單不飽和脂肪酸、環(huán)丙烷脂肪酸和支鏈飽和脂肪酸，解釋微生物群落結(jié)構(gòu)組成變異的22.14%，主要由i12:0 3OH、20:1 ω9c、i16:0、i17:0和cy19:0 ω8c等5個脂肪酸組成，占第二主成分PC2的77.50%。對不同配置模式下土壤磷脂脂肪酸的主成分分析(圖4)，結(jié)果表明各處理與第一主成分表現(xiàn)出正相關(guān)，T1和T2與第二主成分表示出正相關(guān)，其他處理與第二主成分表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)可以分成三種類型，T1與CK處于兩個極端，而T3、T4、T5土壤的因子載荷十分接近，三者幾乎重疊，從脂肪酸測定結(jié)果表明，T1和T2微生物群落結(jié)構(gòu)相似，有利于土壤微生物生長，而CK不利于微生物的積累。

圖6　坡耕地-桑樹系統(tǒng)PLFA主成分分析Fig.6　Principal component analysis of PLFAs of sloping crop-mulberry systems

圖7　處理間脂肪酸構(gòu)成分析Fig.7　Principal component analysis of structure among treatments

Shannon多樣性指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)是研究微生物多樣性的重要指標(biāo)，多樣性指數(shù)是反映群落物種及其個體數(shù)與分布均勻度的指標(biāo)，均勻度指數(shù)的變化主要通過群落中優(yōu)勢類群多度的變化來實現(xiàn)，豐富度指數(shù)的變化是通過群落中的一部分敏感或少見類群的有無來實現(xiàn)[27]。通過表4中多樣性指數(shù)(H′)、均勻度指(J)和豐富度指數(shù)(R)等指標(biāo)分析不同配置的桑樹坡耕地系統(tǒng)對土壤微生物群落多樣性的影響。多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)最高的為T1，均顯著高于CK，豐富度指數(shù)較高的是T2和T3，顯著高于CK、T1。

表4　各處理土壤微生物菌群多樣性指數(shù)

2.4微生物群落與土壤理化性質(zhì)的對應(yīng)關(guān)系

微生物群落代謝特征與周圍環(huán)境密切相關(guān)，本文對微生物磷脂脂肪酸進行趨勢對應(yīng)分析(DCA)，得到最大梯度長度為0.5，表明微生物磷脂脂肪酸對環(huán)境因子的響應(yīng)是線性的，因此，適宜選擇線性模型冗余分析(RDA)來分析理化因子對微生物分布的影響。RDA排序結(jié)果如圖8所示，軸1和軸2解釋了土壤菌落變異程度的75.42%，第一排序軸的主要影響因子為全磷(0.95)、pH(0.84)、全氮(0.76),第二排序軸的主要影響因子是有機質(zhì)(0.92)、硝態(tài)氮(0.69)。軸1與全磷、全氮、pH正相關(guān)，軸2與有機質(zhì)、銨態(tài)氮正相關(guān)。支鏈飽和脂肪酸(BFA)、G+、細(xì)菌(B)、環(huán)丙烷脂肪酸(CFA)、直鏈飽和脂肪酸(SFA)、放線菌(A)分布差異較小，多不飽和脂肪酸(PFA)、真菌(F)、單不飽和脂肪酸(MFA)分布差異較小。全磷、全氮對支鏈飽和脂肪酸(BFA)、G+、細(xì)菌(B)、環(huán)丙烷脂肪酸(CFA)、直鏈飽和脂肪酸(SFA)、放線菌(A)影響較大；pH對G-影響較大。由各環(huán)境因子的箭頭長度和與軸1和2的夾角可以看出，對微生物指標(biāo)影響最高的是全磷，其次是全氮，影響最低的是有效磷。T1微生物群落主要受全磷、全氮和pH影響；T2、T3、T4微生物群落結(jié)構(gòu)相似，主要受銨態(tài)氮、有效磷、硝態(tài)氮、有效氮、速效鉀、容重的影響；T5主要受容重的影響；CK主要受有機質(zhì)的影響。

圖8　坡耕地-桑樹系統(tǒng)微生物群落與環(huán)境因子的RDA排序圖Fig.8　RDA ordination diagram of microbial communities and environmental factors of sloping crop-mulberry systems

