基于PRLR-JAK-STAT5信號傳導通路測定鵝催乳素的新方法

宋金委，李　輝，陳　哲，施振旦，王振勇*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，南京 210014)

?

基于PRLR-JAK-STAT5信號傳導通路測定鵝催乳素的新方法

宋金委1，李輝2，陳哲2，施振旦2，王振勇1*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，南京 210014)

摘要：旨在建立鵝催乳素(Goose prolactin，gPRL)的高靈敏度的測定方法。本研究設計出基于PRLR-JAK-STAT5信號通路的熒光素酶報告基因系統(tǒng)。首先克隆鵝PRLR基因CDS區(qū)序列，合成信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子5 (Signal transducer and activator of transcription 5，STAT5) 信號應答序列，并分別插入真核表達載體pCMV6-Entry和熒光素酶報告載體pGL3-Enhancer中，構建成為信號接收載體和信號應答載體。然后將兩載體同篩選基因載體pEZX-MR03及內(nèi)參載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，經(jīng)嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因細胞株。分別用終濃度為0、30、60、90 ng·mL-1的PRL刺激轉(zhuǎn)基因細胞，通過qRT-PCR和雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測定在不同PRL濃度下轉(zhuǎn)基因細胞株中熒光素酶(Luciferase， Luc)基因的相對表達量和相對活性的變化。篩選出10株成功整合有全部4個轉(zhuǎn)基因載體的轉(zhuǎn)基因細胞株，經(jīng)過不同濃度PRL刺激后，篩選出一株細胞，其熒光素酶基因表達量和酶活性均表現(xiàn)出隨PRL濃度升高而上調(diào)的趨勢。結果表明，建立的基于PRLR-JAK-STAT5信號傳導系統(tǒng)檢測鵝PRL生物活性的新方法是可行的，為準確測定家禽PRL奠定基礎。

關鍵詞：鵝催乳素受體；信號轉(zhuǎn)導；STAT5；熒光素酶報告基因；催乳素活性

催乳素(Prolactin，PRL)又名促乳素，因能促進鴿子嗉囊上皮增生，生成嗉囊乳而得名[1]。PRL的生理功能超過300多種，是名副其實的萬能激素。PRL對禽類的繁殖活動具有重要的調(diào)控作用，對于季節(jié)性繁殖的禽類，PRL的季節(jié)性分泌可調(diào)節(jié)禽類對光照敏感性的變化，PRL分泌上升造成光鈍化效應抑制繁殖活動，使禽類進入季節(jié)性非繁殖狀態(tài)，反之則進入繁殖狀態(tài)[2]。研究表明，雌禽產(chǎn)蛋可促進腦垂體分泌高濃度的PRL，從而促進和維持就巢行為[3]，同時抑制垂體促性腺激素的分泌[4]，使禽類的卵巢萎縮及功能下降，終止排卵和產(chǎn)蛋，最終引起繁殖力下降[5]。而中低濃度的PRL則表現(xiàn)出促進禽類的卵泡發(fā)育和產(chǎn)蛋性能[6-8]以及促進雄禽睪丸發(fā)育[9]的作用。因此PRL對禽類繁殖活動的調(diào)控表現(xiàn)出依分泌水平或血液濃度而異的復雜機制，在禽類繁殖調(diào)控中具有重要作用。尤其近年探索鵝反季節(jié)繁育技術取得較大進展，鵝PRL濃度水平在反季節(jié)繁育過程中對鵝不同繁殖階段起到一定的指示作用[10-11]，準確測定鵝PRL濃度可為鵝反季節(jié)繁育技術的深入研究提供幫助，因此，進行PRL的檢測，在禽類繁育調(diào)控研究中具有重要意義。

