雛雞免疫器官中chMDA5的表達(dá)與定位

欒亞男，葛　銘，李廣興，謝婉秋，楊貴君，張瑞莉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

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雛雞免疫器官中chMDA5的表達(dá)與定位

欒亞男，葛銘，李廣興，謝婉秋，楊貴君，張瑞莉*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

摘要：為研究雞模式識(shí)別受體MDA5(chMDA5)在雛雞免疫器官中的表達(dá)與定位，分別于1、7、14、21、28、31、35、42、45、49日齡時(shí)從50只健康海蘭白蛋雞中隨機(jī)選取5只，采取法氏囊、胸腺及脾，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot及間接免疫熒光技術(shù)檢測雛雞免疫器官中chMDA5的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各日齡雛雞法氏囊、胸腺及脾內(nèi)均檢測到chMDA5轉(zhuǎn)錄；在法氏囊淋巴濾泡的皮質(zhì)、胸腺小葉的皮質(zhì)和髓質(zhì)及脾的白髓和紅髓部位均檢測到chMDA5陽性細(xì)胞；法氏囊和胸腺組織中chMDA5蛋白的表達(dá)規(guī)律較為一致，即在1～7日齡呈上升趨勢并在7日齡達(dá)到峰值，隨后下調(diào)，在14～35日齡時(shí)呈波動(dòng)變化，之后逐漸上調(diào)并趨于穩(wěn)定；脾中chMDA5蛋白表達(dá)以14 d左右為一個(gè)周期變化，隨著日齡增大其表達(dá)量在總體上趨于上調(diào)。結(jié)果表明，chMDA5在雛雞免疫器官中均有表達(dá)，且不同日齡之間的表達(dá)存在差異。本研究為進(jìn)一步探究chMDA5與雛雞免疫功能相關(guān)性提供了科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：chMDA5；雛雞；免疫器官；表達(dá)；定位

先天免疫是動(dòng)物機(jī)體針對病原體入侵的第一道防線，并參與適應(yīng)性免疫的激活[1]。病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecule patterns，PAMP)會(huì)被機(jī)體的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別，從而啟動(dòng)機(jī)體的先天免疫應(yīng)答，如通過分泌Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)等細(xì)胞因子抵御病原體的入侵[2]。2005年RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ like receptors，RLRs)，即一條不依賴于Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)的、能專一性識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中病毒核酸的新通路被發(fā)現(xiàn)[3]。目前已知的RLRs家族成員包括三個(gè)：視黃酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ(retinoic acia-induced gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation associated gene 5，MDA5)及LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)，它們均位于細(xì)胞質(zhì)中[4]。RIG-Ⅰ識(shí)別相對較短的雙鏈RNA(dsRNA)(<1 kb)和5′三磷酸的RNA；MDA5識(shí)別較長的dsRNA(>1 kb)[5]；而對LGP2的配體了解較少，目前研究認(rèn)為它對RLRs信號(hào)通路起到調(diào)節(jié)作用。

