花姜酮對鼻咽癌細胞株放療敏感性的影響

劉珺，廖劍絢，唐洪波，周芝芳南華大學附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，湖南衡陽　421001

花姜酮對鼻咽癌細胞株放療敏感性的影響

劉珺，廖劍絢，唐洪波，周芝芳
南華大學附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，湖南衡陽421001

目的觀察花姜酮處理對鼻咽癌CNE-2細胞放療敏感性的影響。方法體外培養(yǎng)鼻咽癌細胞系CNE-2。并根據(jù)不同的實驗目的分為對照組、γ-射線干預組以及γ-射線聯(lián)合花姜酮處理組。其中對照組包括空白對照組和花姜酮處理組，分別給予等體積培養(yǎng)基或0～20μmol/L花姜酮處理48 h，γ-射線組采用劑量率為100cGy的γ-射線照射，聯(lián)合治療組細胞采用花姜酮預處理24 h后用γ-射線照射。處理結束后采用MTT法檢測CNE-2細胞增殖情況，流式細胞術檢測CNE-2細胞周期改變情況。結果 0～20μmol/L花姜酮或100cGy γ-射線單獨處理48 h后，對人鼻咽癌CNE-2細胞生長無明顯影響；而同時聯(lián)合不同濃度花姜酮與100cGy的γ-射線處理后，隨著花姜酮濃度的增高，細胞增殖水平隨之降低。流式細胞術也顯示，0～20μmol/L花姜酮聯(lián)合100cGy γ-射線照射后，可將細胞阻滯在G1期，同時可降低S期、G2/M期細胞的比例。結論花姜酮通過改變CNE-2細胞周期而發(fā)揮對細胞放療增敏作用。

花姜酮；鼻咽癌細胞；放療；敏感性

［Abstract］Objective To observe the effect of zerumbone treatment on the radiosensitivity of the nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells.Methods nasopharyngeal cancer cell line CNE-2 was cultured in vitro and divided into the control group，gamma ray intervention group and gamma ray combined with zerumbone treatment group，among them，the control group included the blank control group and the zerumbone treatment group，and they were respectively given equal-volume culture media or 0-20μmol/L zerumbone treatment for 48h，the gamma ray group adopted 100cGy gamma ray radiation，the combined treatment group adopted gamma ray radiation after the zerumbone pretreatment for 24h，and the CNE-2 cell proliferation was detected by MTT method and CNE-2 cell cycle changes were detected by flow cytometry at the end of treatment. Results After 48h single treatment，0-20μmol/L zerumbone or 100cGy gamma ray radiation had no obvious effect on the human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cell growth；but the combined treatment of different concentrations of zerumbone and 100cGy gamma ray showed that with the increase of the zerumbone concentration，the cell proliferative level decreased，and the flow cytometry also showed that after the treatment of 0-20μmol/L zerumbone and 100cGy gamma ray radiation，the cells were arrested in G1 phase，at the same time，the cell proportions in S stage and G2/M stage could be reduced.Conclusion Zerumbone plays a sensibilization role in cell radiotherapy by changing the CNE-2 cycle.

［Key words］Zerumbone；Nasopharyngeal cancer cell；Radiotherapy；Sensitivity

鼻咽癌（nasophary ngeal carcinoma，NPC）是我國兩廣地區(qū)最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，病理學上大部分表現(xiàn)為低分化鱗癌和未分化癌，且具有高轉移和高復發(fā)性［1］。NPC病因尚未明確，吸煙、EB病毒感染、飲食與居住環(huán)境受均與NPC的發(fā)病有關［2］。盡管放射治療可提高NPC的局部控制率，但其應用受到多因素的限制［3］。研究表明，某些中草藥提取物對提高腫瘤細胞對放療的敏感性方面具有協(xié)同作用，花姜酮就是其中一種［4-5］。該研究旨在觀察花姜酮對鼻咽癌CNE-2細胞的放療敏感性的影響。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料

花姜酮（純度≥95%）購自Sigma-Adrich；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Life公司，MTT試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司，Annexin V-FITC調往檢測試劑盒購自Keygen。

