香菜揮發(fā)油體外抑制Saos-2細胞生長與遷移*

賴家玲，付文垚，何欣，肖川云，曹俊

（江西省九江學院 1.臨床醫(yī)學院，2.藥學與生命科學學院，3.基礎醫(yī)學院，江西 九江 332000）

香菜揮發(fā)油體外抑制Saos-2細胞生長與遷移*

賴家玲1，付文垚2，何欣2，肖川云2，曹俊3

（江西省九江學院 1.臨床醫(yī)學院，2.藥學與生命科學學院，3.基礎醫(yī)學院，江西 九江 332000）

目的探討香菜揮發(fā)油對Saos-2腫瘤細胞株體外生長及遷移的影響。方法采用超聲波輔助醇提法制備香菜揮發(fā)油；M TT法檢測香菜揮發(fā)油對Saos-2細胞生長抑制作用；Trans w el l趨化小室檢測細胞遷移抑制作用；定量PC R檢測細胞內(nèi)P21C i p1/W af1、P27Ki p1、N M23H1和S100A4的表達變化。結(jié)果使用超聲輔助醇提法，香菜揮發(fā)油得率為0.424%；香菜揮發(fā)油可明顯抑制Saos-2細胞的生長與遷移，伴隨細胞內(nèi)P21 C i p1/W af1及P27Ki p1的升高及S100A4降低，顯示具有較強的抗成骨肉瘤活性。結(jié)論香菜揮發(fā)油可體外抑制Saos-2細胞生長及遷移，其可能機制與P21C i p1/W af1、P27Ki p1及S100A4有關。

香菜揮發(fā)油；抗腫瘤；P21C i p1/W af1；P27Ki p1；S100A4

香菜又名芫荽、胡荽、香荽等，屬傘形科芫荽屬。香菜營養(yǎng)豐富，并有強烈氣味，其莖葉常作為日常蔬菜和調(diào)香料。研究顯示香菜還具有多種藥理作用，其主要藥理成分包括揮發(fā)油及黃酮等，已知香菜揮發(fā)油具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤和促毛發(fā)生長等多種活性［1-4］。本研究采用超聲波輔助醇溶劑法制備香菜揮發(fā)油，探討其對人成骨肉瘤細胞株Saos-2的生長及遷移的作用，同時檢測胞內(nèi)抑癌基因P21Ci p1/W af1、P27Ki p1及腫瘤遷移相關基因NM23H1和S100A4含量的變化，從分子水平明確香菜揮發(fā)油抑制細胞生長及遷移的機制。

1　材料與方法

1.1材料

香菜（購自九江市超市），Saos-2細胞株（來自江西省系統(tǒng)生物醫(yī)學重點實驗室），槲皮素（購自美國 Si gm a公司），F(xiàn)BS（購自 H ycl one公司），RPM I 1640培養(yǎng)基（購自吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司），Transwel l cam ber（購于 Corni ng公司），噻唑藍（m et hyl t hi azol yl t et razol i um，M TT）（Am resco公司，由北京索萊寶分裝），GoScri pt Reverse Transcri pt i on Syst em（購自Prom ega公司），Tri zol（購自Invi t rogen公司），SYBR Prem i x Ex TaqⅡ（Tl i RNaseH Pl us）（購自TaKaRa公司）。

1.2儀器與設備

超聲波清洗機（南昌市化學儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市宇翔儀器有限公司），粉碎機（上海市亞榮生化儀器廠），重光IBE2000型倒置熒光顯微鏡（中國重慶光電儀器有限公司），5420-1型二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（日本Napco公司），Bi o-Rad 550型酶標儀（美國伯樂公司），ABI7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司），NanoDrop2000超微量分光光度計（美國賽默飛世爾公司）。

1.3方法

1.3.1香菜揮發(fā)油的制備香菜莖葉經(jīng)太陽照射6 h除去表面的水分，放入恒溫干燥箱中干燥24 h，粉碎后超低溫條件下保存。取粉末50 g放入500 m l的燒杯并加入200 m l無水乙醇。攪拌至粉末充分浸潤，并蓋上保鮮膜。70℃超聲波提取3次，每次20 m i n，超聲工作頻率為99 H z。加入無水硫酸鈉干燥，制得0.212 g揮發(fā)油固體。加入無水乙醇使揮發(fā)油溶解，配制成濃度為1.0、0.8、0.6及0.4 m g/m l的香菜揮發(fā)油母液，取上述母液分別加入RPM I 1640培養(yǎng)基，配成濃度為5、4、3及2μg/m l的細胞培養(yǎng)液，各組培養(yǎng)液中乙醇的終濃度均為0.5%。