MDA5可識(shí)別病毒的雙鏈RNA[6-8]。作者實(shí)驗(yàn)室曾對雙鏈RNA病毒科的傳染性法氏囊病病毒(infection bursal disease virus，IBDV)感染SPF雛雞外周血液淋巴細(xì)胞chMDA5及其信號(hào)通路因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，IBDV能夠激活雛雞體內(nèi)chMDA5信號(hào)通路，并且IBDV復(fù)制與chMDA5信號(hào)通路因子的表達(dá)有著密切關(guān)系[9]。MDA5的N端為2個(gè)CARD(caspase activation and recruitment domain)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成，稱為效應(yīng)結(jié)構(gòu)域；中間為DExD/H解旋酶區(qū)(DExD/H helicase)，具有水解ATP及結(jié)合并解開RNA的能力，稱為調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域；C端為RNA結(jié)合域(RD，抑制結(jié)構(gòu)域)和與其交疊的C端結(jié)構(gòu)域(CTD)[3]。當(dāng)MDA5識(shí)別其配體后，該信號(hào)被傳遞到干擾素-β(IFN-β)啟動(dòng)子——刺激因子-1(IPS-1)[10]，也稱為MAVS/VISA/Cardif[11-13]，它們通過CARD-CARD結(jié)構(gòu)域相互作用錨定在線粒體膜上。IPS-1通過其C末端一邊募集TRAF2/TRAF6活化IKK激酶復(fù)合物，從而激活NF-κB；另一邊募集TRAF3和TBK1使IRF3和IRF7磷酸化，并形成二聚體形式，活化后的這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核[14-15]，調(diào)控相應(yīng)的促炎癥因子及Ⅰ型干擾素的表達(dá)。產(chǎn)生的IFN-β還可以與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，通過啟動(dòng)JAK-STAT信號(hào)通路引發(fā)抗病毒活性并激活適應(yīng)性免疫[16]。因此，MDA5在識(shí)別病原體，激活抗病毒反應(yīng)中起著重要作用。A.J.Karpala等通過研究提出雞可能缺乏RIG-Ⅰ基因[17]，這就使得MDA5在雞體識(shí)別病原體入侵，激活抗病毒天然免疫方面顯得尤為重要。而不同組織器官中MDA5的分布情況可能會(huì)影響該部位對入侵病原體的識(shí)別。目前，未見有MDA5在雞體器官組織中表達(dá)及定位的報(bào)道。因此，本研究以在我國飼養(yǎng)較為普遍的海蘭白雛雞為研究對象，依據(jù)雞場常規(guī)的免疫程序選定研究日齡，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot以及間接免疫熒光方法，研究雛雞在不同日齡時(shí)，其免疫器官(法氏囊、胸腺及脾)中chMDA5的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，為探究MDA5與雞體免疫功能相關(guān)性奠定基礎(chǔ)，也為禽類病毒性傳染病的防治研究提供新的方向。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及處理

50只1日齡健康海蘭白蛋雞購自哈爾濱先鋒種雞場，分別于1、7、14、21、28、31、35、42、45、49日齡，隨機(jī)抽取5只雛雞進(jìn)行安樂死，快速采取法氏囊、胸腺及脾，放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑及儀器

Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture、RNApure 高純度總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑均購自大連寶生物工程有限公司；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；小鼠抗雞MDA5單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備[18]；山羊血清購自博士德生物工程有限公司；抗β-actin小鼠單克隆抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；碘化丙啶(PI)購自Sigma公司；ECL超敏發(fā)光液購自北京普萊利基因技術(shù)有限公司；杭州博日Line Gene 9620熒光定量PCR儀為黑龍江省天力科技開發(fā)有限公司產(chǎn)品；冰凍切片機(jī)、正置熒光顯微鏡均為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測雛雞免疫器官chMDA5 mRNA的表達(dá)

1.3.1雛雞免疫器官總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄按照高純度總RNA提取試劑盒說明書的方法分別提取不同日齡雛雞的法氏囊、胸腺及脾的總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物的設(shè)計(jì)與合成參考GenBank公布的chMDA5基因序列，使用Oligo軟件進(jìn)行分析設(shè)計(jì)特異性引物，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測chMDA5 mRNA的表達(dá)情況。同時(shí)，參考GenBank公布的chβ-actin基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，作為參考基因，引物由金唯智生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1　chMDA5和參考基因目的片段擴(kuò)增用引物

1.3.3雛雞免疫器官chMDA5 mRNA表達(dá)的檢測實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)在Line Gene 9620熒光定量PCR儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。退火延伸時(shí)檢測熒光信號(hào)。PCR反應(yīng)體系：2×Premix 10 μL、上游Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL、下游Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL、cDNA 1 μL、ROX 0.4 μL、PCR水補(bǔ)至20 μL。對PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，試驗(yàn)中由PCR儀設(shè)定統(tǒng)一的熒光閾值，PCR擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值后，儀器將計(jì)算出此反應(yīng)所需的循環(huán)數(shù)為Ct值。以chβ-actin為參考基因，腦組織樣品為對照，各組織相對于腦組織的ΔΔCt值根據(jù)以下公式計(jì)算：ΔΔCt值=(目的基因Ct值-參考基因Ct值)試驗(yàn)組-(目的基因Ct值-參考基因Ct值)對照組。利用公式計(jì)算出mRNA相對表達(dá)量為2-ΔΔCt。

