HPV16與18型L1病毒樣顆粒聯(lián)合JY佐劑鼻腔免疫食蟹猴誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答

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100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(麻粉蓮、鄭麗舒)；北京凱因科技股份有限公司(潘海、程智慧)；泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心(葉華躍)

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HPV16與18型L1病毒樣顆粒聯(lián)合JY佐劑鼻腔免疫食蟹猴誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答

麻粉蓮潘海程智慧葉華躍鄭麗舒

100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(麻粉蓮、鄭麗舒)；北京凱因科技股份有限公司(潘海、程智慧)；泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心(葉華躍)

【摘要】目的探討人乳頭瘤病毒16和18 型 L1 病毒樣顆粒與JY佐劑聯(lián)合(HPV16+18 L1 VLP+JY 佐劑)鼻腔免疫食蟹猴的黏膜免疫效果。方法分別用低劑量和高劑量 HPV 16+18 L1 VLP+JY 佐劑疫苗鼻腔噴霧免疫食蟹猴 3 次(第 0、4、8 周)，并設(shè) PBS對照組，于第 2、4、6、8、16周采集陰道分泌物、鼻腔分泌物和口腔分泌物，ELISA 法檢測 sIgA 抗體濃度。 結(jié)果低劑量和高劑量HPV 16+18 L1 VLP+JY佐劑疫苗均誘導(dǎo)鼻腔、口腔和陰道分泌物產(chǎn)生sIgA抗體，均高于對照組(P<0.01)；低劑量組和高劑量組sIgA抗體水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，陰道分泌物sIgA抗體水平高于鼻腔與口腔分泌物sIgA抗體水平(P<0.01)，鼻腔分泌物sIgA抗體水平與口腔分泌物sIgA抗體水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論含有JY 佐劑的 HPV 16 和18 型 L1 VLP 鼻腔噴霧免疫食蟹猴，能夠有效誘導(dǎo)陰道黏膜產(chǎn)生 sIgA 抗體，且高于口腔和鼻腔黏膜 sIgA 抗體濃度。

【主題詞】乳頭狀瘤病毒，人16和18型L1；病毒樣顆粒；JY 佐劑；黏膜免疫

人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)16和18型主要通過性行為方式傳播，理想的HPV16和18型疫苗應(yīng)能刺激機體生殖道黏膜產(chǎn)生特異性sIgA抗體，以阻斷HPV與宮頸上皮細胞的結(jié)合。清除黏膜感染的病原體，鼻腔黏膜免疫優(yōu)于皮下和肌內(nèi)免疫。鼻腔內(nèi)有一個淋巴組織和免疫器官為威氏環(huán)(Waldeyer's ring)，鼻腔免疫能避免口服和胃腸道免疫時酸性環(huán)境和酶對抗原的降解，并且被接種人群的耐受度高，無舌下免疫時抗原被誤吞的危險，而陰道免疫又極不方便。另外，如疫苗的劑量太低，肌內(nèi)注射不能刺激機體產(chǎn)生足夠強的免疫反應(yīng)；劑量過高，則可能引起較大副反應(yīng)；因此，確定免疫劑量十分關(guān)鍵。本研究將不同劑量的HPV16和18型L1 VLP與JY佐劑聯(lián)合使用，鼻腔噴霧免疫食蟹猴，評價不同黏膜sIgA抗體水平，為HPV黏膜免疫疫苗的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1病毒樣顆粒和佐劑HPV16和18型 L1 VLP由北京凱因科技股份有限公司提供；JY 佐劑由北京金迪克生物技術(shù)研究所提供。

1.2實驗動物及倫理審查食蟹猴，雌性，3～5歲，由山東弘立醫(yī)學(xué)動物實驗研究有限公司代為飼養(yǎng)和免疫，已通過該公司實驗動物倫理委員會審查。

1.3疫苗制備和實驗分組

1.3.1疫苗成品制備：低劑量組HPV 16+18 L1 VLP+JY佐劑疫苗：分別取8 μg HPV 16 L1 VLP 和4 μg HPV 18 L1 VLP，加入2000 IU 的IL-2和0.1 %殼聚糖溶液，醋酸鈉溶液定量至400 μl。高劑量組HPV 16+18 L1 VLP+JY 佐劑疫苗：分別取40 μg HPV16 L1 VLP 和20 μg HPV18 L1 VLP，加入2000 IU的IL-2和0.1 %殼聚糖溶液，醋酸鈉溶液定量至400 μl。

