離子交換色譜法測定利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸鹽

殷勤紅劉小龍

（1昆明積大制藥股份有限公司，云南 昆明 650106；2昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，650224）

離子交換色譜法測定利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸鹽

殷勤紅1，2劉小龍1

（1昆明積大制藥股份有限公司，云南 昆明 650106；2昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，650224）

目的：在陰離子型交換柱上以鄰苯二甲酸氫鉀緩沖鹽為流動相可同時測定利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸鹽。方法：采用高效液相色譜法，Waters IC-Pak柱（4.6 mm×50 mm，5 μm），流動相為鄰苯二甲酸氫鉀緩沖鹽；柱溫30℃；進樣量10 μL；流速0.6 mL/min；檢測波長290 nm。結(jié)果：磷酸鹽和亞磷酸鹽的保留時間分別為7.8 min和9.8 min，該方法線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，精密度和準(zhǔn)確度高，平均回收率分別為97.7% 和100.8%。結(jié)論：本方法操作簡便，準(zhǔn)確可靠，專屬性強，重現(xiàn)性好。適用于利塞膦酸鈉片中磷酸鹽和亞磷酸鹽的檢測。

利塞膦酸鈉片；磷酸鹽；亞磷酸鹽；離子交換色譜法

利塞膦酸鈉［1-2］是第三代雙膦酸鹽類藥物，用于婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和長期糖皮質(zhì)激素治療導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥的防治，利塞膦酸鈉能緊密地吸附在骨質(zhì)主要成分羥磷灰石的表面，抑制破骨細(xì)胞對骨質(zhì)的吸收，同時也通過干擾破骨細(xì)胞附著，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的調(diào)亡。由于在利塞膦酸鈉原料合成過程中使用了亞磷酸，且其水解產(chǎn)物為亞磷酸鹽，經(jīng)空氣氧化成為磷酸鹽；同時作為利塞膦酸鈉合成過程中產(chǎn)生的磷酸鹽和亞磷酸鹽，極易引起胃腸道等不良反應(yīng)，為此在生產(chǎn)利塞膦酸鈉片的過程中需要控制這兩種磷酸鹽的含量。為了嚴(yán)格控制本品的質(zhì)量，本文采用IC-Pak為色譜柱的分析方法來檢測磷酸鹽和亞磷酸鹽，為該藥提供了一種新的可靠的分析手段。

1儀器與藥品

SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀（LC-20AT型泵，SPD-20A型紫外檢測器，SPD-M20A型二極管陣列檢測器，SIL-20AC型自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20Avlite系統(tǒng)控制器，LC solution色譜工作軟件）。鄰苯二甲酸氫鉀（天津市化學(xué)試劑研究所，批號：20080506）、一水磷酸二氫鈉（Sigma-Aldrich Co.LLC，批號：S9638-25）、五水亞磷酸鈉（Meryer Chemical Technology Co.，Ltd.，批號：68927403）。利塞膦酸鈉片（昆明積大制藥股份有限公司，規(guī)格35 mg，批號：080101，100105，101002）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

參考美國藥典（USP38-NF33）中Foscarnet Sodium［3］質(zhì)控項目“Limit of phosphate and phosphite”的色譜條件，本方法選擇的色譜條件為：色譜柱為Waters IC-Pak（4.6 mm×50 mm，5 μm），流動相為鄰苯二甲酸氫鉀緩沖鹽（稱取0.1 g鄰苯二甲酸氫鉀，用水溶解，再加入2.5 mL的1 mol/L硝酸，并用水稀釋至1 000 mL），流速0.6 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30℃；檢測波長290 nm。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液的配制精密稱取一水磷酸二氫鈉適量，用水溶解并制成每1 mL含0.28 mg的磷酸二氫鈉儲備液。精密稱取五水亞磷酸鈉適量，用水溶解并制成每1 mL含0.43 mg的亞磷酸鈉儲備液。分別移取1 mL的磷酸二氫鈉儲備液和亞磷酸鈉儲備液至 25 mL量瓶中，用水稀釋至刻度。