1.3.2細胞培養(yǎng)及M TT細胞培養(yǎng)人成骨肉瘤細胞株Saos-2采用RPM I 1640培養(yǎng)基（含10%FBS、1%雙抗）培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每隔72 h換液1次。M TT：于96孔板內(nèi)培養(yǎng)細胞，每孔接種1萬個，貼壁后分別加入4種含不同濃度的香菜揮發(fā)油（5、4、3及 2μg/m l）培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔200μl，空白對照組為含0.5%乙醇培養(yǎng)基，陽性對照組采用400μg/m l槲皮素。培養(yǎng)72 h后于重光IBE2000型倒置熒光顯微鏡拍照記錄，棄去上清，每孔加入M TT試劑150μl，4 h后棄去上清再加入DM SO 200μl進行溶解，置于Bi o-Rad 550型酶標儀，測其OD值，計算出細胞生長活性度。細胞生長活性度=［1-（對照組平均OD值-實驗組平均OD值）/對照組平均OD值］×100%。

1.3.3細胞遷移抑制檢測①Saos-2細胞消化后用含0.1%FBS培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細胞密度至1× 105，培養(yǎng)基中分別含終濃度5μg/m l的香菜揮發(fā)油及0.5%的乙醇。②取細胞懸液200μl加入t ranswel l cam ber趨化小室上室，下室中加入600μl含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。③將上室從24孔板中取出，用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞，然后放入0.1%結(jié)晶紫中染色20 m i n，再用三蒸水沖洗3遍，在光鏡下觀察穿膜細胞數(shù)。采用10×物鏡，每個小室取6個視野，計算各視野細胞數(shù)目，拍照并保存。細胞遷移抑制率=［（對照組遷移細胞數(shù)－香菜揮發(fā)油組遷移細胞數(shù)）/對照組遷移細胞數(shù)］×100%。

1.3.4熒光定量PC R5μg/ml的香菜揮發(fā)油處理Saos-2細胞72 h，以0.5%的乙醇作為對照，Tri zol法提取細胞總RNA，Nanodrop 2000測定純度，采用GoScri ptReverse Transcri pt i on Syst em（Prom ega）進行逆轉(zhuǎn)錄，操作按試劑盒說明書進行；定量PCR擴增采用SYBR Prem i x Ex TaqⅡ（Tl i RNaseH Pl us），在ABI7500型熒光定量PCR儀上檢測，PCR程序為95℃預變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40循環(huán)。以ACTB作為內(nèi)參，目的基因表達水平采用2-△△CT法進行分析，所有基因檢測均重復3次（見表1）。

表1　實時PC R引物序列

1.4統(tǒng)計學方法

圖1　香菜揮發(fā)油抑制Saos-2的生長 （×40）

圖2　香菜揮發(fā)油體外抑制Saos-2的遷移 （×100）

2　結(jié)果

2.1香菜揮發(fā)油得率

用電子分析天平精密稱量香菜揮發(fā)油質(zhì)量為0.212 g，而總的質(zhì)量為50 g，計算揮發(fā)油的得率為0.424%。

2.2M TT結(jié)果

各組細胞活性與藥物劑量成反比，提示抑制作用呈劑量依賴性（見表2），香菜揮發(fā)油具有明顯抑制Saos-2細胞生長的作用（見圖1）。

2.3遷移抑制結(jié)果

在香菜揮發(fā)油5μg/m l組，對Saos-2細胞t ranswel l趨化小室的上室底膜反面10倍物鏡下6個視野細胞計數(shù)分別為2、4、3、4、0及1個，均數(shù)為2.333，下室中未見有細胞懸浮或貼壁；在乙醇對照組，顯示上室底膜反面有較多細胞黏附，在10倍物鏡下取6個視野計數(shù)為14、13、12、15、10及17，均數(shù)為13.500。根據(jù)公式計算，香菜揮發(fā)油對Saos-2細胞的遷移抑制率=［（對照組遷移細胞數(shù)－香菜揮發(fā)油組遷移細胞數(shù)）/對照組遷移細胞數(shù)］×100%=［（13.5-2.33）/13.5］×100%=82.716%。結(jié)果提示香菜揮發(fā)油可顯著抑制體外Saos-2細胞的遷移（見圖2）。定量PCR結(jié)果見圖3。

表2　各組M TT實驗結(jié)果

圖3　定量PC R檢測結(jié)果

3　討論

植物揮發(fā)油為中藥的重要有效成分，分布廣泛，含量一般在1%以下。目前常用的揮發(fā)油提取方法有蒸餾法、溶劑提取法、壓榨法、超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法、超臨界流體萃取法和酶解提取法等［5］。其中超聲波輔助萃取法利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動和空化效應，加速藥物有效成分進入溶劑，從而提高提取效率，縮短提取時間，同時還可以防止高溫對提取成分的破壞［6-7］。本研究中利用該方法香菜揮發(fā)油的得率達到0.424%，可見是一種比較好的制備方法。