PRL的檢測方法主要包括免疫測定和生物學測定法兩種。其中免疫測定法包括放射免疫法(RIA)、放射受體法(RRA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、化學免疫發(fā)光法(CIA)等。在當前多數(shù)檢測禽類PRL的相關文獻中均采用放免法，即利用天然PRL及其抗體或用重組PRL蛋白制備抗體進行放免分析。但是該方法缺點十分明顯，主要表現(xiàn)在同位素衰變導致標記有效期短、損害試驗人員健康和污染環(huán)境等方面[12]，故目前應用有下降的趨勢。而且放免法測定的是蛋白的免疫活性，而非生物活性，由于具有免疫活性的蛋白不一定具有生物活性，而在生物體內(nèi)只有具有生物活性的蛋白才能發(fā)揮生理作用，因此放免法測定的蛋白濃度并不等同于生物體內(nèi)有效蛋白濃度。本研究設計了基于PRLR-JAK-STAT5信號通路測定鵝PRL的方法，為開發(fā)針對鵝及禽類PRL蛋白的生物活性檢測方法奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

Trizol試劑、Lipo fectamine LTX、Opti-MEM購自Invitrogen公司。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司。人胚腎細胞HEK293T購自凱基生物。pGL3-Enhancer、pRL-TK載體、雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。雞PRL標準品購自美國農(nóng)業(yè)部。 篩選基因載體pEZX-MR03和pCMV6-Entry本實驗室保存。PremixTaq酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T、感受態(tài)細菌E.coliDH5α、內(nèi)切酶、瓊脂糖回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自寶生物(大連)有限公司。中提去內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒購自Axygen公司?；蚪MDNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。嘌呤霉素購自MPbio公司。FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)購自Roche公司。胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液(100X) (Penicillin-Streptomycin Solution)雙抗購自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1鵝PRLR基因的克隆及表達載體的構建屠宰性成熟的健康揚州鵝，取卵巢組織，裝入無菌凍存管液氮速凍后，于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank收錄的鵝PRLR基因序列(Gene ID：DQ209271.2)，采用Oligo 6.0 軟件設計鵝PRLR基因CDS區(qū)序列引物，并在上下游引物的5′端引入Hind III和XhoI酶切位點(表1)。Trizol法提取鵝卵巢總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性，并用Nanodrop2000(Thermo)紫外可見光分光光度計測定總RNA純度和濃度。以提取的總RNA為模板，用全式金Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。 以cDNA為模板進行PCR擴增獲得PRLR的CDS區(qū)，經(jīng)測序驗證后，雙酶切凝膠純化回收并定向克隆到真核表達載體pCMV6-Entry的Hind Ⅲ和XhoI位點，構建成pCMV6-PRLR-Entry表達載體，利用雙酶切和測序驗證所構建載體的準確性。

1.2.2重組STAT5雙熒光素酶報告載體的構建根據(jù)已知的STAT5結合序列：AGATTTCTAGGAATTCAATCC，人工合成5個串聯(lián)STAT5結合序列并定向克隆到pGL3-Enhancer的KpnⅠ和XhoⅠ位點中，構建成pGL3-(STAT5)5-Enhancer載體，利用雙酶切和測序驗證所構建載體的準確性。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)基因細胞的篩選和驗證將復蘇并傳代的293T細胞接種于6 孔板中，在含10%胎牛血清1%雙抗的 DMEM中培養(yǎng)，當細胞生長至匯合率 60%～70%時，換培養(yǎng)基為DMEM，將去內(nèi)毒素提取且線性化的pCMV6-PRLR-Entry、pGL3-(STAT5)5-Enhancer、pEZX-MR03和pRL-TK，采用脂質(zhì)體Lipo fectamine LTX 轉(zhuǎn)染細胞，6 h后換含10%胎牛血清1%雙抗的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞狀態(tài)恢復后采用嘌呤霉素篩選，篩選過程：首先采用終濃度為1 μg·mL-1的嘌呤霉素進行高壓篩選，6 d后，更換終濃度為0.5 μg·mL-1嘌呤霉素進行維持篩選。篩選16 d后，出現(xiàn)細胞克隆，待克隆長大后，在熒光顯微鏡下觀察，然后采用濾紙胰酶消化方法挑取EGFP陽性克隆。將所挑取的細胞克隆擴大培養(yǎng)后凍存?zhèn)溆?。根?jù)Luc基因序列、人β-actin基因序列和克隆得到的鵝PRLR基因序列，設計檢測引物(表1)。將得到的單克隆細胞株分別提基因組DNA，用基因組DNA為模板，用PRLR、Luc的引物分別進行PCR驗證，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細胞株。