2.2.2供試品溶液的配制取10片，研細(xì)，精密稱取適量，用水溶解并配制成每1 mL含2.4 mg的溶液（以利塞膦酸鈉計）。

2.3專屬性

分別取空白溶劑、輔料、對照溶液、供試品溶液、供試品加標(biāo)溶液各10 μL進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶劑和輔料均不干擾測定，對照品溶液、供試品加標(biāo)溶液中磷酸鹽和亞磷酸鹽的分離度均不小于2.0，專屬性符合要求。見圖1。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取磷酸二氫鈉儲備液0.2，1.0，1.6，2.0，

2.4，3.0 mL，分別置50 mL容量瓶中，對應(yīng)加入亞磷酸鈉儲備液 0.2，1.0，1.6，2.0，2.4，3.0 mL，加水稀釋至刻度，搖勻即得10%，50%，80%，100%，120%，150%的線性溶液，照上述測定方法，精密量取上述線性溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以磷酸鹽、亞磷酸鹽的峰面積對其濃度進行線性回歸，計算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r，并繪出線性圖，見圖2和圖3。磷酸鹽的典型回歸曲線方程為：

A空白溶液；B空白輔料；C對照品；D供試品（101002）；E加標(biāo)供試品；1磷酸鹽；2亞磷酸鹽圖 1　磷酸鹽和亞磷酸鹽專屬性HPLC圖

Y=-1 824.2X+105.7（r=0.999 7），

亞磷酸鹽的典型回歸曲線方程為：

Y=-1 160.7X+44.6（r=0.999 1）。

結(jié)果顯示，磷酸鹽在1.14～17.08 μg/mL濃度內(nèi)線性關(guān)系良好，亞磷酸鹽在1.77～ 24.49 μg/mL濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2　磷酸鹽線性關(guān)系

圖3　亞磷酸鹽線性關(guān)系

2.5準(zhǔn)確度

精密稱取含量測定項下粉末250 mg，分別用50%，100%，150%的線性溶液溶解并制成每1 mL中約含2.4 mg的溶液，即得標(biāo)示量分別為50%， 100%，150%的供試品加標(biāo)溶液，照磷酸鹽和亞磷酸鹽測定方法，分別測定樣品中磷酸鹽和亞磷酸鹽的含量，并計算出回收率。

磷酸鹽和亞磷酸鹽的準(zhǔn)確度見表1和表2。磷酸鹽和亞磷酸鹽的平均回收率分別為97.7%和100.8%。

表1　磷酸鹽回收率結(jié)果

表2　亞磷酸鹽回收率結(jié)果

2.6穩(wěn)定性

取對照溶液，分別于配制后室溫放置0，2，4，8，16 h取樣檢測，測定磷酸鹽、亞磷酸鹽峰面積和RSD。磷酸鹽和亞磷酸鹽在室溫放置16 h后，溶液中磷酸鹽、亞磷酸鹽峰面積RSD分別為0.30%，1.41%，說明溶液在室溫放置16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7定量限和檢測限

取對照溶液進行逐級稀釋，照磷酸鹽和亞磷酸鹽檢測方法進行測定，記錄磷酸鹽峰和亞磷酸鹽峰信噪比約為10∶1和3∶1時的色譜圖，此時所對應(yīng)的濃度即為磷酸鹽和亞磷酸鹽的定量限和檢測限。磷酸鹽、亞磷酸鹽的定量限分別為0.031%，0.031%，磷酸鹽、亞磷酸鹽的檢測限分別為0.015%，0.015%。

2.8精密度

按照準(zhǔn)確度試驗中100%的供試品加標(biāo)溶液，配制6份樣品，精密量取上述溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。6份供試品加標(biāo)溶液的磷酸鹽和亞磷酸鹽的RSD分別為1.7%和2.3%，表明本方法的精密度良好，符合定量分析要求。

2.9樣品測定

取3批樣品，照上述方法測定樣品中磷酸鹽和亞磷酸鹽的含量，測定結(jié)果見表3。

表3　樣品測定結(jié)果

3討論

過去常用的磷酸鹽測定方法，如比色法［4］、薄層色譜法［5］，需要選擇合適的展開劑，還需要加顯色劑，方法重現(xiàn)性差，難以用作定量分析；同時也有高效液相色譜測定方法［6-7］，但需利用特殊類型的電導(dǎo)檢測器。

