MicroR N A-132在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義

趙繼明，彭健

（中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

MicroR N A-132在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義

趙繼明，彭健

（中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

目的探討M i croRNA-132（m i R-132）在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義。方法實時逆轉(zhuǎn)錄定量PC R和原位雜交分析結(jié)腸癌組織中m i R-132的表達情況。分析m i R-132表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后之間的相關(guān)性。結(jié)果m i R-132在結(jié)腸癌組織中的表達明顯低于正常結(jié)腸黏膜組織（P＜0.01），m i R-132低表達與結(jié)腸癌分期更晚有關(guān)。多元回歸分析表明，m i R-132低表達與結(jié)腸癌患者生存期更短有關(guān)（P＜0.01），m i R-132是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。結(jié)論m i R-132表達下調(diào)能夠促進結(jié)腸癌進展，是預(yù)測結(jié)腸癌患者預(yù)后的可靠指標，m i R-132也具有成為結(jié)腸癌靶向治療靶點的潛力。

結(jié)腸癌；臨床病理參數(shù)；m i R-132家族；預(yù)后

結(jié)腸癌是全球常見的發(fā)病率和致死率都很高的惡性消化道腫瘤［1］。研究證明結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多階段、多因素參與的過程。結(jié)腸癌的發(fā)生與飲食、環(huán)境等因素密切相關(guān)，并且，結(jié)腸癌的發(fā)生涉及到遺傳突變，包括癌基因激活、抑癌基因失活、錯配修復基因突變及基因過度表達等。

M i croRNAs（m i RNAs）是在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的一類進化上保守、單鏈小分子非編碼RNAs（17～25個核苷酸）。m i RNAs通過與其靶信使RNA轉(zhuǎn)錄子3'非翻譯區(qū)互補結(jié)合調(diào)控基因表達［2］。m i RNA-132在肺癌［3］和胰腺內(nèi)分泌腫瘤［4］中表達降低，而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤［5］和胃癌中［6］的表達升高。不同腫瘤中m i RNA表達水平不同，提示m i RNAs在腫瘤細胞中功能不同，且m i RNA調(diào)控其潛在靶基因的方式十分復雜。目前尚未見m i R-132在結(jié)腸癌中作用研究的報道，本研究主要分析m i R-132表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1研究對象

164例結(jié)腸癌組織標本均為湘雅醫(yī)院2009年1 月-2012年12月結(jié)腸癌病例，均經(jīng)手術(shù)治療，手術(shù)前未經(jīng)放化療等其他治療，經(jīng)病理確診均為結(jié)腸癌，患者年齡28～64歲，中位年齡（49±2.4）歲。平均隨訪期為38.1個月（6～58個月）。患者定期接受身體及超聲檢查，如有必要進行CT掃描?？偵嫫谑侵甘中g(shù)至死亡間隔時間。

1.2主要試劑

RNA提取試劑盒和Taqm an m i RNA檢測試劑盒均購自美國Appl i ed Bi osyst em公司，DEPC購自美國Si gm a公司，乙醇、氯仿和異丙醇均購自北京化學試劑公司。