表1　引物序列

1.2.4實時熒光定量PCR測定單克隆細胞株中鵝Luc基因的相對表達量復蘇挑取的轉(zhuǎn)基因細胞株于6孔板中，在含10%胎牛血清的 DMEM 中培養(yǎng)，當細胞生長至匯合率 70%～80%時，加入不同濃度的PRL，濃度梯度為0、30、60 ng·mL-1。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集細胞提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參基因，以Luc和鵝PRLR引物用PremixTaq酶分別進行普通PCR檢測鵝PRLR和Luc的表達。同時采用ABI7500進行實時熒光定量PCR測定Luc的相對表達量，采用2-△△Ct分析方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5熒光素酶的活性測定復蘇挑取的轉(zhuǎn)基因細胞株于 6 孔板中，在含10%胎牛血清的 DMEM 中培養(yǎng)，當細胞生長至匯合率 70%～80%時，加入不同濃度的PRL，濃度梯度為0、30、60和90 ng·mL-1。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，收集細胞，每孔加入 20 μL收集細胞裂解緩沖液，室溫搖晃 15 min 后，吹打細胞，收集裂解液至 96 孔白板，加入 100 μL熒光素酶分析劑(LARⅡ)，放置發(fā)光檢測儀Glomax(Promega)中，測定螢火蟲(Firefly)熒光素酶活性。加入100 μL Stop &Glo Reagent，測定海腎(Renilla)熒光素酶活性。計算熒光素酶相對活性。發(fā)光儀程序設置：延遲 2 s，測定時間5 s。制定熒光素酶相對活性隨PRL濃度變化量。

2結果

2.1pCMV6-PRLR-Entry和pGL3-(STAT5)5-Enhancer載體的構建

PCR獲得了2 498 bp的鵝PRLR的CDS區(qū)(圖1A)。經(jīng)測序驗證后，將該片段定向克隆到真核表達載體pCMV6-Entry中的HindⅢ和XhoⅠ位點，并進行雙酶切和測序驗證結果證明所構建的載體是正確的，表達載體示意圖如圖1B。將人工合成的(STAT5)5序列克隆到pGL3-Enhancer中的KpnⅠ和Xhod Ⅰ位點，載體示意圖如圖1C，并且通過測序驗證證明所構建的載體是正確的。

M.DL5000 DNA marker；1，2.PRLR DNAA.PCR獲得2 498 bp的鵝PRLR的CDS片段電泳圖；B.利用Hind Ⅲ和Xho I酶切位點將PRLR定向克隆到真核表達載體pCMV6-Entry；C.利用KpnⅠ和Xho I酶切位點將(STAT5)5定向克隆到真核表達載體pGL3-EnhancerA.The sequence of CDS 2 498 bp region goose PRLR gene obtained by PCR；B.PRLR gene was eukaryotic expression cloned into the pCMV6-Entry vector by Hind III and Xho I restriction sites；C.(STAT5)5 was eukaryotic expression cloned into the pGL3-Enhancer vector by KpnⅠand Xho I restriction sites圖1　pCMV6-PRLR-Entry和pGL3-(STAT5)5-Enhancer重組載體的示意圖Fig.1　The schematic maps of the recombinant vectors pCMV6-PRLR-Entry and pGL3-(STAT5)5-Enhancer

2.2轉(zhuǎn)基因細胞的制備與鑒定

將線性化的去內(nèi)毒素pCMV6-PRLR-Entry Vector，pGL3-(STAT5)5-Enhancer，pEZX-MR03和pRL-TK轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后獲得細胞單克隆，挑取后單克隆細胞株，在熒光顯微鏡488 nm波長激發(fā)下可觀察到EGFP的表達(圖2a)，白光對照如圖2b。

分別用PRLR和Luc的引物對單克隆細胞株基因組DNA進行PCR擴增，近200個單克隆細胞株中篩選獲得10株PRLR和Luc都穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株(圖2c，2d)。

