青海湖周邊家禽相關(guān)環(huán)境標(biāo)本中H5N1亞型禽流感病毒特征分析

董婕　董麗波　張燁　薄洪　黃維娟　王大燕　舒躍龍

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國(guó)家流感中心，衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

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青海湖周邊家禽相關(guān)環(huán)境標(biāo)本中H5N1亞型禽流感病毒特征分析

董婕董麗波張燁薄洪黃維娟王大燕舒躍龍

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國(guó)家流感中心，衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

【摘要】目的了解我國(guó)青海湖周邊家禽中分離到的高致病性H5N1亞型禽流感病毒的抗原性和基因特性。 方法將青海湖周邊野鳥(niǎo)和家禽的環(huán)境標(biāo)本采集處理后，接種SPF雞胚分離病毒，將紅細(xì)胞凝集陽(yáng)性的標(biāo)本通過(guò)real-time RT-PCR進(jìn)行型別鑒定和亞型分析。將H5N1檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本選取部分進(jìn)行二代序列分析和抗原性分析。 結(jié)果2013年1-9月間采集的家禽相關(guān)環(huán)境標(biāo)本中共分離到19株高致病性H5N1亞型禽流感病毒，集中在1-3月。對(duì)7株病毒進(jìn)行了全基因組序列分析和抗原性分析顯示，血凝素基因進(jìn)化樹(shù)顯示其中除A/Environment/Qinghai/XN02032/2013屬于clade7.2 分支病毒以外，其余6株屬于clade2.3.2.1c分支。神經(jīng)氨酸酶基因也顯示該毒株與其他6株分屬于兩個(gè)不同的分支；抗原分析顯示該毒株與所有參考血清低反應(yīng)，另外6株病毒是A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010的類似株。 結(jié)論青海湖周邊地區(qū)在2013年1-3月環(huán)境相關(guān)標(biāo)本中檢測(cè)到高致病性H5N1亞型禽流感病毒，屬于clade2.3.2.1和clade7.2 分支病毒。這種高致病性H5N1亞型禽流感病毒多個(gè)分支共同流行的趨勢(shì)提示加強(qiáng)這一地區(qū)野鳥(niǎo)和家禽相關(guān)環(huán)境病原體監(jiān)測(cè)的重要性。

【主題詞】高致病性禽流感；H5N1亞型；進(jìn)化分析；抗原分析

Fund programs: National Basis Research Program(973) of China "Replication mechanisms of important influenza viruses in different hosts"(2011CB504704)

高致病性H5N1亞型禽流感病毒中以A/Goose/Guangdong/1/96為進(jìn)化起源的一系列病毒在2003年再發(fā)以來(lái)，在全球多個(gè)國(guó)家感染野鳥(niǎo)、引起禽類的暴發(fā)，并且偶有人類發(fā)病。由于這類病毒血凝素(HA)基因進(jìn)化多樣性突出，世界衛(wèi)生組織(WHO)、世界糧農(nóng)組織、世界動(dòng)物衛(wèi)生組織聯(lián)合工作委員會(huì)統(tǒng)一將高致病性H5N1亞型禽流感病毒的進(jìn)化分支進(jìn)行命名，目前共有10個(gè)分支(clade 0-9)[1]，其中clade 0、1、2和7感染過(guò)人。截止到2015年11月13日，全球共確診884個(gè)病例涉及16個(gè)國(guó)家，其中449例死亡(病死率51%)[2]。

在我國(guó)青海湖地區(qū)，2005年4月末到6月發(fā)生大規(guī)模的野鳥(niǎo)死亡，大約有10 000只。疫情是由野鳥(niǎo)感染高致病性禽流感H5N1亞型病毒引起。該病毒屬于clade 2.2[3]. 這類病毒于2006—2009年間陸續(xù)在蒙古、俄羅斯、德國(guó)、埃及、尼日利亞被發(fā)現(xiàn)并且導(dǎo)致野鳥(niǎo)的死亡。盡管這類病毒分布較廣，但是在中國(guó)鮮有在家禽中感染造成疫情暴發(fā)的報(bào)道。

隨后2009年5、6月間和2010年在青海湖地區(qū)又發(fā)現(xiàn)野鳥(niǎo)死亡，這次是由于高致病性H5N1的clade 2.3.2病毒感染引起。這次引起暴發(fā)的病毒在基因進(jìn)化上與中國(guó)香港和日本野鳥(niǎo)中分離的病毒同源性高，但是缺乏直接證據(jù)說(shuō)明病毒是由野鳥(niǎo)經(jīng)東亞遷徙途徑來(lái)到青海湖[4]。