1.2細胞培養(yǎng)與處理

CNE-2鼻咽癌細胞株（購自美國ATCC）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。并根據(jù)不同的實驗目的分為對照組、γ-射線組以及γ-射線聯(lián)合花姜酮組。其中對照組包括空白對照組和花姜酮處理組，分別給予等體積培養(yǎng)基或0～20μmol/L花姜酮處理48 h，γ-射線組采用劑量率為100 cGy的γ-射線照射，聯(lián)合治療組細胞采用花姜酮預處理24 h后用γ-射線照射。聯(lián)合治療組細胞采用花姜酮預處理24 h后用γ-射線照射。

1.3細胞活性檢測

采用MTT法觀察花姜酮對CNE-2細胞的增殖情況，即，生長于96孔板中的CNE-2細胞處理結束后，每孔加入30 μL MTT溶液繼續(xù)孵育2 h。棄上清，加入200 μL DMSO，漩渦振蕩器上充分混勻，用酶標儀測定各孔的吸光度值。

1.4細胞周期分析

CNE-2細胞處理完畢后，按照商家提供的Annexin V-FITC試劑盒分析CNE-2細胞的周期改變情況。即，CNE-2細胞制備成單細胞懸液后，調整其密度為5×105/mL，根據(jù)試劑盒提供的步驟加入Annexin-V/FITC和PI后，用BD公司的Callibur型流式細胞儀檢測細胞周期改變情況。

1.5統(tǒng)計方法

2　結果

2.1不同濃度花姜酮對CNE-2細胞增殖的影響

未處理組CNE-2細胞增殖活躍，用濃度為0～20μmol/L的花姜酮作用24～72 h后，對CNE-2細胞增殖無明顯影響，當花姜酮濃度增高至30μmol/L后，可明顯抑制CNE-2細胞的增殖，因此在隨后的研究當中，選用0～20μmol/L的花姜酮為研究濃度。

表1　不同濃度花姜酮對CNE-2細胞活性的影響（±s）

表1　不同濃度花姜酮對CNE-2細胞活性的影響（±s）

注:*與0μmol/L花姜酮相比，P＜0.05。

花姜酮（μmol/L）24 h 48 h　72 h 0 10 20 30 98.32±2.86 97.32±1.22 96.86±2.05 （81.76±2.76）* 101.03±4.32 97.87±6.21 95.76±5.65 （76.86±4.54）* 99.32±2.32 98.65±4.27 96.69±2.53 （71.34±5.01）*

2.2花姜酮對γ-射線照射后對CNE-2細胞增殖的影響

單純γ-射線照射CNE-2細胞48～72 h后，對細胞生長增殖無明顯影響，而預先給予0～20μmol/L的花姜酮處理24 h后，然后繼續(xù)孵育至72 h，MTT結果顯示CNE-2細胞增殖水平隨著花姜酮濃度的增高而降低，見表2。

表2　花姜酮對γ-射線照射后對CNE-2細胞增殖的影響（±s）

表2　花姜酮對γ-射線照射后對CNE-2細胞增殖的影響（±s）

注:*與γ-射線相比，P＜0.05。

48 h　72 h花姜酮（0μmol/L）γ-射線γ-射線+10μmol/L花姜酮γ-射線+20μmol/L花姜酮101.03±4.32 96.87±4.54 （86.56±6.76）* （76.63±5.27）* 99.32±2.32 96.08±3.76 （79.95±5.76）* （10.45±3.86）*

2.3花姜酮聯(lián)合γ-射線對CNE-2細胞周期的影響

花姜酮或γ-射線處理前，細胞以S期為主，當兩者處理后，G1期細胞比例有所增加，而S期、G2/M期細胞比例均有下降，隨著花姜酮濃度的增加，G1期細胞比例進一步增加見表3。

表3　花姜酮對γ-射線照射后對CNE-2細胞周期的影響（±s）

表3　花姜酮對γ-射線照射后對CNE-2細胞周期的影響（±s）

注:*與γ-射線相比，P＜0.05。

G1S G2花姜酮（0μmol/L）γ-射線γ-射線+10μmol/L花姜酮γ-射線+20μmol/L花姜酮34.7±0.3 33.9±1.1 （47.2±2.6）* （66.9±3.3）* 45.8±0.5 46.4±1.3 （18.6±2.6）* （14.8±4.3）* 19.5±0.7 19.7±1.5 34.2±4.2 18.3±2.8

