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    牛血紅蛋白催化香豆素體系熒光光度法測(cè)定過氧化氫

    2016-08-08 00:49:39單雅琦陳永寧張容琿唐寧莉
    關(guān)鍵詞:熒光法香豆素過氧化氫

    單雅琦,陳永寧,張容琿,唐寧莉

    (桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西 桂林 541004)

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    牛血紅蛋白催化香豆素體系熒光光度法測(cè)定過氧化氫

    單雅琦,陳永寧,張容琿,唐寧莉

    (桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西 桂林541004)

    摘要:在pH 3.5的NaOH-H2SO4緩沖溶液中,牛血紅蛋白催化H2O2氧化香豆素生成7-羥基香豆素,導(dǎo)致體系的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。該氧化產(chǎn)物在456 nm處有最大熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)表明:在456 nm處,體系的熒光增加值ΔF與H2O2的濃度在3.940×10-7~7.880×10-5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r為0.998 5,檢出限為1.25×10-8mol/L。據(jù)此建立了一種簡(jiǎn)單、靈敏度高的檢測(cè)水樣中痕量H2O2的熒光新方法。該方法已用于雨水及消毒液中H2O2的測(cè)定,結(jié)果滿意。

    關(guān)鍵詞:過氧化氫;牛血紅蛋白;香豆素;熒光法

    過氧化氫普遍存在于自然生態(tài)體系中,是生物和環(huán)境系統(tǒng)中存在的一種重要中間產(chǎn)物,在食品科學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、生物、環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。它是大氣中氫過氧自由基(HOO·)濃度的指標(biāo), 還可與還原劑(如Fe2+)反應(yīng)導(dǎo)致羥基自由基(HO·)的形成,HO·是大氣和地表水中最重要的氧化劑成分之一。許多研究表明,過氧化氫可以氧化二氧化硫,從而導(dǎo)致大氣中硫酸的形成。因此,對(duì)過氧化氫的檢測(cè)具有重要意義。

    到目前為止, 已經(jīng)有很多方法用于檢測(cè)過氧化氫,例如分光光度法[1]、 熒光光度法[2-3]、 色譜法[4-5]、 化學(xué)發(fā)光法[6-7]、 電化學(xué)法[8-9]、 原子吸收光譜法[10]、 共振散射光譜法[11-12]、 滴定法[13]等。 其中熒光分析法是一種具有高靈敏度、 高選擇性的方法, 并且酶催化體系測(cè)定過氧化氫具有靈敏度高、 檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。 由于血紅蛋白具有鐵卟啉輔基(天然過氧化物酶(HRP)的活性中心), 并且有三維空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 因此具有催化活性, 可用于酶催化反應(yīng)體系中。 筆者以牛血紅蛋白(Hb)為過氧化物模擬酶,催化H2O2氧化香豆素生成7-羥基

    香豆素,該氧化產(chǎn)物在456 nm處產(chǎn)生強(qiáng)熒光,據(jù)此建立了一種測(cè)定痕量H2O2的新方法。

    1實(shí)驗(yàn)部分

    1.1主要儀器

    Cary Eclipse熒光光度計(jì)(美國(guó) VARIAN);PHS-3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);501型超級(jí)恒溫器(上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

    1.2主要試劑

    牛血紅蛋白工作液(Hb, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),準(zhǔn)確稱取0.064 5 g摩爾質(zhì)量為64 500 g/mol的牛血紅蛋白,用水溶解配成濃度為1.0×10-5mol/L的Hb工作液,于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。H2O2(汕頭市西隴化工廠有限公司)儲(chǔ)備溶液, 取2 mL 30% H2O2稀釋至500 mL,用高錳酸鉀法標(biāo)定得準(zhǔn)確濃度為3.94×10-2mol/L,于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。H2O2工作溶液,7.88×10-4mol/L,臨用前由儲(chǔ)備液稀釋得到。香豆素(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)溶液,4.0×10-4mol/L。NaOH-H2SO4緩沖溶液, pH 3.0~5.0,由0.2 mol/L NaOH與0.2mol/L H2SO4溶液按一定比例混合配成。HAc-NaAc緩沖溶液,pH 3.0~5.0, 由0.2 mol/L HAc與0.2 mol/L NaAc溶液按一定比例混合配成。Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液,pH 3.0~5.0,0.04 mol/L的HAc、H3BO3、H3PO4溶液等體積混合,然后用0.2 mol/L的NaOH溶液按一定比例混合配成。