2.5土壤磷脂脂肪酸與水土流失量的相關(guān)性分析

由表5可知，各處理的徑流量與i16:0、10Me17:0、a17:0呈顯著正相關(guān)，與20:1 ω9c呈極顯著正相關(guān)，與18:3 ω6c (6,9,12)呈顯著性負(fù)相關(guān)；泥沙量與i16:0、i17:0呈顯著正相關(guān)，與18:3 ω6c (6,9,12)呈顯著負(fù)相關(guān)，與20:1 ω9c呈極顯著正相關(guān)；水銨態(tài)氮與a16:0呈顯著正相關(guān)；水硝態(tài)氮與10Me17:0呈顯著正相關(guān)；水有機氮與18:3 ω6c (6,9,12)呈顯著負(fù)相關(guān)，與20:1 ω9c呈極顯著正相關(guān)；水總氮與20:1 ω9c呈極顯著正相關(guān)；水總磷、水磷酸鹽與土壤磷脂脂肪酸沒有顯著性相關(guān)關(guān)系。

表5　土壤PLFA與水土流失量的相關(guān)性分析

* 在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān); ** 在0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

3討論

3.1坡耕地-桑樹系統(tǒng)改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

研究結(jié)果顯示，相比常規(guī)農(nóng)作，栽種桑樹植物籬能夠顯著提高土壤細(xì)菌的含量，增加真菌的豐度，顯著增加土壤微生物多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)，改善微生物群落結(jié)構(gòu)。如T1土壤微生物單烯脂肪酸含量最高，表明土壤有機質(zhì)含量、底物活性以及通氣狀況均好于CK[18]。T5土壤較高的支鏈脂肪酸含量說明其含有較多的好氣微生物，如放線菌和革蘭氏陽性細(xì)菌[28]。這是由于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，受土地使用歷史、植被覆蓋類型和作物栽培方式等多種因素的影響[29- 30]。本文中桑樹落葉可提供豐富的碳源，坡耕地-桑樹系統(tǒng)能顯著提高表層土壤細(xì)菌含量，分析原因，一方面是桑樹落葉中含有的氮、磷、有機質(zhì)等營養(yǎng)元素可提供微生物生長和繁殖的能源物質(zhì)，促進土壤微生物的生長；另一方面落葉中可能含有一些能夠與土壤中菌類具有協(xié)同生長作用的微生物。此外，桑樹根系可改善土壤理化性質(zhì)，刺激土壤微生物的生長。蔣婧[12]等研究發(fā)現(xiàn)植物通過其凋落物與分泌物為土壤微生物提供營養(yǎng)，土壤微生物作為分解者提供植物可吸收的營養(yǎng)元素，比如共生體菌根真菌即可使植物根與土壤真菌達(dá)到互惠。文倩等[22]研究發(fā)現(xiàn)，北方農(nóng)牧交錯帶土壤以單烯脂肪酸和支鏈脂肪酸為主，由于植物返給量和管理方式不同，草地土壤PLFA明顯高于雨養(yǎng)耕地土壤。Muhammad等[31]研究發(fā)現(xiàn)，加入不同生物炭量產(chǎn)生不同的化學(xué)變化，如增加pH值，溶解的有機碳，總碳和氮，影響了土壤微生物含量，改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

對于不同配置的坡耕地-桑樹系統(tǒng)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也有顯著性差異。多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)最高的為T1，豐富度指數(shù)較高的是T2和T3。T1的土壤的飽和與不飽和脂肪酸比例最高，主要是因為T1土壤有機物質(zhì)輸入和有機碳含量較高[32]，T5真菌/細(xì)菌比率最高、T4放線菌/細(xì)菌比例最高。造成上述差異的原因是受土壤全氮磷的供應(yīng)水平的影響，這與不同配置模式下桑樹根系的密度、有機物質(zhì)的輸入、微生物數(shù)量和種類的變異有關(guān)[24]。不同密度植物的凋落物和根系分泌物中輸入碳數(shù)的量有差異，可以顯著影響土壤微生物組成[33]。如王樹力等[34]研究顯示，4種密度幼齡階段雜種落葉松人工林中，土壤微生物生存和發(fā)展?fàn)顩r最好的密度為2500株/hm2與3300株/hm2，較好的密度為4400株/hm2，最差的密度為6600株/hm2。湛方棟等[35]研究發(fā)現(xiàn)，煙草根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性受田間管理方式(施肥方法和類型、生育期)等方面的影響，煙草植株與根際分泌物的相互作用對土壤微生物群落多樣性也起著重要作用等結(jié)果。楊瑞吉等[36]研究發(fā)現(xiàn)，不同油菜種植密度與施氮肥對麥茬復(fù)種飼料油菜耕層土壤微生物活性有顯著影響，復(fù)種油菜能顯著提高耕層土壤微生物量碳、土壤微生物量氮、土壤細(xì)菌數(shù)、土壤真菌數(shù)和土壤放線菌數(shù)。本文中土壤凋落物和根系則提供大量有機物質(zhì)，輸入土壤的有機物抗分解能力又較強，是造成真菌、放線菌豐富度高的原因，當(dāng)桑樹種植面積/小區(qū)面積為0.1左右時能夠提高土壤微生物量，但是當(dāng)桑樹布設(shè)過于密集(桑樹種植面積/小區(qū)面積超過0.3)反而不利于微生物量提高和群落結(jié)構(gòu)的改善。