1.4Western blot方法檢測雛雞免疫器官chMDA5蛋白的表達(dá)1.4.1雛雞免疫器官總蛋白質(zhì)的提取將雛雞法氏囊、胸腺及脾組織分別剪成細(xì)小的碎塊，加液氮進(jìn)行研磨，按照每20 mg組織加入200 μL的比例加入裂解液，并按與裂解液1∶100的比例加入PMSF，充分研磨后將樣品12 000 r·min-1離心5 min，取上清，與2×SDS上樣buffer 1∶1混勻，煮沸10 min，得到的蛋白質(zhì)樣品-40 ℃保存?zhèn)溆谩?.4.2雛雞免疫器官chMDA5蛋白表達(dá)的檢測選用濃度為8%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完畢后，將膠取下，切成適當(dāng)大小，剪取相同大小的NC膜，分別浸泡在轉(zhuǎn)印液TTB中20 min，使用半干式轉(zhuǎn)印儀進(jìn)行轉(zhuǎn)印，按從陽極到陰極依次為濾紙、NC膜、凝膠、濾紙的順序重疊起來。設(shè)置電壓為15 V，轉(zhuǎn)印2 h。NC膜用TTBS配制的5%脫脂乳，37 ℃條件下封閉2 h。封閉結(jié)束后，TTBS洗膜3次，每次5 min。一抗分別為1∶2 000稀釋的小鼠抗雞MDA5單克隆抗體和1∶1 000稀釋的抗β-actin小鼠單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，反應(yīng)后TTBS洗膜3次，每次10 min。二抗為1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，室溫作用1 h，反應(yīng)后TTBS洗膜3次，每次10 min，TBS洗膜2次，每次5 min。ECL超敏發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)曝光，利用Image軟件分析Western blot結(jié)果。

1.5間接免疫熒光方法檢測雛雞免疫器官chMDA5蛋白的定位

使用冰凍切片機(jī)分別將雛雞法氏囊、胸腺及脾制成7 μm的冰凍切片。切片于室溫晾干1 h，置于丙酮中-20 ℃固定20 min，室溫晾干。PBS洗滌3次，每次5 min。正常山羊血清用PBS按1∶100稀釋，室溫封閉20 min。PBS洗滌3次，每次5 min。小鼠抗雞MDA5單克隆抗體按1∶100稀釋，37 ℃孵育2 h。PBS洗滌3次，每次10 min。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG按1∶300稀釋，37 ℃避光孵育1.5 h。PBS洗滌3次，每次10 min。碘化丙啶(PI)復(fù)染細(xì)胞核，洗滌同前。封片后將切片置于正置熒光顯微鏡下觀察chMDA5蛋白表達(dá)情況，陽性反應(yīng)部位呈特異性綠色熒光。

1.6數(shù)據(jù)分析

采用Graph PadPrism軟件繪制柱狀圖。

2結(jié)果

2.1雛雞免疫器官chMDA5 mRNA轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)變化

雛雞法氏囊中chMDA5 mRNA的轉(zhuǎn)錄量在1～14日齡時(shí)相近，之后其轉(zhuǎn)錄量有所下降，28日齡后呈上升趨勢至31日齡達(dá)到峰值，之后轉(zhuǎn)錄量持續(xù)下調(diào)，直到49日齡時(shí)有所上調(diào)，如圖1。

圖1　雛雞法氏囊中chMDA5 mRNA轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)變化Fig.1　Dynamic changes of the chMDA5 mRNA transcription in chick bursa of Fabricius

雛雞胸腺中chMDA5 mRNA的轉(zhuǎn)錄量在1～14日齡時(shí)相近，之后呈下調(diào)趨勢，21日齡后其轉(zhuǎn)錄量大幅上升，至31日齡達(dá)到峰值，隨后又逐漸下調(diào)，至45日齡之后趨于穩(wěn)定，如圖2。

雛雞脾中chMDA5 mRNA的轉(zhuǎn)錄量在1～21日齡時(shí)趨于一致，在28日齡時(shí)小幅上調(diào)，隨后下調(diào)(31日齡)，后又大幅上調(diào)，在35日齡時(shí)達(dá)到峰值，隨后呈持續(xù)下調(diào)趨勢，至49日齡達(dá)到最低值，如圖3。

圖2　雛雞胸腺中chMDA5 mRNA轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)變化Fig.2　Dynamic changes of the chMDA5 mRNA transcription in chick thymus

圖3　雛雞脾中chMDA5 mRNA轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)變化Fig.3　Dynamic changes of the chMDA5 mRNA transcription in chick spleen