2.3轉(zhuǎn)基因細胞對PRL應答的檢測

對經(jīng)PRL刺激后的轉(zhuǎn)基因細胞株進行普通PCR，檢測鵝PRLR和Luc的表達(圖3a)，可看出PRLR和Luc均有表達。同時采用ABI7500進行實時熒光定量PCR測定Luc的相對表達量(圖3b)，Luc相對表達量隨著PRL濃度的上升而上升。

2.4Luc相對活性隨PRL濃度變化的標準曲線

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染基因的單克隆細胞株中，分別加PRL至終濃度分別為0、30、60、90 ng·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，測定Luc相對活性，制定Luc相對活性隨PRL濃度變化的標準曲線(圖4)。

3討論

PRL是動物生殖過程中的重要調(diào)控激素，其功能的發(fā)揮同其它激素一樣，只有通過其受體PRLR介導才能激活信號通路，并將信號傳遞至下游靶基因而發(fā)揮作用。PRLR是一種單鏈跨膜蛋白受體，屬于細胞因子受體超家族，并且在多個組織中廣泛表達。PRLR分子量介于34 000～37 000，由胞外域(Extracellular domain，ECD)、跨膜域(Transmembrane domain，TMD)和胞內(nèi)域(Intracellular Domain，ICD)組成[13]。胞內(nèi)域含有兩個相當保守的區(qū)域box1和box2，近膜端的box1由脯氨酸和疏水氨基酸殘基富集的8個氨基酸殘基組成，由于脯氨酸特有的結構特征，box1內(nèi)保守的P-x-P基序形成特異的結構而被轉(zhuǎn)導分子所識別[14]，box1主要參與與JAK2 ( Just another kinase 2 或janus kinase 2 )的結合以及JAK2的磷酸化。胞內(nèi)域中存在著對信號傳導至關重要的JAK ( Just another kinase 或janus kinase ) 家族。該家族是一種非受體型酪氨酸激酶，家族中不同成員參與不同類型的細胞因子信號傳導；STAT(Signal transducers and activators of transcription，信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子) 家族是在研究干擾素對基因表達的調(diào)控中被認識的，是一種DNA 結合蛋白[15]。JAK-STAT途徑是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條細胞因子信號轉(zhuǎn)導途徑，廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過程，是眾多細胞因子信號轉(zhuǎn)導的重要途徑[16]。

M.DL500 DNA marker；1～23.不同單克隆細胞株基因組DNA；24.陽性對照。a.HEK 293T單克隆細胞株綠色熒光圖片(10×20)；b.HEK 293T單克隆細胞株白光圖片(10×20)；c.單克隆細胞株基因組DNA用PRLR驗證引物進行PCR的結果電泳圖；d.單克隆細胞株基因組DNA用Luc驗證引物進行PCR的結果電泳圖M.DL500 DNA marker；1-23.The genomic DNA of monoclonal cell lines；24.Positive control.a.The image of HEK 293T cell clones with green fluorescence (10×20)；b.The image of HEK 293T cell clones with white light (10×20)；c.The results of PCR of the genomic DNA of monoclonal cell lines with the PRLR gene verificating primer；d.The results of PCR of the genomic DNA of monoclonal cell lines with the luciferase gene verificating primer圖2　轉(zhuǎn)基因細胞鑒定Fig.2　The schematic diagram of identification of transgenic cell

M.DL500 DNA marker；1～3.0 ng·mL-1PRL時β-actin、PRLR和Luc表達；4～6.30 ng·mL-1PRL時β-actin、PRLR和Luc表達；7～9.60 ng·mL-1PRL時β-actin、PRLR和Luc表達。a.普通PCR檢測鵝PRLR和Luc的表達電泳圖；b.Luc相對表達量隨PRL濃度變化圖M.DL500 DNA marker；1-3.The expression of β-actin，PRLR and Luc when the PRL is 0 ng·mL-1；4-6.The expression of β-actin，PRLR and Luc when the PRL is 30 ng·mL-1；7-9.The expression of β-actin，PRLR and Luc when the PRL is 60 ng·mL-1.a.The electrophoresis chart of expression of luciferase and PRLR detected by common PCR；b.The graph of relative expression of Luc with the change of PRL concentration圖3　轉(zhuǎn)基因細胞Luc基因的表達檢測Fig.3　The expression detection of luciferase gene in the transgenic cell

