替加環(huán)素、米諾環(huán)素對VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌體外抗菌活性

陳春輝，郭　燕，吳　湜，楊　洋，胡付品，朱德妹，徐曉剛

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替加環(huán)素、米諾環(huán)素對VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌體外抗菌活性

陳春輝，郭燕，吳湜，楊洋，胡付品，朱德妹，徐曉剛

摘要：目的 了解替加環(huán)素及米諾環(huán)素對VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌臨床分離株的體外抗菌活性。方法 收集2006 —2014年上海地區(qū)臨床分離VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌45株；采用PCR擴(kuò)增及測序確認(rèn)菌種和萬古霉素耐藥基因型；測定替加環(huán)素及米諾環(huán)素等10種抗菌藥物對VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌的MIC。結(jié)果 45株臨床分離株均確認(rèn)為VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌；所有菌株對萬古霉素高度耐藥（MIC 128～＞256 mg/L），對替考拉寧耐藥率為71.1%。幾乎所有菌株對左氧氟沙星（100%）和氨芐西林（97.8%）耐藥，對米諾環(huán)素、慶大霉素和利福平的耐藥率分別為15.6%、64.4%和82.2%，未檢出替加環(huán)素和利奈唑胺耐藥株。結(jié)論 替加環(huán)素和米諾環(huán)素對VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌有良好的體外抗菌活性。

關(guān)鍵詞：替加環(huán)素； 米諾環(huán)素； 萬古霉素； 耐藥； 屎腸球菌

自1988年萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）在歐洲報(bào)道以來［1］，VRE已迅速波及世界各地，成為醫(yī)院感染的重要病原菌。由于此類耐藥株多數(shù)表現(xiàn)為多重耐藥，臨床治療困難，給患者生命與健康帶來嚴(yán)重威脅［2-3］。VanM型VRE于2006年在上海地區(qū)分離的萬古霉素耐藥屎腸球菌臨床株中發(fā)現(xiàn)，同期分離的該基因型菌株具有多重耐藥表型，但多數(shù)菌株對多西環(huán)素敏感［4］，故四環(huán)素類藥物有望用于VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌所致感染。米諾環(huán)素與多西環(huán)素同屬四環(huán)素類，替加環(huán)素則為米諾環(huán)素的衍生物。本研究收集了上海地區(qū)的VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌臨床分離株，就替加環(huán)素及米諾環(huán)素對該菌株的體外抗菌活性進(jìn)行分析，以期為臨床抗菌藥物選擇提供客觀依據(jù)。

1. 材料與方法

1.1細(xì)菌來源

1.1.1 臨床分離株 2006年1月—2014年4月在上海地區(qū)臨床分離的萬古霉素耐藥屎腸球菌45株。

1.1.2 質(zhì)控菌株 糞腸球菌ATCC29212為復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所保存菌株。

1.2培養(yǎng)基及抗菌藥物

Mueller-Hinton瓊脂、BHI瓊脂及肉湯（英國OXOID公司）；陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯（美國BD公司）。萬古霉素、替考拉寧、米諾環(huán)素、紅霉素、左氧氟沙星、慶大霉素、氨芐西林以及利福平等抗菌藥物購自中國食品藥品檢定研究院；替加環(huán)素E試驗(yàn)藥敏紙片為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.3分子生物學(xué)及生化試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、為大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）產(chǎn)品；瓊脂糖為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.4臨床株菌種確認(rèn)及萬古霉素耐藥基因分型

1.4.1 菌種確認(rèn) 采用通用引物8F、1492R（序列見表1）擴(kuò)增臨床分離VRE菌株的16S rRNA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物測序后與GenBank序列進(jìn)行比對，以進(jìn)一步確認(rèn)菌種。

1.4.2 耐藥基因分型 采用萬古霉素耐藥基因通用引物（序列見表1）擴(kuò)增萬古霉素耐藥基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序、比對，確定萬古霉素耐藥基因型。

表1　引物序列Table 1 Primers used in this study

1.5藥物敏感性試驗(yàn)

萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、紅霉素、左氧氟沙星、慶大霉素、米諾環(huán)素以及利福平等抗菌藥物用瓊脂稀釋法測定藥敏，參照CLSI 2012版推薦方法進(jìn)行［6］。替加環(huán)素E試驗(yàn)法按說明書操作步驟完成。藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI 2012版［6］。替加環(huán)素敏感性參照歐洲抗菌藥物敏感試驗(yàn)委員會(huì)（European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing.http：//www.eucast.org）判斷標(biāo)準(zhǔn)：MIC≤0.25 mg/L為敏感。

2　結(jié)果

2.1菌種確認(rèn)及萬古霉素耐藥基因分型

經(jīng)PCR擴(kuò)增及測序分析，45株臨床分離菌均為屎腸球菌，且攜帶vanM基因，即所有菌株均確認(rèn)為VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌。