    實(shí)驗(yàn)中所用到的試劑均為分析純,水均為二次去離子水。

    1.3實(shí)驗(yàn)方法

    在10 mL具塞比色管中,分別加入3.0 mL NaOH-H2SO4緩沖液(pH 3.5)、1.8 mL香豆素溶液、1.0 mL Hb溶液和一定量的H2O2工作液,用二次水定容至10 mL,搖勻,于50 ℃水浴中反應(yīng)60 min后, 以不加H2O2的溶液為試劑空白, 用1 cm石英比色皿,在熒光光度計(jì)上于激發(fā)波長(zhǎng)330 nm、發(fā)射波長(zhǎng)456 nm處測(cè)定加有過氧化氫溶液的熒光強(qiáng)度F和試劑空白的熒光強(qiáng)度F0,并計(jì)算熒光差值ΔF=F-F0。

    2結(jié)果與討論

    2.1體系的熒光光譜

    圖1為不同體系的熒光光譜:由曲線c可知香豆素本身的熒光強(qiáng)度很弱;由曲線a可知Hb本身沒有熒光;由曲線c和d可知,當(dāng)無(wú)Hb存在時(shí), H2O2可以氧化香豆素, 但反應(yīng)進(jìn)行很慢; 由曲線b和c可知, 體系在456 nm處的熒光強(qiáng)度基本不變, 所以香豆素與Hb基本不反應(yīng); 由曲線e可知, Hb對(duì)H2O2氧化香豆素的反應(yīng)具有催化作用, 香豆素-H2O2-Hb體系的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng), 最大發(fā)射波長(zhǎng)為456 nm, 最大激發(fā)波長(zhǎng)為330 nm。

    圖1 體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of the system 發(fā)射光譜:a—Hb; b—香豆素+Hb; c—香豆素; d—香豆素+H2O2; e—香豆素+H2O2+Hb;激發(fā)光譜:f—香豆素+H2O2; g—香豆素+H2O2+Hb

    2.2實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

    2.2.1緩沖溶液的選擇比較了不同pH值的NaOH-H2SO4、HAc-NaAc和B-R 3種緩沖液對(duì)體系ΔF值的影響。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在pH 3.5的NaOH-H2SO4緩沖液中,ΔF值最大,反應(yīng)的靈敏度最高。所以選擇pH 3.5的NaOH-H2SO4緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)。對(duì)NaOH-H2SO4緩沖液的用量進(jìn)行了考察,結(jié)果表明:當(dāng)緩沖液用量為0~2.5 mL時(shí),體系的ΔF值隨緩沖液用量的增加而逐漸增大;當(dāng)用量大于2.5 mL時(shí),體系的ΔF值達(dá)到最大并基本趨于穩(wěn)定,故實(shí)驗(yàn)選擇加入pH 3.5的NaOH-H2SO4緩沖溶液3.0 mL。

    2.2.2溫度的選擇由溫度對(duì)反應(yīng)ΔF值的影響可知, 在12~45 ℃,體系的ΔF值隨溫度的升高而增大, 當(dāng)溫度大于45 ℃后(45~60 ℃), ΔF值達(dá)到最大并穩(wěn)定。因?yàn)镠b是一種蛋白質(zhì),所以溫度過高易使Hb失活,也易使H2O2分解,因此選擇在50 ℃進(jìn)行反應(yīng)。

    2.2.3酶催化時(shí)間的選擇研究了酶催化時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系ΔF值的影響:在10~50 min,體系的ΔF值隨時(shí)間的增加而增大,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為50 min時(shí),ΔF值達(dá)到最大,繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間ΔF值保持穩(wěn)定,所以選擇反應(yīng)進(jìn)行60 min時(shí)進(jìn)行測(cè)定。

    2.2.4香豆素用量實(shí)驗(yàn)表明:當(dāng)香豆素的用量在0.5~1.8 mL之間時(shí),ΔF值隨香豆素用量的增加而增大;用量大于1.8 mL后,體系的ΔF值隨著香豆素用量的增加而減小,所以選擇ΔF值最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的香豆素用量1.8 mL。

    2.2.5Hb用量Hb在反應(yīng)中作催化劑,其用量對(duì)體系ΔF值的影響較明顯。當(dāng)Hb用量為1.0 mL時(shí),催化效果最明顯,ΔF值達(dá)到最大值,所以在反應(yīng)中加入Hb 1.0 mL。