對流動相離子強度進行了篩選，發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸氫鉀的量在0.92～ 1.07 g范圍內(nèi)，磷酸鹽和亞磷酸鹽峰峰形良好，分離度滿足定量測定要求；倘若鄰苯二甲酸氫鉀的用量超出1.07 g，磷酸鹽和亞磷酸鹽峰將與其他陰離子色譜峰出現(xiàn)共淋洗現(xiàn)象并導(dǎo)致色譜峰重疊；倘若鄰苯二甲酸氫鉀的用量低于0.92 g，磷酸鹽和亞磷酸鹽峰之間又無法有效洗脫和分離。隨著流動相中離子強度的增強或減弱，陰離子在色譜柱固定相中洗脫能力和洗脫速率也將得以增強或減弱。

采用二極管陣列檢測器（PDA）對對照品溶液中的磷酸鹽和亞磷酸鹽進行檢測并提取磷酸鹽和亞磷酸鹽色譜峰在200～ 400 nm波長掃描圖，表明磷酸鹽和亞磷酸鹽色譜峰在247 nm和278 nm波長處有最大負(fù)吸收值；同時對比研究288，290，292 nm不同檢測波長條件下的對照品溶液，發(fā)現(xiàn)磷酸鹽和亞磷酸鹽峰面積RSD均小于2.0%，表明 290 nm可作為磷酸鹽和亞磷酸鹽定量測定的檢測波長。

本實驗方法測定利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸，僅需常規(guī)的紫外檢測器，具有分離效果好、檢測靈敏等優(yōu)點，方法簡便、快速，可用于利塞膦酸鈉片中的磷酸鹽和亞磷酸鹽的測定。

［1］黃海英.利塞膦酸鈉臨床研究進展［J］.中國新藥雜志，2002，11 （4）：281-284.

［2］伍鳳莉，吳宜勇，史紅巖.利塞膦酸鈉防治絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的對照試驗［J］.中國新藥雜志，2006，15（8）：630-633.

［3］The U.S.Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopeia 38-The National Formulary 33［S］.Baltimore，MD：United Book Press，Inc.，2015.

［4］ Barnabè N，Butler M.The effect of glucose and glutamine on the intracellular nucleotide pool and oxygen uptake rate of a murine hybridoma［J］.Cytotechnology，2000，34（1-2）：47-57.

［5］ Paredes C，Sanfeliu A，Cardenas F，et al.Estimation of the intracellular fluxes for a hybridoma cell line by material balances ［J］.Enzyme and Microbial Technology，1998，23（3-4）：187-198.

［6］馬仕珉，石松安，季晶晶，等.高效液相色譜法測定唑來膦酸中的磷酸鹽和亞磷酸鹽［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，19（4）：40-42.

［7］ 何擁軍，謝敏浩，羅世能，等.離子交換色譜法測定因卡膦酸二鈉膠囊中的磷酸鹽和亞磷酸鹽［J］.華東理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，31（6）：772-774.

Determination of Phosphate and Phophite in Risedronate Sodium Tablets by IE-HPLC

Yin Qinhong1，2，Liu Xiaolong1（1 Kunming Jida Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yunnan Kunming 650106，China；2 Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，650224）

Objective：To determine phosphate and phophite in risedronate sodium tablets simultaneously by anion exchange column chromatography using potassium hydrogen phthalate buffer saline as a mobile phase.Methods：Samples were determined by HPLC on the Waters IC-Pak column（4.6 mm×50 mm，5 μm）using potassium hydrogen phthalate buffer saline as a mobile phase.The column temperature was at 30℃ and the sample loading was 10 μL.The flow rate was 0.6 mL/min，while the UV detection wavelength was 290 nm.Results：The resolution time of phosphate and phophite were 7.8 and 9.8 min，while the mean recovery rates were 97.7%and 100.8%，respectively.The linear correlation coefficient of the method was more than 0.999，while precision and accuracy were high.Conclusion：The method is simple，accurate and reliable，with high specificity and reproducibility，which is suitable for the determination of phosphte and phosphite in risedronate sodium tablets.

Risedronate Sodium Tablets；Phosphte；Phosphite；IE-HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.06.004

殷勤紅，男，工程師。主要從事新藥開發(fā)工作。通訊作者E-mail：hawkyin2008@126.com

2016-02-16）