補氣益精生血法治療β地中海貧血11例及對BCL11A影響

盧焯明，張春紅，杜廣亮，陳致雯（廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州510130）

·臨床研究·

補氣益精生血法治療β地中海貧血11例及對BCL11A影響

盧焯明，張春紅，杜廣亮，陳致雯
（廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州510130）

目的觀察補氣益精生血方藥對中間型β地中海貧血（β地貧）患兒療效及對關鍵紅系反式作用因子的影響。方法采用隨機對照雙盲雙模法將入選的β地貧患兒24例分為中藥組11例及對照組10例，中藥組口服黃芪、黨參、龜板、當歸顆粒及安慰劑片，對照組口服羥基脲片及安慰劑顆粒，療程12周。觀察2組血常規(guī)及胎兒血紅蛋白（HbF）比例等指標，并以實時熒光定量PCR反應檢測BCL11A基因的轉(zhuǎn)錄表達水平。結(jié)果治療后中藥組血紅蛋白值為（8.90±1.57）g/dL，對照組為（9.06±1.73）g/dL，2組比較無顯著性差異（P＞0.05），但2組治療后HbF均較治療前有顯著提升（P均＜0.01）。中藥組能顯著下調(diào)BCL11A基因表達水平，由治療前（0.34± 0.11）copies下降至（0.18±0.13）copies（P＜0.05），下調(diào)程度亦優(yōu)于對照組（P＜0.01）。結(jié)論補氣益精生血法治療小兒β地貧具有較好療效，其分子機制可能與抑制BCL11A從而誘導胎兒血紅蛋白生成有關。

β地中海貧血；胎兒血紅蛋白；BCL11A；中醫(yī)藥療法

地中海貧血（下稱地貧）是在我國南方常見的嚴重危害兒童青少年健康的一種遺傳性溶血性貧血疾病，很多患兒需要依賴輸血及長期去鐵治療。但兩種治療手段存在著內(nèi)皮損傷、傳染病暴露等毒副作用，也給患兒家庭帶來了較大的經(jīng)濟負擔［1-2］。至于治療重型地貧的骨髓移植，由于骨髓來源少、費用高昂等因素只有少部分病人能惠及［3］。β地貧另一可選的治療手段為珠蛋白基因誘導，即通過藥物來誘導γ珠蛋白基因高表達以合成胎兒血紅蛋白（fetal hemoglobin，HbF），在代償正常血紅蛋白不足的同時也可以結(jié)合β地貧患兒血中過多的α鏈從而減輕溶血［4-5］。以羥基脲為代表的各種誘導西藥有一定療效，但其骨髓抑制、免疫抑制及潛在可能致癌等毒副作用，使它們的臨床應用受到限制［6］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥相對毒副作用較小，本課題組既往的地貧中醫(yī)證候規(guī)律研究［7-8］總結(jié)出β地貧的核心治法——補氣益精生血，同時我們通過體外實驗又篩選出補氣益精生血的中藥龜板、黃芪、黨參等能誘導人類紅系細胞株表達γ珠蛋白基因并合成HbF［9-11］。后續(xù)臨床研究進一步證明了補氣益精生血中藥的良好療效［12-13］，但具體分子機制有待繼續(xù)深入探討。反式作用因子B細胞淋巴瘤11A蛋白（B cell lymphoma 11A，BCL11A）新近發(fā)現(xiàn)是影響到β及γ珠蛋白基因表達最關鍵的紅系反式作用因子之一［14］。本研究運用龜板、黃芪、黨參加當歸的補氣益精生血改良配方治療β地貧患兒，檢測血液學指標以觀察療效，并與羥基脲片治療進行隨機雙盲對照，同時對用藥后體內(nèi)BCL11A基因的表達情況進行分析，從BCL11A基因角度探討中藥起效的分子機制。