2.2雛雞免疫器官chMDA5蛋白的表達(dá)變化

雛雞法氏囊中chMDA5蛋白的表達(dá)量在1～7日齡呈上升趨勢，且7日齡時(shí)達(dá)到所檢測日齡中的最大值，隨后其表達(dá)量下降，在14～35日齡之間呈先上升后下降的波動(dòng)趨勢，之后表達(dá)量上調(diào)并在42日齡后趨于穩(wěn)定，如圖4。

圖4　雛雞法氏囊中chMDA5蛋白的表達(dá)變化Fig.4　Changes of the chMDA5 protein expression in chick bursa of Fabricius

雛雞胸腺中chMDA5蛋白的表達(dá)量在1～7日齡之間呈高表達(dá)水平，之后其表達(dá)量下降，在14～35日齡之間也呈現(xiàn)出小幅波動(dòng)趨勢，之后表達(dá)量大幅上調(diào)并在42日齡后其表達(dá)略趨于穩(wěn)定，如圖5。

雛雞脾中chMDA5蛋白的表達(dá)量整體呈現(xiàn)出以14 d左右為一個(gè)周期的階段式上調(diào)趨勢，在一個(gè)周期內(nèi)又呈現(xiàn)出先上升后下降的變化，并在42日齡后其表達(dá)趨于高水平且波動(dòng)不大，如圖6。

圖5　雛雞胸腺中chMDA5蛋白的表達(dá)變化Fig.5　Changes of the chMDA5 protein expression in chick thymus

圖6　雛雞脾中chMDA5蛋白的表達(dá)變化Fig.6　Changes of the chMDA5 protein expression in chick spleen

2.3雛雞免疫器官chMDA5蛋白的定位

在雛雞法氏囊、胸腺及脾的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均可檢測到chMDA5蛋白的表達(dá)。其中，法氏囊的免疫陽性反應(yīng)區(qū)域是在淋巴濾泡的皮質(zhì)和髓質(zhì)，尤其是皮質(zhì)部分免疫陽性反應(yīng)較強(qiáng)且陽性細(xì)胞排列緊密(如圖7A)；胸腺小葉的皮質(zhì)、髓質(zhì)內(nèi)均可見較明顯陽性反應(yīng)細(xì)胞(如圖7C)；脾的白髓和紅髓細(xì)胞內(nèi)也可見到特異性綠色熒光(如圖7E)，圖7B、D、F為陰性對照，且均無陽性反應(yīng)信號(hào)。

3討論

RIG-Ⅰ樣受體在動(dòng)物的絕大多數(shù)組織中都有表達(dá)，而且它們所介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)也在相應(yīng)的細(xì)胞中發(fā)生[19]。MDA5是RLRs家族中的重要成員，它能夠識(shí)別多種病毒的入侵，從而啟動(dòng)抗病毒天然免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，是機(jī)體抵抗病原體入侵的重要途徑之一[3，20-21]。因此，明確MDA5在機(jī)體免疫器官內(nèi)的分布及表達(dá)情況，可為研究MDA5參與動(dòng)物機(jī)體免疫調(diào)節(jié)及免疫發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

本試驗(yàn)從mRNA和蛋白質(zhì)水平對不同日齡健康雛雞免疫器官法氏囊、胸腺及脾中chMDA5的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各日齡雛雞法氏囊、胸腺及脾中均檢測到chMDA5的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)。法氏囊與胸腺中chMDA5 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化較為一致，均在1～14日齡時(shí)相近，隨后開始下調(diào)，21日齡后呈上調(diào)趨勢并在31日齡時(shí)其表達(dá)量達(dá)到峰值，之后逐漸下調(diào)，而法氏囊在49日齡又呈上調(diào)趨勢；脾在1～31日齡之間其表達(dá)量變化不大，隨后開始上調(diào)并在35日齡時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸下調(diào)。脾35日齡時(shí)的表達(dá)峰值可能是由于中樞免疫器官在31日齡時(shí)的高轉(zhuǎn)錄所致。

mRNA的轉(zhuǎn)錄變化并不能代表蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況，所以作者又采用Western blot方法對chMDA5蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，法氏囊與胸腺中chMDA5蛋白的表達(dá)情況也趨于一致，均在7日齡達(dá)到峰值，隨后下調(diào)，在14～35日齡時(shí)呈波動(dòng)變化，之后逐漸上調(diào)并趨于穩(wěn)定；脾中其表現(xiàn)出以14 d左右為一個(gè)周期的變化趨勢，隨著日齡增大其表達(dá)量在總體上趨于逐漸上調(diào)。