圖4　Luc相對活性隨PRL濃度變化的標準曲線Fig.4　The standard curve of relative activity of Luc with PRL concentration

PRL分子含有兩個結合位點，PRL分子的結合位點1先與細胞表面受體的ECD結合后形成激素受體二聚體，激素受體二聚體的形成是結合位點2與第2個PRLR ECD結合的先決條件，最后形成一個激素結合兩個受體分子的三聚體，三聚體激活受體胞內(nèi)域的JAK2的活化，活化的JAK2募集并磷酸化STAT5 的特異性酪氨酸殘基，隨即磷酸化的STAT5形成二聚體，然后通過核孔進入細胞核內(nèi)，結合到靶基因啟動子的特異性的γ-干擾素激活位點序列(GAS)(TTCNNNGAA)并啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]。

基于上述的PRL信號傳導系統(tǒng)，開發(fā)成一種新型高靈敏度的檢測鵝及禽類PRL生物活性的方法。目前有一些蛋白生物活性檢測方法也是應用JAK-STAT途徑產(chǎn)生并傳導細胞內(nèi)信號，可準確快速測定蛋白生物活性，特別是測定瘦素(Leptin)生物活性[18-22]。本試驗首先克隆全長為2 498 bp的鵝PRL受體基因，將其插入真核表達載體pCMV6-Entry中，作為信號接受系統(tǒng)。然后根據(jù)GAS序列，人工合成STAT5的結合序列，為了提高應答效率，將STAT5序列連續(xù)重復5次后合成，并插入含有螢火蟲熒光素酶基因的pGL3-Enchancer中，作為信號應答系統(tǒng)。STAT5廣泛存在于各個組織和細胞中[17]，故利用HEK293T細胞作為宿主構建檢測模型。HEK293T 細胞自身含有Neo抗性基因，本研究選擇含有EGFP標記基因和嘌呤霉素抗性基因的pEZX-MR03質(zhì)粒與所構建的載體進行共轉(zhuǎn)染，利用EGFP和嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)基因細胞株。篩選出的轉(zhuǎn)基因細胞經(jīng)PRL刺激后，通過實時熒光定量PCR測定Luc基因的相對表達量。結果發(fā)現(xiàn)，本試驗構建的測定方法確實使Luc基因的相對表達量隨PRL濃度上升明顯上調(diào)，而對照組熒光素酶活性隨PRL濃度上升幾乎無變化，證明基于PRLR-JAK-STAT5信號傳導構建的檢測系統(tǒng)能夠用于靈敏的反映鵝PRL濃度變化。在目前試驗的測定范圍，熒光素酶相對活性隨PRL濃度變化呈現(xiàn)線性相關的趨勢，證明該檢測系統(tǒng)能夠用于定量的檢測鵝PRL濃度水平，并且本系統(tǒng)檢測的是具有生物活性的PRL蛋白，能夠真實反映鵝體內(nèi)PRL有效蛋白濃度。本檢測系統(tǒng)在加入PRL 6 h后即可直接檢測激素生物活性水平，與目前檢測禽類PRL采用的放免法相比，節(jié)省了測定的前處理過程，更加快速，也更加安全環(huán)保。將進一步摸索擴大本測定方法的測定范圍，完善測定標準曲線，進一步改進和改良測定方法，為實際的科研應用奠定基礎。

4結論

本研究建立了測定鵝血清中催乳素濃度的蛋白生物活性檢測方法，并篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功的單克隆細胞株，為鵝PRL準確測定奠定基礎，同時也為其他蛋白激素的測定提供參考。

參考文獻(References)：

[1]王鋒.動物繁殖學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2012：53-54.

WANG F.Animal reproduction science[M].Beijing：China Agricultural University Press，2012：53-54.(in Chinese)

[2]李靜，滕衛(wèi)平.催乳素的免疫調(diào)節(jié)作用[J].國外醫(yī)學內(nèi)分泌學分冊，2000，20(2)：99-101.