1.3.2實驗分組：食蟹猴分為3 組，每組4只。A組：低劑量組HPV 16+18 L1 VLP+JY 佐劑疫苗；B組：高劑量組HPV 16+18 L1 VLP+JY 佐劑疫苗；C組：鼻腔免疫對照組：鼻孔噴入400 μl PBS。

1.4動物免疫及樣品收集用鹽酸氯胺酮麻醉食蟹猴后進行免疫。分別于第0、4、8 周各免疫1次，每個鼻孔噴200 μl， 每只猴400 μl。于第2、4、6、8和16周采集陰道分泌物、鼻腔分泌物和口腔分泌物，浸泡于含有1%青鏈霉素的PBS溶液內(nèi)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5黏膜免疫sIgA抗體檢測采用雙抗體夾心ELISA法，參照猴sIgA ELISA試劑盒(北京冬歌生物科技有限公司)說明書進行操作。在酶標(biāo)板上設(shè)置標(biāo)準品孔、空白對照孔和待測樣品孔，37℃溫育30 min后洗滌5次，加入酶標(biāo)試劑作用30 min，洗滌酶標(biāo)板，加入顯色液作用15 min，每孔加入終止液終止反應(yīng)，在450 nm 波長測定各孔吸光度，通過標(biāo)準曲線計算黏膜sIgA抗體濃度。

2結(jié)果

2.1食蟹猴sIgA抗體水平與鼻腔免疫的相關(guān)性于第 2、4、6、8和16 周采集陰道、鼻腔和口腔分泌物，ELISA檢測sIgA抗體濃度的結(jié)果表明，含JY佐劑的HPV 16和18型L1 VLP鼻腔免疫食蟹猴，均誘導(dǎo)口腔、鼻腔和陰道分泌物產(chǎn)生sIgA抗體，且均高于對照組sIgA抗體水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(**P<0.01)。隨著免疫次數(shù)的增加，A組的陰道分泌物sIgA抗體水平也逐步上升，在第16 周時sIgA 的抗體濃度為34.62 μg/ml。A組和B組的陰道分泌物 sIgA抗體濃度均高于口腔和鼻腔分泌物sIgA抗體濃度，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(**P<0.01)，A 組和B 組的鼻腔和口腔分泌物的sIgA抗體濃度之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上，含有JY 佐劑的HPV 16 和18 型L1 VLP鼻腔噴霧免疫食蟹猴，能夠有效誘導(dǎo)的陰道黏膜產(chǎn)生sIgA抗體，且顯著高于口腔和鼻腔黏膜sIgA抗體濃度，見圖1。

2.2 食蟹猴sIgA抗體反應(yīng)與免疫劑量的相關(guān)性ELISA法檢測sIgA抗體的結(jié)果表明，第 2、4、6、8、16 周采集陰道分泌物、鼻腔分泌物和口腔分泌物的sIgA抗體水平，但8 μg HPV16 與4 μg HPV 18 L1 VLP 的低劑量組和40 μg HPV16 與20 μg HPV 18 L1 VLP 高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

3討論

疫苗刺激黏膜組織和相關(guān)淋巴結(jié)產(chǎn)生slgA抗體是黏膜免疫的主要作用機制。IgA在黏膜中以特殊的二聚體或者多聚體形式分泌，sIgA更能抵抗酶的降解，尤其適合黏膜防御[1]。目前上市的HPV 疫苗不能產(chǎn)生黏膜sIgA 抗體。本研究中，含有JY 佐劑HPV 16 和18 型 L1 VLP 鼻腔噴霧免疫食蟹猴可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生sIgA抗體，并且陰道黏膜sIgA抗體水平高于口腔和鼻腔黏膜sIgA抗體水平。

表1　食蟹猴陰道分泌物、鼻腔分泌物和口腔分泌物的sIgA抗體濃度

**：P<0.01圖1　鼻腔免疫食蟹猴黏膜sIgA抗體滴度Fig.1　Mucosal sIgA antibody concentration in various cynomolgus groups by intranasal immunization