圖7　雛雞主要免疫器官中chMDA5蛋白的定位(bar=20 μm)Fig.7　Locations of the chMDA5 protein in main immune organs of chick (bar=20 μm)

本試驗(yàn)從mRNA及蛋白質(zhì)水平共同揭示chMDA5在雛雞免疫器官中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在雛雞免疫器官中chMDA5 mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化并不完全趨于一致，這可能與體內(nèi)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控有關(guān)。

由于動(dòng)物機(jī)體組織結(jié)構(gòu)與其功能是密切相關(guān)的，可從各免疫器官的發(fā)育情況來分析chMDA5蛋白的表達(dá)變化。曙光等發(fā)現(xiàn)蛋雞法氏囊在68日齡時(shí)其濾泡的長、寬、皮質(zhì)及髓質(zhì)厚度最大[22]，本試驗(yàn)只檢測到49日齡的雛雞，所以可能未檢測到其最大的表達(dá)量。王瑩等發(fā)現(xiàn)1日齡雛雞的胸腺組織結(jié)構(gòu)發(fā)育已經(jīng)較完善[23]，作者也的確在1日齡胸腺組織檢測到chMDA5蛋白較高水平的表達(dá)。張英楠等發(fā)現(xiàn)海蘭白雛雞的脾在7日齡時(shí)具備近似成熟的組織結(jié)構(gòu)，但直至35日齡才趨于穩(wěn)定[24]。作者發(fā)現(xiàn)脾在7日齡時(shí)chMDA5蛋白呈現(xiàn)出高表達(dá)，這一表達(dá)情況與其組織結(jié)構(gòu)發(fā)育的趨勢基本是相一致的，而作者在42日齡時(shí)觀察到chMDA5蛋白的最大表達(dá)量，這可能與飼養(yǎng)環(huán)境等因素導(dǎo)致其發(fā)育情況稍有不同相關(guān)。

有研究報(bào)道，MDA5主要表達(dá)于非免疫細(xì)胞中[20]。作者采用間接免疫熒光方法對chMDA5蛋白的表達(dá)進(jìn)行了定位，發(fā)現(xiàn)在雛雞法氏囊的淋巴濾泡、胸腺小葉的皮質(zhì)部和髓質(zhì)部及脾的紅髓和白髓均有表達(dá)，表明chMDA5蛋白在雛雞免疫器官免疫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，7日齡雛雞法氏囊、胸腺及脾內(nèi)chMDA5蛋白表達(dá)量均處于較高水平，而在14日齡后均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)以及波動(dòng)狀態(tài)，直到42日齡逐漸上調(diào)并趨于穩(wěn)定，這提示我們考慮到chMDA5與其所識(shí)別的病毒種類及其易感日齡的相關(guān)性，如3～6周齡的雛雞對IBDV最為易感，而最近有研究報(bào)道，IBD易感日齡已向兩端延伸[25]，這可能就與chMDA5蛋白的表達(dá)在2～6周齡之間均呈較低趨勢相關(guān)；已有研究表明雞TLR3也可識(shí)別IBDV[26-27]，所以這一猜測還需要與雞TLR3蛋白表達(dá)情況相結(jié)合而做進(jìn)一步研究。42日齡以后，免疫器官發(fā)育日益成熟，三種免疫器官中MDA5蛋白均趨于高表達(dá)且相對穩(wěn)定在一定水平，應(yīng)該是雛雞抗病毒能力增強(qiáng)的一個(gè)重要因素。另外，7日齡雛雞免疫器官中chMDA5的高表達(dá)也提示在生產(chǎn)實(shí)際中可在此日齡對雛雞進(jìn)行相應(yīng)的免疫，可能會(huì)產(chǎn)生更高的抗體水平。綜上，通過研究chMDA5在雛雞免疫器官中的表達(dá)與定位情況，對雛雞相應(yīng)疾病的預(yù)防、治療及免疫發(fā)病機(jī)制的研究均具有指示作用。

4結(jié)論

chMDA5在雛雞法氏囊、胸腺及脾中均有轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)，且不同日齡之間的表達(dá)存在差異；chMDA5蛋白主要定位于法氏囊、胸腺及脾免疫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]KAWAI T，AKIRA S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity：update on Toll-like receptors[J].NatImmunol，2010，11(5)：373-384.