3.2土壤微生物與環(huán)境因子之間的相關(guān)性分析

土壤理化性狀的改變是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要原因，有機質(zhì)、有效磷和速效鉀均對土壤微生物群落分布產(chǎn)生顯著影響，進而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤養(yǎng)分，而土壤養(yǎng)分和微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定的相關(guān)性[14]。本文中， T1微生物群落主要受全磷、全氮和pH影響；T2、T3、T4微生物群落結(jié)構(gòu)主要受有效成分的影響，主要是由于種植植物籬后，T1的全磷和pH發(fā)生變化，均高于其他處理，二者的貢獻率大于其他環(huán)境因子，且T1真菌含量最高，真菌對氮素敏感度較高，因此全氮也是影響T1的主要因素；而其他3個處理土壤在種植植物籬后，有效成分大量增加，高于其他處理，成為土壤微生物的主要影響因子。

研究結(jié)果顯示，徑流量與i16:0、10Me17:0等PLFA呈顯著正相關(guān)，泥沙量與i16:0、呈顯著正相關(guān)，而18:3 ω6c (6,9,12)與徑流量、泥沙量及徑流水中有機氮等則呈顯著負(fù)相關(guān)。i16:0、i17:0等磷脂脂肪酸是細(xì)菌，10Me17:0是放線菌的指示脂肪酸，18:3 ω6c (6,9,12)是真菌的指示脂肪酸[37]。研究認(rèn)為，微生物種類在團聚體形成中的作用大小順序是真菌最大，放線菌次之，細(xì)菌的作用最小，但由于本試驗中放線菌含量極低，僅為真菌含量的0.013—0.018，因此對土壤團聚體的影響較小。程麗娟等[38]研究發(fā)現(xiàn)，大豆根瘤菌、放線菌等均對結(jié)構(gòu)不良的黃綿土水穩(wěn)性團聚體顯示良好效應(yīng)，隨著微生物釋放的多糖含量的增加，黏粒含量相應(yīng)減少而粒級的水穩(wěn)性程度相應(yīng)提高。彭思利[13]研究表明，接種叢枝菌根真菌顯著增加了土壤團聚體的平均重量直徑和幾何平均直徑，增加了土壤水穩(wěn)性大團聚體數(shù)量，使土壤結(jié)構(gòu)特征進一步提升。土壤微生物，特別是真菌，在大團聚體的形成和穩(wěn)定性起重要作用。Bazin等[39]在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，團聚體中的砂粒明顯地僅靠菌絲聯(lián)結(jié)在一起，并證實了腐生真菌和菌根真菌的菌絲長度增加對沙土團聚的貢獻。在土壤團聚體形成的過程中，真菌菌絲體除了在大團聚體中可起到絆纏物理作用外，許多菌絲體還可通過分泌膠結(jié)物質(zhì)——多糖類物質(zhì)，使土微團聚體粘結(jié)在一起，進而被菌絲體纏繞成穩(wěn)定的大團聚體，從而提高土壤孔隙度，和吸水能力，減少徑流的產(chǎn)生。而細(xì)菌由于對土壤團聚體結(jié)構(gòu)影響較小，對保持水土的作用表現(xiàn)較弱。因此，提高真菌在土壤微生物中的比例是增加水穩(wěn)性團聚體比例，改善土壤結(jié)構(gòu)，保持水土中的重要因素。