我國(guó)高致病性禽流感H5N1病毒在動(dòng)物間存在著clade 2.3.2、clade 2.3.4和clade 7.2三個(gè)優(yōu)勢(shì)分支病毒。青海湖地區(qū)野鳥(niǎo)中H5亞型病毒分布和家禽的感染狀況是我們關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室在2013在青海湖核心區(qū)和鄰近的地區(qū)開(kāi)展了全年環(huán)境監(jiān)測(cè)，希望了解這一地區(qū)的禽流感H5N1病毒分布及病原學(xué)特征。

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集和處理標(biāo)本采集于2013年1-9月間，標(biāo)本采集場(chǎng)所除青海湖核心區(qū)域外，還包括了西寧市、海晏縣、樂(lè)都縣部分活禽市場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶[9]。標(biāo)本類型包括禽類糞便，被禽類及其糞便沾染的水和環(huán)境物體表面。標(biāo)本采集液配方參考WHO發(fā)布的《WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance 2006》[5]，采樣前1～2 d配制采樣液冷鏈運(yùn)輸?shù)浆F(xiàn)場(chǎng)，用無(wú)菌拭子挑取5 g左右的新鮮的糞便或者10 ml水樣加到采樣管里低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。將環(huán)境樣本離心(3 000 rpm，15 min)，取上清分裝保存，并且編號(hào)記錄?；畈《静僮骰顒?dòng)均在BSL-3實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 病毒的雞胚分離將處理好的標(biāo)本，接種9～10日齡SPF雞胚，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。冷胚后收獲雞胚尿囊液。血凝實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒的滴度。雞胚接種方法及血凝實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)上述WHO發(fā)布的手冊(cè)。

1.3核酸檢測(cè)將病毒分離血凝陽(yáng)性的分離物用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，引物和探針為WHO公布的針對(duì)甲型流感病毒M基因的通用引物和探針。將Ct值≤30的定義為陽(yáng)性，對(duì)于甲型流感陽(yáng)性的分離物，用real time RT-PCR方法進(jìn)行H5以及N1，N2亞型鑒定。

1.4二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行序列測(cè)定利用Ion TorrentTM測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行序列測(cè)定。提取病毒基因組RNA，以U12反轉(zhuǎn)錄引物生成單鏈cDNA，酶切作用使單鏈cDNA片段化，然后經(jīng)末端修復(fù)和與特異性接頭連接，變性處理后形成單鏈DNA，經(jīng)過(guò)油包水過(guò)程實(shí)現(xiàn)每個(gè)片段在自己的微環(huán)境內(nèi)PCR擴(kuò)增。純化后文庫(kù)定量，然后按照Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit(Cat. No. 4480974)說(shuō)明書(shū)將定量的文庫(kù)加入，上機(jī)測(cè)序。

1.5進(jìn)化分析用MEGA 5.0軟件的Clustal W方法進(jìn)行序列的比對(duì)，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行種系進(jìn)化分析，選擇1000次重復(fù)抽樣檢測(cè)。

1.6抗原性分析通過(guò)紅細(xì)胞凝集抑制(Hemagg-lutination Inhibition, HI)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行流感病毒的抗原性分析[5]。當(dāng)待檢病毒與參考雪貂抗血清的HI效價(jià)低于參考病毒與參考抗血清自身HI效價(jià)的8倍(含8倍)或以上時(shí)，則認(rèn)為待檢病毒是該參考抗血清檢測(cè)到的低反應(yīng)株；反之，當(dāng)相差8倍以內(nèi)時(shí)(不含8倍)，則認(rèn)為待檢病毒是參考病毒的類似株。所用標(biāo)準(zhǔn)毒株及其雪貂抗血清是針對(duì)中國(guó)大陸曾經(jīng)流行的高致病性禽流感H5N1病毒如clade 2,clade 7分支病毒。具體包括：A/Chicken/Viet Nam/NCVD-016/2008(clade 7.1)，A/Turkey/Turkey/1/2005(clade 2.2.1)，A/Bar-nswallow/HongKong/D10-1161/2010(clade 2.3.2.1b)， A/Common magpie/Hong Kong/5052/2007 (clade 2.3.2.1)，A/Hubei/1/2010(clade 2.3.2.1a)，A/Guangxi/1/2009(clade 2.3.2.1b)，A/Guizhou/1/2013 (clade 2.3.4)，A/Guangdong/99170/2014 (clade 2.3.4)。

2結(jié)果

2.1高致病性H5N1亞型禽流感病毒分離情況2013年1-9月共采集野鳥(niǎo)和家禽相關(guān)環(huán)境標(biāo)本6 364份，共分離到19株H5N1禽流感病毒，全部來(lái)源于家禽相關(guān)環(huán)境，病毒從2013年1-3月間的標(biāo)本中分離得到，地域分布在西寧活禽市場(chǎng)、樂(lè)都活禽市場(chǎng)以及海晏縣家禽養(yǎng)殖戶。按時(shí)間和地域代表性選取其中的7株病毒進(jìn)行了抗原性分析和二代測(cè)序。