1.3R N A提取及逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

應(yīng)用RNA提取試劑盒從結(jié)腸癌組織中提取RNA，采用Taqm an m i RNA試劑盒檢測成熟體m i RNA-132的表達水平。內(nèi)參校正：實時逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-t i m e reverse t ranscri pt i onquant i t at i vepol ym erasechai nrect i on，Real-t i m e RT-qPCR）。每個樣品加樣量約為10 ng，由于受到RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，每個樣品的等體積cDNA含量并不完全相同，為了校正此誤差，試驗中以RNU6為內(nèi)參。采用二步法檢測m i RNA-93相對表達量。第1步，用莖環(huán)引物合成互補DNA。m i RNA逆轉(zhuǎn)錄采用10 ng總RNA 15μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，在PCR管中加入逆轉(zhuǎn)錄混合液7μl，濃度為2 ng/μl的總RNA 5μl，3μl特異性逆轉(zhuǎn)錄引物。輕輕混勻，在冰上放置5 m i n，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)16℃30 m i n，42℃保溫30 m i n，85℃保溫5 m i n，4℃保溫5 m i n。第2步，采用20μl反應(yīng)體系在ABI7300實時PCR儀中反應(yīng)，反應(yīng)體系為2×的Taq m an uni ve RsAl PCR通用混合液 10μl，20×的Taqm an m i RNA特異引物1μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 4μl，加無RNA酶水5μl補充至體積20μl。循環(huán)條件為94℃預(yù)變性10 m i n，95℃變性15 s，60℃退火60 s，擴增40個循環(huán)后觀察分析結(jié)果。所有的實時定量反應(yīng)包括無模板的對照反應(yīng)，均按ABI7300實時PCR儀說明書進行，實驗中Ct檢測值在20～32之外的進行第2次重復檢測。應(yīng)用公式2-Δct計算m i RNA-93的相對表達量。

1.4原位雜交檢測結(jié)腸癌組織中m i R-132l的表達

結(jié)腸癌組織標本4 m m連續(xù)切片后，常規(guī)脫蠟脫水，H Cl于37℃反應(yīng)20 m i n增加組織通透性，4%多聚甲醛（0.1m ol/L PBS溶解）室溫條件下固定10 m i n，0.1 m ol/L TEA緩沖液Ⅰ［0.1 m ol/L三乙醇胺與乙酸酐混合液，濃度0.25%（體積比）］和TEA緩沖液Ⅱ［0.1 m ol/l，三乙醇胺與乙酸酐混合液，濃度0.5%（體積比）］雜交前處理以增加組織陽性雜交的強度。雜交：探針m i R-132用雜交液稀釋至20 nm ol，滴加于組織切片上，45℃水浴鍋內(nèi)雜交18 h。雜交后用TI-kS溶液沖洗3次，每次10m i n，封閉液封閉25m i n（封閉非特異的抗體結(jié)合位點）。雜交后采用Ant i-Di goxi geni n-POD檢測地高辛探針與m i RNA結(jié)合復合物，TSA放大系統(tǒng)增強原位雜交反應(yīng)的陽性信號，NBT/BCIP顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)，加核快紅復染3 m i n，中性樹膠封片。陽性對照和陰性對照：看家基因β-act i n的寡核苷酸探針做為每次雜交的陽性對照，不加探針的預(yù)雜交液做為每次實驗陰性對照。結(jié)果判斷：光學顯微鏡下對m i R-132在組織切片中每一組織點的表達進行綜合觀察判斷。①根據(jù)陽性染色強度判斷：細胞無染色為0分；細胞呈淺藍色記1分；細胞染成藍色并無背景染色，為中等陽性，記2分；細胞暈紫色，無背景著色，為強陽性，記3分。②根據(jù)陽性細胞數(shù)計分：無陽性細胞計0分；陽性細胞數(shù)≤30%計1分；30%～70%計2分；陽性細胞數(shù)＞70%計3分。取兩種計分結(jié)果的乘積，0分為陰性，1、2、3、4、6及9分為陽性。其中1、2分計作弱陽性（+），3、4分計作陽性（++），6分計作強陽性（+++），9分計作強陽性（++++）。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，LSD檢驗，比較m i R-132在結(jié)腸癌不同臨床分期和病理分級的中表達差異。癌組織和正常組織比較，用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1m i R N A-132在結(jié)腸癌組織中的表達水平

Real-t i m e R T-qPCR檢測結(jié)果表明，m i R-132在結(jié)腸癌組織中的表達（1.48±0.27）明顯低于正常結(jié)腸組織（4.64±1.21）差異有統(tǒng)計學意義（P=0.008）（見圖1A、B）。