LI J，TENG W P.Immune regulation of prolactin[J].ForeignMedicalSciencesEndocrineSection，2000，20(2)：99-101.(in Chinese)

[3]施振旦，陳峰，畢英佐.禽類就巢發(fā)生和調(diào)控研究進展[J].黑龍江動物繁殖，2000，8(3)：37-41.

SHI Z D，CHEN F，BI Y Z.Research on regulation of poultry seasonal reproduction[J].HeilongjiangJournalofAnimalReproduction，2000，8(3)：37-41.(in Chinese)

[4]劉穎，施振旦，黃運茂，等.雞催乳素和抑制素-α亞基重組蛋白的構建及表達[J].中國獸醫(yī)學報，2002，22(4)：365-367.

LIU Y，SHI Z D，HUANG Y M，et al.Construction and expression of recombinant proteins based on chicken prolactin and inhibin α subunit fragment[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2002，22(4)：365-367.(in Chinese)

[5]楊海明.揚州鵝繁殖的光照調(diào)控及下丘腦基因差異表達研究[D].揚州：揚州大學，2014.

YANG H M.Study on light regulation and differential expression of genes in hypothalamus during Yangzhou geese reproductive cycle[D].Yangzhou：Yangzhou University，2014.(in Chinese)

[6]黃運茂，施振旦.廣東地方鵝產(chǎn)蛋—就巢周期調(diào)控模式的探討[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007(7)：57-58.

HUANG Y M，SHI Z D.Study on the regulation pattern of Guangdong local goose seasonal reproduction[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine，2007(7)：57-58.(in Chinese)

[7]施振旦，朱基美，黃運茂，等.調(diào)節(jié)馬崗鵝繁殖特性的初步結果和結論[J].中國草食動物，2001，3(1)：12-15.SHI Z D，ZHU J M，HUANG Y M，et al.Preliminary results and conclusions of the regulation of the reproductive characteristics of Magang goose[J].ChinaHerbivores，2001，3(1)：12-15.(in Chinese)

[8]施振旦，黃祖漢.家雞催乳素放射免疫測定法的建立[J].核農(nóng)學報，2000，14(1)：36-39.

SHI Z D，HUANG Z H.Using micro-quantity of chloraminet in chicken prolactin labelling and radioimmunoassay[J].ActaAgriculturaeNucleataeSinica，2000，14(1)：36-39.(in Chinese)

[9]DAWSON A，SHARP P J.The role of prolactin in the development of reproductive photorefractoriness and postnuptial molt in the European starling (Sturnusvulgaris)[J].Endocrinology，1998，139(2)：485-490.

[10]SHI Z D，HUANG Y M，LIU Z，et al.Seasonal and photoperiodic regulation of secretion of hormones associated with reproduction in Magang goose ganders[J].DomestAnimEndocrinol， 2007，32(3)：190-200.

[11]HUANG Y M，SHI Z D，LIU Z，et al.Endocrine regulations of reproductive seasonality，follicular development and incubation in Magang geese[J].AnimReprodSci，2008，104(2-4)：344-358.

[12]郭日紅.鵝催乳素ELISA分析方法的建立[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學，2013.

GUO R H.Devlopment of enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA) for measuring goose prolactin[D].Guangzhou：South China Agriculture University，2013.(in Chinese)

[13]YAMASHITA S，TAKAYANAGI A，SHINIZU N.Temporal and cell-type specific expression of c-fos and c-jun protooncogenes in the mouse uterus after estrogen stimulation[J].Endocrinology，1996，137(12)：5468-5475.

[14]GOFFIN V，F(xiàn)ERRAG F，KELLY P A.Chapter 1 Molecular aspects of prolactin and growth hormone receptors[J].AdvMolCellEndocrinol，1998，2：1-33.[15]周永明，田勝利，周韶虹，等.骨髓增生異常綜合征患者JAK2和STAT5基因表達的變化[J].臨床血液學雜志，2007，20(2)：70-72.