目前，各種植物揮發(fā)油類成分對腫瘤的作用已有報道，如花椒揮發(fā)油、姜黃揮發(fā)油、洋蔥揮發(fā)油及荊芥揮發(fā)油等均有抗腫瘤作用［8-11］。研究提示香菜揮發(fā)油類可阻斷亞硝酸鹽的合成［12］，香菜甲醇提取物對M K-1、H eLa和B16F10等多種腫瘤細胞系有生長抑制作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)香菜揮發(fā)油可明顯抑制人骨肉瘤細胞Saos-2的生長，5μg/m l濃度時細胞活性度為34.519%，這種抑制作用呈劑量依賴。同時，5μg/m l濃度對細胞的遷移抑制率達到82.716%。

P21Ci p1/W af1可與 cycl i n/CDK結(jié)合而抑制CDK的活性，P21Ci p1/W af1不但阻滯細胞G1/S轉(zhuǎn)換，而且也參與G2/M轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)［14］。P27Ki p1與P21Ci p1/W af1有一定的同源性，亦具有阻止細胞通過G1/S期轉(zhuǎn)換的“關卡”作用，從而抑制細胞增殖［15］。研究還顯示，P21Ci p1/W af1與P27Ki p1在腫瘤內(nèi)表達水平的高低與腫瘤的惡性程度密切相關，在高分化腫瘤這兩種抑癌基因的表達水平比低分化腫瘤高［16］。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)香菜揮發(fā)油可明顯上調(diào)Saos-2細胞中P21Ci p1/W af1及P27Ki p1的表達，說明其對細胞的生長抑制作用與這兩種抑癌基因的高表達有關。S100A4基因?qū)儆赟-100鈣離子結(jié)合蛋白超家族，被認為與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與擴散密切相關［17］。研究顯示S100A4可以減少骨肉瘤細胞間的黏附、促進骨肉瘤細胞外基質(zhì)的降解和重塑，增加骨肉瘤細胞的運動，幾乎參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的整個過程［18］，同時S100A4還是成骨細胞分化及礦化的負性調(diào)控因子［19］。本研究發(fā)現(xiàn)香菜揮發(fā)油可顯著抑制S100A4的表達，而另一種主要的遷移促進基因NM23H1表達無明顯變化，提示香菜揮發(fā)油對遷移的抑制主要與S100A4的表達下調(diào)相關，由于S100A4是成骨分化的抑制基因，其表達下調(diào)可能同時促進了細胞的成骨分化成熟，在后續(xù)研究中將進一步關注。

綜上所述，本研究首次證實香菜揮發(fā)油對人成骨肉瘤細胞株Saos-2的生長及遷移有顯著抑制作用，并初步探討了其分子機制，為香菜的進一步開發(fā)利用奠定了基礎。

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（王榮兵編輯）

Coriander volatile oil inhibits growth and migration of Saos-2 cellsin vitro*

Jia-ling Lai1，Wen-yao Fu2，Xing He2，Chuan-yun Xiao2，Jun Cao3
（1.Clinical Medical College；2.College of Pharmacy and Life Sciences；3.College of Basic Medical Sciences，Jiujiang University，Jiujiang，Jiangxi 332000，China）

Objective To extract coriander volatile oil and investigate its effects on growth and migration of human Saos-2 cellsin vitro.Methods Ultrasound-assisted ethanol extraction was used to prepare coriander volatile oil.MTT assay was used to determine the growth inhibion of Saos-2 cells by volatile oil.Cell migration was examined using Boyden chamber assay.Expression ofP21Cip1/Waf1，P27Kip1，NM23H1 and S100A4 were examined by real-time PCR.Results The results showed that the yield of coriander volatile oil was 0.424%using ultrasound-assisted ethanol extraction.Coriander volatile oil inhibited the growth and migration of Saos-2 cells，along with the decrease in the expression levels ofP21Cip1/Waf1，P27Kip1 and S100A4.Conclusions Coriander volatile oil can inhibit Saos-2 cell growth and migration in vitro，which may involveP21Cip1/Waf1，P27Kip1 andS100A4.

coriander volatile oil；anti-tumour；P21Cip1/Waf1；P27Kip1；S100A4

R 282.71

A

1005-8982（2016）05-0017-05

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.004

2015-07-27
*

江西省衛(wèi)生廳科技計劃項目（No：20157101）；江西省教育廳科學技術研究項目（贛教技字GJJ08441）

曹俊，E-m ai l：caoj un002@al i yun.com