1對象與方法

1.1一般資料本研究得到我院醫(yī)學倫理委員會批準，共納入了2015年6月—2016年1月在廣州市中醫(yī)醫(yī)院就診的中間型β地貧患兒24例，均得到本人或監(jiān)護人的知情同意。對符合以下標準的β地貧患兒使用SPSS13.0軟件隨機數(shù)字生成器按1∶1的比例完全隨機分配進入中藥組及對照組各12例（研究過程中藥組脫落1例，對照組脫落2例）。2組年齡、性別、病程比較，差異無顯著性（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1　2組一般資料比較（±s）

表1　2組一般資料比較（±s）

組別中藥組對照組n 12 12 男65 女67年齡/歲6.59±4.30 7.12±3.88

1.2診斷標準根據(jù)《血液病診斷及療效標準》［15］中間型β地貧診斷標準，① 臨床表現(xiàn)：多在2～5歲時出現(xiàn)貧血，癥狀和體征較重型輕，可有地中海貧血面容。② 實驗室檢查：血紅蛋白60～100 g/L （6～10 g/dL），成熟紅細胞形態(tài)與重型相似，網(wǎng)織紅細胞增多，可見有核紅細胞，HbF＞3.5%。③ 遺傳學：父母均為β珠蛋白生成障礙性貧血。符合上述條件者可作出臨床診斷，進一步診斷需進行基因分析。

1.3中醫(yī)辨證標準根據(jù)筆者課題組既往的β地貧中醫(yī)證候規(guī)律研究［7-8］，并參照《中醫(yī)證候鑒別診斷學》［16］及《中藥新藥臨床研究指導原則》［17］相關內(nèi)容，制定如下辨證標準。氣血不足的四診癥狀：①面色淡白或萎黃；② 唇甲色淡；③ 神疲乏力；④ 易受外感；⑤ 自汗；⑥ 脈細弱。腎精虧虛的四診癥狀：① 發(fā)育落后；② 筋骨痿弱；③ 頭暈目眩；④ 易口干；⑤ 少苔；⑥脈沉細。辨證由課題組2名中醫(yī)師通過四診來共同判別，凡符合氣血不足及腎精虧虛四診癥狀各3條或以上，即辨證為氣血不足、腎精虧虛證。

1.4納入標準①年齡2～18歲；②基因分析已確診為β地中海貧血，符合以上診斷標準及中醫(yī)辨證標準；③ 血紅蛋白（hemoglobin，Hb）≥60 g/L。

1.5排除標準① 有心、肝、腎、內(nèi)分泌等系統(tǒng)疾患及其他原發(fā)性血液病者；② 近12周內(nèi)曾輸血或服用任何抗貧血藥物；③ 過敏體質(zhì)者；④ 有精神疾病不合作或依從性差者。

1.6治療方法為克服研究者的主觀偏倚、參與研究的患者心理因素干擾及中西藥劑型的差異，研究采用雙盲雙模擬法。中藥組口服中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司），包括黃芪顆粒、黨參顆粒、龜甲顆粒、當歸顆粒，每袋均為飲片10 g的水提取物。用法與用量：2～6歲各1袋，6～12歲各2袋，12～18歲各3袋；均每日1次，混合后以溫開水沖服。同時加用西藥安慰劑，依據(jù)安慰劑制備規(guī)范采用糊精制備，外觀性狀與羥基脲片相似，用法同對照組。

對照組口服羥基脲片（齊魯制藥有限公司），按10 mg/（kg/d）用量，每周連用4 d，停藥3 d。同時加用中藥安慰劑，中藥安慰劑用糊精制備，外觀性狀與中藥配方顆粒相似，用法用量參照中藥組。2組療程均為12周，由掌握隨機分組的第三方專人發(fā)藥。治療期間不輸血或使用其他影響血液系統(tǒng)的藥物。

1.7觀察指標

1.7.1血液學指標治療前及治療后每4周直至12周，分別取患兒末梢血以全自動血細胞分析儀檢測血常規(guī)，觀察血紅蛋白（Hb）、紅細胞總數(shù)（RBC）、紅細胞平均體積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）；治療前及治療12周后分別取患兒靜脈血以手工計算網(wǎng)織紅細胞計數(shù)（Ret）；采用堿性血紅蛋白電泳法檢測HbF比例；采用比色法檢測紅細胞滲透脆性。