4結(jié)論

本文中坡耕地-桑樹系統(tǒng)提高了土壤全氮磷、有機質(zhì)含量，在一定程度上增加土壤肥力。該系統(tǒng)不僅促進表層土壤微生物數(shù)量的增加，同時增大各菌群之間的比例，增大微生物多樣性指數(shù)，均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)，以間隔4.4m的兩帶等高桑樹和兩帶間隔1.2m的縱坡桑樹模式表現(xiàn)較為突出。土壤微生物與環(huán)境因子的冗余分析和相關(guān)性分析表明，土壤理化性質(zhì)與微生物的結(jié)構(gòu)組成存在一定的相關(guān)性，其中全磷、pH、全氮、有機質(zhì)是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)較大的環(huán)境因子。土壤微生物與水土保持效應(yīng)的相關(guān)性分析表明，土壤PLFA與徑流量、泥沙量有一定的相關(guān)性，徑流量與i16:0、10Me17:0、a17:0、18:3 ω6c (6,9,12)呈顯著正相關(guān)，與20:1 ω9c呈極顯著正相關(guān)；泥沙量與i16:0、i17:0呈顯著正相關(guān)，與18:3 ω6c (6,9,12)呈顯著負(fù)相關(guān)，與20:1 ω9c呈極顯著正相關(guān)。盡管PLFA技術(shù)常被用于研究土壤微生物群落功能，但該技術(shù)本身也有局限性。PLFA能定量描述環(huán)境樣品中的微生物群體，而不能在菌種和菌株的水平精確的描述環(huán)境中微生物的種類，因此，要全面解析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)還需結(jié)合其他的研究手段。

致謝：西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院李振輪老師和梁偉同學(xué)為本研究提供幫助。

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基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(41371301)；國家“十二五”水專項項目(2012ZX07104-003)；國際科技合作專項項目(2013DFG92520)

收稿日期:2014- 10- 10; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015- 10- 10

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: xdt@swu.edu.cn

DOI:10.5846/stxb201410101990

PLFA analysis showed that the configuration modes of sloping crop-mulberry systems affect the soil microbial community structure

FAN Fangling1,2, XIE Deti1,2,*, WEI Chaofu1,2, NI Jiupai1,2, TANG Zhenya1，2

1CollegeofResourcesandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China2ChongqingEngineeringResearchCenterforAgriculturalNon-pointSourcePollutionControlinThree-GorgeReservoirArea,Chongqing400715,China

Abstract：The soil microbial community is sensitive to the ecological environment, and it can indicate changes in soil quality and determine the ecological functions of the soil. Phospholipid-derived fatty acids (PLFA) analysis was used to study the response of soil microorganisms to different configuration modes of sloping crop-mulberry systems on purple soil. The results showed that planting mulberry hedges significantly increased PLFA levels and improved the soil microbial community structure, when compared with no hedge control. The total PLFA level after T1 treatment (two belts of contour mulberry) was 20.54 nmol/g, which was 66.99% higher than the control. The number of soil bacteria after T1 treatment also increased significantly. The richness of fungi after T5 treatment (two belts of vertical mulberry) was relatively higher than that after the other treatments. The diversity and evenness indexes after T1 treatment and the richness index after T2 treatment (three belts of contour mulberry) were the highest among the treatments. Principal component (PC) analysis showed that 58.2% of PC1 was composed of straight-chain saturated and polyunsaturated fatty acids of a17: 0, 16: 1 ω5c, and 17: 0, while 77.5% of PC2 was composed of monounsaturated and cyclo fatty acids of i12: 0 3OH, 20: 1 ω9c, and cy19: 0 ω8c. T1 and T2 treatments resulted in similar soil microorganisms that differed from the control. Redundancy analysis showed that the microbial community structure was mainly affected by total soil phosphorus, pH, total nitrogen, organic matter, and soil nitrate content. G+, branched saturated fatty acids, and bacteria were mainly affected by total phosphorus and total nitrogen, whereas G- was mainly influenced by soil pH. The amount of runoff was significantly and positively correlated with i16: 0, 10Me17: 0, a17: 0, and 18: 3 ω6c (6,9,12) at P<0.05 and positively correlated with 20: 1 ω9c at P<0.001. The amount of sediments had a significant and positive correlation with 18: 0, i16: 0, and i17 3 ω6c (6,9,12) at P<0.05 and with 20: 1 ω9c at P<0.001, whereas it had a significant and negative correlation with 18:3 ω6c (6,9,12) at P<0.05.

Key Words:soil microorganisms; PLFA; purple soil; sloping crop-mulberry lands

樊芳玲，謝德體，魏朝富，倪九派，唐振亞.坡耕地-桑樹系統(tǒng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的PLFA分析.生態(tài)學(xué)報,2016，36(12):3812- 3823.

Fan F L, Xie D T, Wei C F, Ni J P, Tang Z Y.PLFA analysis showed that the configuration modes of sloping crop-mulberry systems affect the soil microbial community structure.Acta Ecologica Sinica,2016，36(12):3812- 3823.