表1　青海湖周邊家禽相關(guān)環(huán)境標(biāo)本分離的H5N1病毒抗原性分析

2.2高致病性H5N1亞型禽流感病毒抗原性分析利用陽(yáng)性參考血清，對(duì)分離的毒株進(jìn)行抗原性分析。結(jié)果顯示，7株高致病性H5N1亞型禽流感病毒除A/Environment/Qinghai/XN02032/2013以外的6株病毒均與clade 2.3.2.1病毒的抗血清有反應(yīng)，是2.3.2.1分支中A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010的類似株，不過(guò)與2.3.2.1分支中的其他陽(yáng)性參考血清幾乎均呈低反應(yīng)。A/Environment/Qinghai/XN02032/2013病毒與所有參考血清都沒(méi)有交叉反應(yīng)，通過(guò)隨后的基因序列分析提示其屬于clade 7.2(見(jiàn)2.3部分)。

2.3高致病性H5N1亞型禽流感病毒HA基因進(jìn)化樹(shù)分析選取GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)H5N1亞型clade 2.3.2.1、clade 2.3.4、clade 7.1和clade 7.2的HA序列43條與本研究分離毒株的序列共同構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)化樹(shù)中標(biāo)注黑色三角符號(hào)的病毒也用于抗原分析。HA基因進(jìn)化劃分10個(gè)分支(clade 0-9),分支下面有亞支，用四個(gè)層級(jí)的數(shù)字和字母組合。如clade 2.3.2.1之下分為clade 2.3.2.1a,b,c。本研究中的6個(gè)病毒(藍(lán)色斜體西文)屬于clade 2.3.2.1c亞支，與2009年青海湖地區(qū)野鳥(niǎo)中分離的病毒屬于同一進(jìn)化分支，同時(shí)與來(lái)自中國(guó)香港、日本、韓國(guó)、越南、保加利亞和蒙古國(guó)的病毒在同一分支上。而A/Environment/Qinghai/XN02032/2013(圖中以綠色斜體西文表示)在進(jìn)化上屬于clade 7.2分支。近期我國(guó)2009年廣西和2010年湖北人感染病例分離的H5N1病毒分屬于clade 2.3.2.1b和clade 2.3.2.1a，本研究分離的毒株與其均不在同一分支。

黑色三角型為世界衛(wèi)生組織推薦的疫苗候選株圖1　高致病性H5N1亞型禽流感病毒血凝素基因進(jìn)化分析Black triangles represent candidate influenza vaccine viruses recommended by WHO Fig.1　Phylogenic analysis of HA gene of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses

2.4高致病性H5N1亞型禽流感病毒NA基因進(jìn)化樹(shù)分析選取GenBank內(nèi)HA基因分屬于clade 2.3.2.1、clade 2.3.4、clade 7.1和clade 7.2毒株的神經(jīng)氨酸酶(NA)基因序列40條與7條分離毒株的序列進(jìn)行比較。NA基因進(jìn)化沒(méi)有像HA基因進(jìn)化那樣劃分10個(gè)分支(clade 0-9)，這種針對(duì)HA基因進(jìn)化的分類方式不適用于NA基因。在NA基因進(jìn)化上本研究中的7個(gè)毒株也明顯地分成兩個(gè)分支，其中6個(gè)毒株和clade 2.3.2.1病毒在一起。而A/Environment/Qinghai/XN02032/2013與clade 7.2病毒在一起。

圖2　高致病性H5N1亞型禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因進(jìn)化分析Fig.2　Phylogenic analysis of NA gene of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses

3討論

2005年以來(lái)在中國(guó)大陸能夠感染人的高致病性H5N1亞型禽流感病毒包括clade 2.3.4, clade 2.3.2和clade 7病毒株。2005年青海湖地區(qū)野鳥(niǎo)感染并引起大量死亡的病毒是clade 2.2 分支的病毒，這類病毒在中國(guó)大陸沒(méi)有造成人感染，但是它卻傳到了亞洲、歐洲、非洲等國(guó)家并且進(jìn)一步進(jìn)化。目前在西亞的以色列，約旦河西岸、加沙地帶的禽類中流行，引起埃及人間的感染[5]。本研究在青海湖周邊野鳥(niǎo)及家禽環(huán)境相關(guān)標(biāo)本中仍然未發(fā)現(xiàn)此分支病毒。