本研究進一步采用原位雜交分析方法驗證了m i R-132在結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中的表達類型和細胞定位情況。原位雜交分析結(jié)果表明m i R-132主要表達于細胞核，而在正常結(jié)腸組織中呈強陽性表達（見圖2A、B和C）。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中m i R-132的表達降低與正常結(jié)腸組織表達差異有統(tǒng)計學意義，該結(jié)果與Real-t i m e RT-qPCR結(jié)果一致，m i R-132在結(jié)腸癌組織中的表達明顯低于正常結(jié)腸組織。

2.2m i R-132在結(jié)腸癌中表達降低與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

將m i R-132原位雜交檢測的中位值3.74作為164例結(jié)腸癌患者的分組閾值，其中m i R-132低表達組104例，高表達組60例，統(tǒng)計分析結(jié)果表明m i R-132低表達組腫瘤與分期和分級相關(guān)（見表1）。m i R-132表達與結(jié)腸癌的其他病理特征無關(guān)，如患者年齡、組織類型、腫瘤直徑、化療藥物抗性和腫瘤復發(fā)等。

2.3結(jié)腸癌中m i R-132表達降低的預(yù)后價值

Kapl an-M ei er生存曲線分析表明，低表達m i R-132的結(jié)腸癌患者與總生存期相關(guān)（見圖3）。此外，多元回歸分析表明m i R-132低表達（H R 23.74，95%CI：1.58，52.66，P=0.000）、TNM分期（H R 19.94，95%CI：1.27，42.85，P=0.000）和腫瘤組織分級（H R 16.23，95%CI：1.05，39.28，P=0.008）與總生存期相關(guān)（見表2）。多元COX回歸分析進一步校正其他預(yù)后因素，結(jié)果表明m i R-132是影響結(jié)腸癌患者的預(yù)后因子（見表3）。

圖1　m i R-132在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達差異

圖2　原位雜交檢測m i R-132在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達差異

表1　m i R-132表達與結(jié)腸癌臨床特征的關(guān)系

圖3　結(jié)腸癌患者中m i R-132表達的生存曲線

表3　多元回歸分析結(jié)腸癌患者的預(yù)后因素

表2　結(jié)腸癌中m i R-132表達降低的預(yù)后價值

3　討論

結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，且無特異性腫瘤標志物，大多數(shù)結(jié)腸癌患者診斷時已處于進展期，當結(jié)腸癌患者接受治療后，復發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的主要因素，由此導致結(jié)腸癌患者預(yù)后較差。最新研究結(jié)果顯示，與正常神經(jīng)元和胃組織相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤和胃癌組織中m i R-132表達上調(diào)［5-6］。此外，肺癌、膀胱癌、食管鱗癌、舌部鱗癌、子宮癌及睪丸癌等組織中亦有m i R-132表達下調(diào)，提示m i R-132作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用。人們試圖探討m i R-132在結(jié)腸癌患者預(yù)后中的價值，但到目前還沒有發(fā)現(xiàn)有價值的結(jié)論。本研究結(jié)果表明，m i R-132在結(jié)腸癌中表達明顯下降。此外，m i R-132表達降低還與結(jié)腸癌患者侵襲性臨床病理特征和預(yù)后差密切相關(guān)。Li u等［5］在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，m i R-132能夠作為胃癌患者預(yù)后因子。79例胃癌患者中，m i R-132在癌組織中的表達水平明顯高于相應(yīng)的正常組織。Set t y等在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，m i R-132在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達更高，且m i R-132過表達與患者預(yù)后差相關(guān)［6］。這兩項結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，造成結(jié)果不一致的原因目前尚不清楚，可能是因腫瘤類型、標本量大小及所采取的研究方法不同引起的。本實驗研究發(fā)現(xiàn)m i R-132表達在不同分期、分級結(jié)腸癌中存在明顯的差異表達，提示其表達的下調(diào)可能是結(jié)腸癌進展過程中的重要步驟。國內(nèi)學者楊秀芳等［7］研究m i R-132/212家族在肺癌中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌中過表達m i R-132能夠加快NSCLC細胞增殖，促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出原癌基因的特征；而李書軍等［8］發(fā)現(xiàn)m i R-132在食管鱗癌中的表達明顯降低，與食管癌的臨床分期以及預(yù)后相關(guān)，m i R-132表達水平可作為食管癌臨床分期、分級和預(yù)后的潛在指標。上述研究結(jié)果亦支持本實驗結(jié)果。根據(jù)以往研究結(jié)果m i R-132有可能發(fā)揮抑癌作用，也可能發(fā)揮促癌作用，具體發(fā)揮何種作用與腫瘤類型及腫瘤微環(huán)境有關(guān)。本研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中m i R-132呈低表達，且m i R-132低表達與分期更晚有關(guān)，提示m i R-132表達下調(diào)促進結(jié)腸癌的發(fā)展，因此筆者認為m i R-132在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用。