ZHOU Y M，TIAN S L，ZHOU S H，et al.The comparative study on JAK2/STAT5 signal transduction pathway in myelodysplastic syndrome[J].JournalofClinicalHematology，2007，20(2)：70-72.(in Chinese)

[16]孫勝利.腦缺血和細胞缺氧/復氧過程中JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導相關基因的表達[D].上海：第二軍醫(yī)大學，2006.

SUN S L.JAK/STAT-related gene expression during transient focal cerebral ischemia/reperfusion and during cell hypoxia/reoxygenation[D].Shanghai：Second Military Medical University，2006.(in Chinese)

[17]SCHINDLER C，DARNELL J E.Transcriptional responses to polypeptide ligands：the JAK-STAT pathway[J].AnnuRevBiochem，1995，64：621-651.

[18]ADACHI H，TAKEMOTO Y，BUNGO T，et al.Chicken leptin receptor is functional in activating JAK-STAT pathwayinvitro[J].JEndocrinol，2008，197(2)：335-342.

[19]ROSENBLUM C I，TOTA M，CULLY D，et al.Functional STAT 1 and 3 signaling by the leptin receptor (OB-R)；reduced expression of the rat fatty leptin receptor in transfected cells[J].Endocrinology，1996，137(11)：5178-5181.

[20]ROSENBLUM C I，VONGS A，TOTA M R，et al.A rapid，quantitative functional assay for measuring leptin[J].MolCellEndocrinol，1998，143(1-2)：117-123.[21]HEN G，YOSEFI S，RONIN A，et al.Monitoring leptin activity using the chicken leptin receptor[J].JEndocrinol，2008，197(2)：325-333.

[22]OHKUBO T，HIROTA K，MURASE D，et al.Avian blood induced intranuclear translocation of STAT3 via the chicken leptin receptor[J].CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol， 2014，174：9-14.

(編輯程金華)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.011

收稿日期：2016-01-07

基金項目：國家自然科學基金項目(31372314)；江蘇省自然科學基金(BK20130718)

作者簡介：宋金委(1989-)，女，滿族，河北青縣人，碩士生，主要從事禽類品種改良和繁育研究，E-mail:915352256@qq.com *通信作者：王振勇，博士，副教授，E-mail: wzy@sdau.edu.cn

中圖分類號：S835.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1389-07

A Novel Method of Detecting Goose Prolactin Based on PRLR-JAK-STAT5 Signal Transduction Pathway

SONG Jin-wei1，LI Hui2，CHEN Zhe2，SHI Zhen-dan2，WANG Zhen-yong1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China；2.InstituteofAnimalScience，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China)

Abstract:In order to develop a high sensitive method of detecting goose prolactin，luciferase detecting system based on PRLR-JAK-STAT5 signal transduction pathway was designed in the present study.Firstly the CDS region of goose PRLR gene was cloned，the signal transducer and activator of transcription 5(STAT5) was artificially synthesized and inserted into the eukaryotic expression vector pCMV6-Entry and luciferase reporter pGL3-Enhancer plasmid as signal receiver vector and signal responder vector respectively.Secondly，the two recombinant vectors along with puromycin screening vector pEZX-MR03 and internal control pRL-TK vector were transfected into HEK293T cells.After puromycin screening，stable transgenic cell lines were isolated and stimulated by a serial of different concentrations of chicken PRL (0，30，60，90 ng·mL-1).Finally the mRNA relative expression level and enzyme activity of luciferase enzyme were detected by qRT-PCR and dual-luciferase detection system.Results showed that 10 stable transgene cell lines carried the 4 vectors were isolated.After treated with different concentrations of chicken PRL，luciferase gene mRNA expression level was up regulated and luciferase enzyme activity also enhanced in dose dependent manner in one of these 10 cell lines.These results demonstrated that it was feasible of detecting PRL bioactivity using the constructed PRLR-JAK-STAT5 signal transduction system and could be further used in measuring poultry PRL concentrations.

Key words:goose prolactin receptor；signal transduction；signal transducer and activator of transcription 5；luciferase reporter gene；prolactin bioactivity