2.2藥物敏感性

VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌對替加環(huán)素、米諾環(huán)素及其他8種抗菌藥物的敏感性見表2。未發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素耐藥株，米諾環(huán)素耐藥率僅為15.6%。

表2　VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌對10種抗菌藥物的MIC值Table 2 MICs of 10 antimicrobial agents against VanM-type vancomycin-resistant E. faecium isolates

3　討論

VRE已在我國多地出現(xiàn)并傳播［7-8］。VanM型VRE是發(fā)現(xiàn)于上海地區(qū)的新型VRE［4］，耐藥表型與VanA型VRE相似，不僅對萬古霉素等糖肽類抗菌藥物耐藥，對氨芐西林、慶大霉素等也大多耐藥，呈多重耐藥表型，其所致感染臨床可供治療的藥物有限。近年來上海地區(qū)VanM型VRE逐漸增多［9］，如何應(yīng)對此類耐藥菌感染值得關(guān)注。

目前臨床采用的四環(huán)素類藥物包括多西環(huán)素和米諾環(huán)素，近年在國內(nèi)上市的替加環(huán)素則是米諾環(huán)素的衍生物，屬甘氨酰環(huán)素類抗生素，不但對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等革蘭陰性菌有效，對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌等革蘭陽性菌也有抗菌活性。雖然目前替加環(huán)素僅被推薦用于萬古霉素敏感糞腸球菌所致復(fù)雜性皮膚軟組織感染及腹腔感染，但已有文獻(xiàn)報(bào)道替加環(huán)素單藥或聯(lián)合其他藥物成功治療VRE所致的腹腔及皮膚軟組織感染［10］。

為進(jìn)一步了解米諾環(huán)素及替加環(huán)素對VanM型萬古霉素耐藥屎腸球菌的體外抗菌活性，本研究收集了45株VanM型菌株，測定了它們對米諾環(huán)素、替加環(huán)素以及其他8種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果顯示，所有VanM型耐藥株對替加環(huán)素和利奈唑胺均敏感，對米諾環(huán)素的耐藥率為15.6%，遠(yuǎn)低于氨芐西林（97.8%）、左氧氟沙星（100%）、利福平（82.2%）、慶大霉素（64.4%）等抗菌藥物，表明米諾環(huán)素、替加環(huán)素對該型VRE具有良好的體外抗菌活性，如能得到體內(nèi)研究的進(jìn)一步證實(shí)，可作為臨床治療萬古霉素耐藥屎腸球菌感染的備選藥物。

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［10］HEIZMANN WR， L?SCHMANN PA， ECKMANN C， et al. Clinical efficacy of tigecycline used as monotherapy or in combination regimens for complicated infections with documented involvement of multiresistant bacteria［J］. Infection，2015， 43（1）： 37-43.

中圖分類號：R978

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-7708（2016）03-0327-03

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.013

收稿日期：2015-06-01 修回日期：2015-11-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81171613）。

作者單位：復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，衛(wèi)生部抗生素臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040。

作者簡介：陳春輝（1987—）女，博士研究生，主要從事感染性疾病的診治及細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

通信作者：徐曉剛，E-mail：xuxiaogang@fudan.edu.cn。

In vitro activity of tigecycline and minocycline against VanM-type vancomycinresistant Enterococcus faecium

CHEN Chunhui， GUO Yan， WU Shi， YANG Yang， HU Fupin， ZHU Demei， XU Xiaogang. （Institute of Antibiotics，Huashan Hospital， Fudan University； Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics， Ministry of He alth， Shanghai 200040， China）

Abstract:Objective To investigate the in vitro activity of tigecycline and minocycline against VanM-type vancomycin-resistant Enterococcus faecium. Methods A total of 45 strains of VanM-type vancomycin-resistant E. faecium were obtained from hospitals in Shanghai between 2006 and 2014. Species and vancomycin resistance genotype were identifed by PCR and sequencing analysis. Minimal inhibitory concentrations （MICs） of ten antimicrobial agents against these strains were determined. Results All the 45 isolates were VanM-type vancomycin-resistant E. faecium， and resistant to vancomycin （MIC： 128 to ＞256 mg/L）. And 71.1% of the strains were resistant to teicoplanin. Almost all isolates showed resistance to levofoxacin （100%） and ampicillin （97.8%）. About 15.6%， 64.4% and 82.2% of the strains were resistant to minocycline， gentamicin and rifampicin， respectively. Conclusion Tigecycline and minocycline exhibit excellent in vitro activity against these VanM-type vancomycin-resistant E. faecium isolates.

Key words:tigecycline； minocycline； vancomycin； antibiotic resistance； Enterococcus faecium