[2]譚艷，陳政良.天然免疫模式識(shí)別途徑：胞外識(shí)別與胞內(nèi)識(shí)別[J].免疫學(xué)雜志，2004，20(3)：28-30，34.

TAN Y，CHEN Z L.Innate immunity pattern recognition：intracellular and extracellular pathways[J].ImmunologicalJournal，2004，20(3)：28-30，34.(in Chinese)

[3]劉歡歡，謝麗君，邵志勇，等.MDA5在先天性免疫抗病毒作用中的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42(1)：230-233.

LIU H H，XIE L J，SHAO Z Y，et al.Research progress on antiviral effect of MDA5 in innate immunity[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine，2015，42(1)：230-233.(in Chinese)

[4]YONEYAMA M，F(xiàn)UJITA T.Recognition of viral nucleic acids in innate immunity[J].RevMedVirol，2010，20(1)：4-22.

[5]LEE C C，WU C C，LIN T L.Characterization of chicken melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) from alternative translation initiation[J].CompImmunolMicrobiolInfectDis，2012，35(4)：335-343.

[6]KATO H，TAKEUCHI O，SATO S，et al.Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses[J].Nature，2006，441(7089)：101-105.

[7]GITLIN L，BARCHET W，GILFILLAN S，et al.Essential role of mda-5 in type I IFN responses to polyriboinosinic：polyribocytidylic acid and encephalomyocarditis picornaviras[J].ProcNatlAcadSciUSA，2006，103(22)：8459-8464.

[8]孫文香，蔣爭凡.病毒感染引發(fā)天然免疫細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進(jìn)展[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(5)：563-573.

SUN W X，JIANG Z F.Innate immune detection and activation to viral infection[J].ChineseJournalofCellBiology，2013，35(5)：563-573.(in Chinese)

[9]王成成，葛銘，劉超男，等.IBDV感染雛雞外周血液淋巴細(xì)胞chMDA5信號(hào)通路因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，46(5)：830-835.

WANG C C，GE M，LIU C N，et al.Dynamic changing in the expression of chMDA5 signal pathway factors in peripheral blood lymphocytes of chicken infected with IBDV[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2015，46(5)：830-835.(in Chinese)

[10]KAWAI T，TAKAHASHI K，SATO S，et al.IPS-1，an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated typeⅠinterferon induction[J].NatImmunol，2005，6(10)：981-988.

[11]MEYLAN E，CURRAN J，HOFMANN K，et al.Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus[J].Nature，2005，437(7062)：1167-1172.

[12]SETH R B，SUN L，EA C K，et al.Identification and characterization of MAVS，a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-κB and IRF3[J].Cell，2005，122(5)：669-682.

[13]XU L G，WANG Y Y，HAN K J，et al.VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-β signaling[J].MolCell，2005，19(6)：727-740.

[14]BARBALAT R，EWALD S E，MOUCHESS M L，et al.Nucleic acid recognition by the innate immune system[J].AnnuRevImmunol，2011，29：185-214.

[15]LOO Y M，GALE M JR.Immune signaling by RIG-I-like receptors[J].Immunity，2011，34(5)：680-692.

[16]YONEYAMA M，KIKUCHI M，NATSUKAWA T，et al.The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses[J].NatImmunol，2004，5(7)：730-737.

[17]KARPALA A J，STEWART C，MCKAY J，et al.Characterization of chicken Mda5 activity：regulation of IFN-β in the absence of RIG-I functionality[J].JImmunol，2011，186(9)：5397-5405.

[18]王成成.雞MDA5基因克隆表達(dá)及單克隆抗體的制備與應(yīng)用[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

WANG C C.Cloning and expression of chicken melanoma differentiation-associated gene 5 and using of monoclonal antibodies against its recombinant protein[D].Harbin：Northeast Agricultural University，2015.(in Chinese)

[19]張煜，鐘波，楊艷，等.TLRs與RLRs介導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)節(jié)機(jī)制[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2009，31(4)：453-468.

ZHANG Y，ZHONG B，YANG Y，et al.Mechanisms and regulations of TLRs- and RLRs-mediated cellular antiviral signaling[J].ChineseJournalofCellBiology，2009，31(4)：453-468.(in Chinese)

[20]YONEYAMA M，KIKUCHI M，MATSUMOTO K，et al.Shared and unique functions of the DExD/H-box helicases RIG-I，MDA5，and LGP2 in antiviral innate immunity[J].JImmunol，2005，175(5)：2851-2858.