禽流感監(jiān)測(cè)通常通過(guò)病毒的抗原性和基因特性分析來(lái)了解病毒的進(jìn)化和變異情況。而病毒的抗原性分析有賴于參考病毒和參考血清。高致病性禽流感H5N1進(jìn)化復(fù)雜，多個(gè)分支病毒出現(xiàn)，使病毒的抗原性發(fā)生變化。及時(shí)更新參考毒株和參考血清對(duì)病毒病原學(xué)監(jiān)測(cè)意義重大。本研究中，6株病毒與2.3.2.1分支中A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010有最高的血凝抑制效價(jià)，提示是clade 2.3.2.1類似株。但是由于沒(méi)有特異的抗clade 2.3.2.1c血清因此無(wú)法進(jìn)一步細(xì)分。而A/Environment/Qinghai/XN02032/2013病毒與所有參考血清都沒(méi)有交叉反應(yīng)，無(wú)提示作用，只能依賴基因序列分析的結(jié)果。

近年來(lái)，高致病性禽流感H5病毒在中國(guó)的流行呈現(xiàn)三個(gè)優(yōu)勢(shì)毒株分支，分別為clade 2.3.2、clade 2.3.4和clade 7.2。在各自的分支下面抗原性和基因特性也是多樣的。各分支間，高致病性與低致病性病毒間，以及與不同NA亞型之間的重配時(shí)有發(fā)生。如H5N6病毒在中國(guó)導(dǎo)致家禽間暴發(fā)并且有致死性人感染病例報(bào)道[7]。H5N8病毒由韓國(guó)日本傳到歐洲和北美。這種H5亞型與不同NA亞型間的重配大多發(fā)生在clade 2.3.4的病毒。2012-2014年間在我國(guó)免疫過(guò)的家禽中分離到了免疫逃逸的重配的高致病性的H5N2病毒。這類病毒分屬于clade 7.2和clade 2.3.4與低致病性禽流感H9N2的重配病毒[8]。這種復(fù)雜的流行情況給包括中國(guó)在內(nèi)的全球公共衛(wèi)生帶來(lái)巨大考驗(yàn)。使疫情應(yīng)對(duì)和防控策略的制定變得更為復(fù)雜。為了應(yīng)對(duì)可能由此引起的流感大流行，一系列疫苗儲(chǔ)備株被研制成功，隨著該類病毒抗原性的變化儲(chǔ)備疫苗組分被實(shí)時(shí)更新。同時(shí)為了滿足監(jiān)測(cè)的要求，還應(yīng)及時(shí)更新各亞系的代表病毒及其參考血清。

青海湖因其獨(dú)特的地理位置以及曾經(jīng)暴發(fā)過(guò)野鳥(niǎo)的高致病性禽流感疫情使這一地區(qū)成為公共衛(wèi)生關(guān)注的區(qū)域。加強(qiáng)這一地區(qū)野鳥(niǎo)及家禽相關(guān)環(huán)境的監(jiān)測(cè)可以了解高致病性禽流感毒株的起源、進(jìn)化、傳播以及對(duì)可能產(chǎn)生的流感大流行毒株的潛在性加以評(píng)估。

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通信作者：舒躍龍， Email：yshu@cnic.org.cn

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.002

基金項(xiàng)目：973課題“重要病毒在不同宿主中的復(fù)制機(jī)制”(2011CB504704)

(收稿日期：2015-10-02)

Characteristics of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses isolated from poultry related environments of surrounding areas of Qinghai Lake

DongJie,DongLibo,ZhangYe,BoHong,HuangWeijuan,WangDayan,ShuYuelong

KeyLaboratoryforMedicalVirology，ChineseNationalInfluenzaCenter，NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention，Beijing102206，ChinaCorrespondingauthor:ShuYuelong，Email：yshu@cnic.org.cn

【Abstract】ObjectiveTo understand the antigenic and genetic characteristics of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses isolated from poultry related environments of surrounding areas of Qinghai Lake.MethodsPoultry and wild birds related environments from surrounding areas of Qinghai lake were collected and handled. Viruses were isolated with embryonated chicken eggs. The virus subtyping was performed by real-time RT-PCR. The highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses were chosen to conduct next generation sequencing and hemagglutination inhibition (HI) assay.ResultsIn total of 19 H5N1 virus strains were isolated, they were all from poultry related environments and collected in January-March of year 2013. Seven representative highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses were sequenced and analyzed for antigenicity. According to phylogenetic analysis of HA gene, 6 viruses were belong to clade 2.3.2.1c except A/Environment/Qinghai/XN02032/2013 which belongs to clade 7.2. Antigenic analysis showed that 6 viruses were antigenically similar to A/Barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010, while A/Environment/Qinghai/XN02032/2013 presented low reaction with all reference antisera.ConclusionsThe existence of highly pathogenic avian influenza H5N1viruses in poultry related environments of surrounding areas of Qinghai Lake was confirmed. The status of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses with evolution diversity emphasized the necessary of strengthening the avian influenza surveillance in these areas.

【Key words】Highly pathogenic avian influenza; H5N1 subtype; Phylogenetic analysis; Antigenic analysis