    2.3共存物質(zhì)的影響

    當(dāng)H2O2濃度為3.94×10-5mol/L、相對(duì)誤差≤± 5%時(shí),干擾物質(zhì)的允許倍數(shù)為:Mg2+(2 000);SO42-(1 000); Zn2+(500); K+(200); Al3+(100); Ca2+、 Na+、 Sr2+、 Co2+、 Pb2+、 NH4+、 NO3-、 葡萄糖、 SO32-、 尿素(20); Mn2+(10); Vc、 Ni2+(5); CO32-(2); Cu2+、NO2-、 EDTA(1); C2O42-(0.5); Fe3+(0.05)。

    2.4工作曲線及檢出限

    在上述選定的實(shí)驗(yàn)條件下,繪制不同濃度H2O2與對(duì)應(yīng)ΔF值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由所得標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,H2O2濃度在3.940×10-7~7.880×10-5mol/L范圍內(nèi)與體系的ΔF值存在良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為:ΔF=6.094×106c+2.780(c為H2O2的濃度, 單位為mol/L),相關(guān)系數(shù)r=0.998 5。平行測(cè)定13次試劑空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差S為0.025 3,由此計(jì)算得到檢出限為1.25×10-8mol/L(DL=3S/K)。與已經(jīng)報(bào)道的以牛血紅蛋白為催化劑的相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]相比,本方法檢出限低、靈敏度高(表1)。

    2.5樣品測(cè)定

    在桂林市雁山區(qū)采集新鮮雨水,然后對(duì)雨水樣品進(jìn)行預(yù)處理。首先將雨水靜置10 min,然后用濾紙過濾,取濾液進(jìn)行樣品測(cè)定。取雨水樣品1.0 mL按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(取雨水1.0 mL, 加H2O2標(biāo)準(zhǔn)工作液0.5 mL),結(jié)果如表2所示。

    表1 測(cè)定H2O2的方法比較Table 1 Comparison of some assays for H2O2 determination μmol/L

    另取標(biāo)示量為3%的醫(yī)用雙氧水消毒液(廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司)1 mL,逐級(jí)稀釋10 000倍作為待測(cè)液。取0.5 mL 待測(cè)液按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定并做加標(biāo)回收(表2)。

    表2 樣品分析結(jié)果及回收率(n=5)Table 2 Analytical results of samples and recovery(n=5)

    3結(jié)論

    以牛血紅蛋白為模擬酶,催化H2O2氧化香豆素生成熒光產(chǎn)物7-羥基香豆素,體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),據(jù)此建立了一種靈敏的測(cè)定痕量H2O2的新方法。方法的檢出限為1.25×10-8mol/L,測(cè)定H2O2的線性范圍是3.940×10-7~7.880×10-5mol/L。該方法可用于雨水及消毒液中H2O2含量的測(cè)定。

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    文章編號(hào):1674-9057(2016)02-0333-04

    doi:10.3969/j.issn.1674-9057.2016.02.023

    收稿日期:2015-03-24

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 21165008)

    作者簡(jiǎn)介:?jiǎn)窝喷?1989— ),女,碩士,分析化學(xué)專業(yè)。

    通訊作者:唐寧莉,教授,ysshiyanshi@163.com。

    中圖分類號(hào):O657.3

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    Fluorometric determination of hydrogen peroxide by bovine hemoglobin catalytic coumarin system

    SHAN Ya-qi, CHEN Yong-ning, ZHANG Rong-hui, TANG Ning-li

    (College of Chemistry and Bioengineering,Guilin University of Technology,Guilin 541004,China)

    Abstract:In pH 3.5 NaOH-H2SO4 buffer solution, with bovine hemoglobin as catalyst, coumarin was oxidized to produce 7-hydroxycoumarin by hydrogen peroxide, which had strong fluorescence in acid solution. At the length of maximum emission 456 nm, the increased value of fluorescence intensity(ΔF)was linear to the concentration of hydrogen peroxide in the range of 3.940×10-7- 7.880×10-5mol/L, with a correlation coefficient of 0.998 5 and a detection limit of 1.25×10-8mol/L. Based on this, a simple and highly sensitive fluorometric method was proposed for the determination of trace H2O2. This new fluorometric method can be applied to the analysis of H2O2 in rainwater and disinfectant fluid samples with satisfactory results.

    Key words:hydrogen peroxide;bovine hemoglobin;coumarin;fluorometry

    引文格式:?jiǎn)窝喷?陳永寧,張容琿,等.牛血紅蛋白催化香豆素體系熒光光度法測(cè)定過氧化氫[J].桂林理工大學(xué)學(xué)報(bào),2016,36(2):333-336.

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