[21]SUMPTER R JR，LOO Y M，F(xiàn)OY E，et al.Regulating intracellular antiviral defense and permissiveness to hepatitis C virus RNA replication through a cellular RNA helicase，RIG-I[J].JVirol，2005，79(5)：2689-2699.

[22]曙光，張勇，王純潔.肉雛雞與蛋雛雞法氏囊生長發(fā)育規(guī)律的探討[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(10)：31-34.

SHU G，ZHANG Y，WANG C J.Contrasting research on the law of growth on broiler chicken and layer chicken[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine，2009，36(10)：31-34.(in Chinese)

[23]王瑩，劉偉強(qiáng).雞胚胸腺、法氏囊組織免疫功能發(fā)育研究[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012(3)：14-17.

WANG Y，LIU W Q.Research on the immune function development in chicken embryo thymus and bursal tissue[J].JournalofMudanjiangNormalUniversity(NaturalSciencesEdition)，2012(3)：14-17.(in Chinese)

[24]張英楠，楊樹寶，楊柳，等.雞脾臟組織結(jié)構(gòu)早期發(fā)育的動(dòng)態(tài)觀察[J].中國家禽，2010，32(3)：13-15.

ZHANG Y N，YANG S B，YANG L，et al.Dynamic observation of histological development of spleen in chicken[J].ChinaPoultry，2010，32(3)：13-15.(in Chinese)

[25]李潭清，宋勤葉，楊潤德，等.雞傳染性法氏囊病的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(35)：15481-15484.

LI T Q，SONG Q Y，YANG R D，et al.The research of infectious bursal disease[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences，2008，36(35)：15481-15484.(in Chinese)

[26]RAUF A，KHATRI M，MURGIA M V，et al.Differential modulation of cytokine，chemokine and Toll like receptor expression in chickens infected with classical and variant infections bursal disease virus[J].VetRes，2011，42：85.

[27]王成成，王杲強(qiáng)，葛銘，等.感染傳染性法氏囊病病毒的DF-1細(xì)胞中chTLR3表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2014，44(12)：1304-1308.

WANG C C，WANG G Q，GE M，et al.Dynamic changes of the chTLR3 expression in DF-1 cells infected with infectious bursal disease virus[J].ChineseVeterinaryScience，2014，44(12)：1304-1308.(in Chinese)

(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.023

收稿日期：2016-02-01

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31272533)

作者簡介：欒亞男(1992-)，女，吉林集安人，碩士生，主要從事動(dòng)物病理學(xué)的研究，E-mail：1137072249@qq.com *通信作者：張瑞莉，教授，E-mail：zhangruili@neau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S852.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)07-1480-08

The Expression and Location of chMDA5 in Chick Immune Organs

LUAN Ya-nan，GE Ming，LI Guang-xing，XIE Wan-qiu，YANG Gui-jun，ZHANG Rui-li*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Abstract:The objective of the present study was to examine the expression and location of chick melanoma differentiation associated gene 5 (chMDA5) in chick immune organs.Fifty health Highland white chicks were euthanized to collect bursa of Fabricius，thymus and spleen at 1，7，14，21，28，31，35，42，45，49-day-old，separately.Then，real-time fluorescence quantitative PCR，Western blot and IFA techniques were used to detect the expression of chMDA5 in chick immune organs.The results showed that the chMDA5 mRNA were examined in bursa of Fabricius，thymus and spleen at each age，chMDA5+ cells were detected in the cortex of bursal lymphoid follicles，the cortex and medulla of thymus lobule，the white pulp and red pulp of spleen.The expression pattern of chMDA5 protein in bursa of Fabricius and thymus tissue was consistent，which showed an upward trend in 1 to 7-day-old chicks and reached peak at 7-day-old，and then went down in 14 to 35-day-old with a fluctuation trend，then gradually increase and stabilized.In spleen，the protein expression of chMDA5 was increased with the increasing age in a period of about 14 days.The results indicated that the chMDA5 were expressed in chick immune organs，and there were differences in expression of chMDA5 with different ages.This study provide a scientific test basis for further exploration about the correlation between chMDA5 and chick immune function.

Key words:chMDA5；chicks；immune organs；expression；location