3　討論

腫瘤放療最大的難題就是細胞對射線不敏感。因此，放療前采用藥物干預可能是提高敏感性的途徑。有研究表明，某些硝基咪唑類化合物和甲硝唑可增強放療的效果，但由于其副作用過大而限制了其臨床應用［6］。相比之下，某些中藥提取物因其副作用低，且對多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用而備受青睞。臨床藥理學研究也表明，花姜酮能抑制細胞生長、抑制血管生成、促進腫瘤細胞凋亡以及抑制遷移與侵襲相關酶類的表達等多種生物學活性。此外，花姜酮也能增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，因此被該研究所采用。

首先該文通過MTT法對γ-射線和花姜酮作為單獨處理因素對CNE-2細胞的生長情況進行了觀察，結果發(fā)現(xiàn)單純采用0～20μmol/L的花姜酮作用24～72 h后，并不能影響CNE-2細胞的增殖，但其濃度增高至30μmol/L后，可有效降低其活性。同時單純γ-射線照射CNE-2細胞48～72 h對其生長增殖也無明顯影響。而預先給予0～20μmol/L的花姜酮處理24 h后，再給予γ-射線照射后，CNE-2細胞增殖水平隨著花姜酮濃度的增高而降低，以上結果表明花姜酮能以劑量依賴性方式增強CNE-2細胞對γ-射線的敏感性。隨后通過流式細胞術對CNE-2細胞生長抑制的機制進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)花姜酮聯(lián)合γ-射線處理細胞后，G1期細胞比例明顯增多，這表明兩者聯(lián)合使用后，抑制DNA合成可能是花姜酮抗鼻咽癌的一個重要機制?？傊?，該研究證實花姜酮對鼻咽癌CNE-2細胞具有一定的放療增敏作用，在下一步研究中，將對其信號轉導通路開展進一步研究。

［1］夏云飛.以放療為主的鼻咽癌個體化治療［J］.廣東醫(yī)學，2014，35（1）：6-8.

［2］范家銘，李靜，姜蓉，等.人參多糖對鼻咽癌細胞CNE-2裸鼠移植瘤的放療增敏作用及其可能的機制［J］.中國生物制品學雜志，2014，27（4）：538-543.

［3］Chiang MF，Chen HH，Chi CW，et al.Modulation of Sonic hedgehogsignalingandWWdomaincontaining oxidoreductase WOX1 expression enhances radiosensitivity of human glioblastoma cells［J］.Exp Biol Med（Maywood），2015，240（3）：392-399.

［3］Zhang X，Cheung RM，Komaki R，etal.Radiotherapy sensitizationbytumor-specificTRAILgenetargeting improves survival of mice bearing human non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11（18）：6657-6668.

［4］FriedmanGD，SelbyJV.Epidemiologicalscreeningfor potentially carcinogenic drugs［J］.Agents Actions Suppl，1990 （29）：83-96.

［5］Kim S，Lee J，Jeon M，et al.Zerumbone suppresses the motility and tumorigenecity of triple negative breast cancer cells via the inhibition of TGF-β1 signaling pathway［J］. Oncotarget，2016，7（2）:1544-1558.

［6］Fatima A，Abdul AB，Abdullah R，et al.Binding mode analysis of zerumbone to key signal proteins in the tumor necrosis factor pathway［J］.Int J Mol Sci，2015，16（2）：2747-2766.

Effect of Zerumbone on Radiosensitivity of the Nasopharyngeal Cancer Cell Line

LIU Jun，LIAO Jian-xun，TANG Hong-bo，ZHOU Zhi-fang
Department of Otorhinolaryngology，F(xiàn)irst Hospital Affiliated to Nanhua University，Hengyang，Hunan Province，421001 China

R473.76

A

1672-5654（2016）05（a）-0024-03

劉珺（1979.11-），女，湖南邵陽人，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：耳鼻喉疾病的診斷與治療。

廖劍絢（1965.9-），女，湖南岳陽人，本科，主任醫(yī)師，副教授，研究方向:耳鼻咽喉頭頸外科，E-mail:278691897@qq.com。

2016-02-14）