疫苗的免疫劑量要適宜，以正確反映免疫原在體內(nèi)的免疫應(yīng)答。根據(jù)不同動物和人的體表面積比或其他等效劑量計算方法，得出使用劑量是常用的方法。Gardasil疫苗的臨床給藥劑量為每次0.5 ml，含有40 μg HPV 16 L1 VLP 與20 μg HPV 18 L1 VLP。按猴4 kg體重計算，其對應(yīng)劑量約為8 μg HPV 16型L1 VLP 和4 μg HPV 18型L1 VLP，為本實驗低劑量組。確定免疫劑量時還應(yīng)考慮免疫間隔時間，間隔時間長，抗原的劑量可適當(dāng)加大。本實驗中免疫時間間隔為4周，將抗原劑量提高了5倍，40 μg HPV 16 L1 VLP 和20 μg HPV 18 L1 VLP為高劑量組。結(jié)果表明，加大免疫劑量未產(chǎn)生更好的免疫效果。本實驗中，低劑量組和高劑量組的免疫劑量為5倍的跨度，所獲得的實驗數(shù)據(jù)較少，需要在以后的研究中縮小劑量間隔，以獲得更加精確的結(jié)果。

本研究中，鼻腔免疫不但能誘導(dǎo)口腔和鼻腔等近端組織產(chǎn)生黏膜應(yīng)答，還能激發(fā)陰道等遠端黏膜產(chǎn)生應(yīng)答，從而使多處黏膜獲得保護作用，這與抗原經(jīng)鼻腔免疫可誘導(dǎo)遠端的泌尿生殖道黏膜部位免疫反應(yīng)的結(jié)論一致[2]。黏膜疫苗中佐劑的使用很關(guān)鍵。本研究使用了殼聚糖與IL-2組成復(fù)方即JY佐劑，以改善疫苗免疫應(yīng)答或提高抗原的生物利用度[3]。因此，鼻腔、口腔和陰道分泌物的sIgA抗體可以聯(lián)合提供免疫保護作用，尤其是陰道特異性抗體可以抵御經(jīng)性途徑傳播的病原體。研究表明，經(jīng)鼻腔免疫產(chǎn)生的陰道抗體在很長時間內(nèi)都能被免疫誘導(dǎo)劑再次誘發(fā)[4，5]。本研究在第三次免疫后的第8周時檢測sIgA抗體水平仍然較高，說明抗體持續(xù)時間較長；陰道分泌物sIgA抗體水平高于鼻腔和口腔，可能是由于黏膜免疫時，活化的淋巴細胞定居在宮頸內(nèi)膜固有層、子宮內(nèi)膜腺體周圍及輸卵管黏膜下層，從而分泌特異性sIgA抗體。本研究只對不同免疫劑量疫苗免疫后sIgA抗體水平及免疫持續(xù)期進行研究，細胞免疫和其他工作正在研究中。

4參考文獻

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通信作者：鄭麗舒，Email：zhenglishu2000@sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.006

(收稿日期：2015-09-18)

Study on the mucosal immune response induced by intranasal immunization with HPV16 and 18 L1 virus like particles plus JY adjuvant in cynomolgus

MaFenlian，PanHai，ChengZhihui，YeHuayue，ZhengLishu

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention，ChinaCDC，Beijing100052，China(MaFL,ZhengLS)；BeijingKaiyinTechnologyShare-HoldingCo.Lta.Beijing100176,China(PanH,ChengZH);VaccineEngineeringCenter,TaizhouMedicalNewandHi-techIndustrialDevelopmentZone,Taizhou225300,China(YeHY)Correspondingauthor:ZhengLishu，Email：zhenglishu2000@sina.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mucosal immunity of L1 virus-like particles (VLPs) of human papillomavirus (HPV) types 16 and 18 plus JY adjuvant by intranasal immunization in cynomolgus. MethodsCynomolgus were immunized with low and high dosage of HPV types 16 and 18 L1 VLP with JY adjuvant for 3 times by intranasal route at weeks 0, 4 and 8, respectively, using PBS as control. Subsequently, vaginal secretion, oral secretion and nasal secretion were collected at weeks 0, 2, 4, 6, 8 and 16, respectively, and determined for mucosal immunity by ELISA. ResultsHPV-L1-specific sIgA antibodies were detected in all secretions, including oral, nasal and vaginal ones, the concentrations of sIgA antibody induced were much higher than those in PBS control group. There was no significant difference (P>0.05) in sIgA antibody levels among cynomolgus vaccinated with low and high dosage of L1 VLP, as was between oral and nasal secretion (P>0.05), However, the concentrations of sIgA antibody in vaginal secretion were significant higher than those in oral and nasal secretion, differences were statistically significant (P<0.01). ConclusionsFollowing intranasal immunization in cynomolgus, HPV types 16 and 18 L1 VLP with JY adjuvant can effectively induce sIgA antibody in vaginal secretion, and vaginal sIgA antibody concentrations were much higher than those in oral and nasal secretion.

【Key words】Human papillomavirus types 16 and 18 L1; virus-like particle; JY adjuvant; Mucosal immunity