近來m i RNA家族被證實為腫瘤的有效標志物，并且是腫瘤細胞上皮表型的決定性因素［9］。m i R-132已被證實在多種人類腫瘤中表達下調(diào)，被認為是腫瘤細胞遷移和侵襲過程中EM T的負向調(diào)控因子。m i R-132也被認為是增強結(jié)腸癌化療敏感性或誘導腫瘤細胞死亡的新靶點［11］，而在一組卵巢腺癌細胞株內(nèi)或獲得性藥物抗性研究中發(fā)現(xiàn)m i R-132表達與紫杉醇和順鉑化療抗性有關(guān)。此外，還有多項研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中m i R-132表達明顯發(fā)生變化，但是這些研究結(jié)果多有相互沖突之處。部分研究屬于m i RNA表達譜特征分析，由于分析時采用的芯片平臺不一樣，可能導致部分結(jié)果差異。相比之下，本研究采用 Real-t i m e RT-qPCR和原位雜交法分析m i R-132在結(jié)腸癌中的表達情況，實驗結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中m i R-132表達明顯下降，而在原位雜交中進一步分析結(jié)腸癌組織中m i R-132的表達情況，結(jié)果亦表明m i R-132在結(jié)腸癌中的表達低于正常結(jié)腸組織。提示m i R-132在結(jié)腸癌組織中低表達。本研究還發(fā)現(xiàn)，m i R-132低表達組與分期和分級相關(guān)，提示m i R-132表達抑制與結(jié)腸癌惡性程度更高密切相關(guān)?？傊?，本實驗結(jié)果中m i R-132過表達抑制腫瘤進展，被認為是預(yù)測結(jié)腸癌患者生存的可靠生物標志物，m i R-132是進展期結(jié)腸癌患者潛在的有效治療靶點。

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（申海菊編輯）

Expression and roles of microRNA-132 in conlon carcinoma

Ji-ming Zhao，Jian Peng
（Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，China）

Objective To investigate the association of miR-132 expression with clinicopathological characteristics and overall survival in patients with colon cancer.Methods Expression levels of the miR-132 were detected using qRT-PCR andin situhybridization.Associations of miR-132 expression with clinicopathological factors and overall survival were statistically evaluated.Results The expression levels of miR-132 in the colon cancer tissues were significantly lower than those in the normal colon tissues，in line with the findings ofin situhybridization（P＜0.01）.In addition，the tumors with low miR-132 expression were more likely to have advanced clinical stage（bothP=0.006）and higher grade（P=0.01 and 0.02）.Moreover，univariate analysis showed that the colon cancer patients with low miR-132 expression had shorter overall survival（P＜0.01）. Multivariate statistical analysis further identified miR-132 as an independent prognostic factor for colon cancer （P＜0.01）.Conclusions miR-132 low-expression may promote the aggressive tumor progression and be recognized as a reliable marker to predict the survival in patients with colon cancer.The three miRNAs could be attractive therapeutic targets in patients with advanced-stage colon cancer.

colon cancer；clinicopathology；miR-132；prognosis

R 735.35

A

1005-8982（2016）05-0048-05

10.3969/j.i s sn.1005-8982.2016.05.010

2015-08-28

彭健，Tel：13607441906，E-m ai l：158924615@qq.com