1.7.2安全性指標同上檢測血常規(guī)方法，觀察白細胞總數(shù)（WBC）、中性粒細胞總數(shù)（NEU）、血小板總數(shù)（PLT）；治療前及治療12周后分別取患兒靜脈血以全自動生化分析儀進行肝功能測定，觀察血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、谷氨酸?；D(zhuǎn)移酶（GGT））以及腎功能測定包括血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。

1.7.3BCL11A基因表達水平以實時熒光定量PCR檢測BCL11A基因的轉(zhuǎn)錄表達水平：治療開始前及治療12周后分別取患兒靜脈血，采用不連續(xù)密度梯度離心法分離包含有核紅細胞在內(nèi)的單個核細胞。根據(jù)BCL11A基因序列設計并合成引物，用Trizol提取總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應，之后使用熒光染料法進行實時熒光定量PCR反應。根據(jù)標準曲線、各樣本BCL11A基因的Ct值并以內(nèi)參照基因矯正，得出目的基因mRNA水平相對的拷貝數(shù)。每樣本的PCR實驗使用復孔3次，取均值。

1.8統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計，計量資料屬正態(tài)分布以±s表示，同組治療前后差異采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析及配對t檢驗，組間差異采用成組t檢驗及協(xié)方差分析。

2結(jié)果

2.12組血常規(guī)指標變化比較見表2。

表2　2組血常規(guī)指標變化比較（±s）

表2　2組血常規(guī)指標變化比較（±s）

注：與治療前比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01。

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2.22組HbF比例、Ret及紅細胞滲透脆性變化比較見表3。

2.32組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較見表4。

2.42組BCL11A基因表達水平變化比較見表5。

2.52組治療前后肝腎功能變化情況2組ALT、AST、GGT、BUN及Cr的組間差異及治療前后的差異均無顯著性（P＞0.05）。

表3　2組HbF比例、Ret及紅細胞滲透脆性變化比較（±s）

表3　2組HbF比例、Ret及紅細胞滲透脆性變化比較（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與治療前比較，2）P＜0.01。

組別中藥組n 11對照組治療前治療后治療前治療后10 HbF比例/% 61.15±23.81 72.54±24.832）63.08±30.65 76.50±33.122）Ret 0.032±0.013 0.037±0.0121）0.036±0.017 0.019±0.0132）紅細胞滲透脆性/% 62.35±20.10 67.58±18.82 66.45±18.13 73.40±22.63

表4　2組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較（±s）　×109/L

表4　2組治療前后WBC、NEU、PLT變化比較（±s）　×109/L

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與治療前比較，2）P＜0.05。

組別中藥組n 11對照組治療前治療后治療前治療后10 WBC 8.35±3.02 8.56±2.111）7.97±2.39 5.30±1.282）NEU 3.18±2.66 3.62±1.201）3.06±2.11 1.93±1.052）PLT 353.00±165.66 348.51±155.81 317.00±156.40 193.50±140.63

表5　2組BCL11A基因表達水平變化比較（±s）copies

表5　2組BCL11A基因表達水平變化比較（±s）copies

注：與對照組比較，1）P＜0.01；與治療前比較，2）P＜0.05。

組別中藥組對照組n 11 10治療前0.34±0.11 0.31±0.13治療后0.18±0.131）2）0.33±0.20

3討論

為了得到更客觀可靠的證據(jù)，本研究在課題組既往研究［9-13］的基礎上改用中藥與誘導西藥的陽性代表藥物羥基脲作對照，進行了雙盲雙模擬的隨機對照研究。地貧患兒的Hb需維持在一定水平才能保證其生長發(fā)育，因而一般把Hb作為評價療效的最主要指標。本研究結(jié)果顯示中藥及羥基脲治療后均可顯著提升Hb水平，提示補氣益精生血方藥對兒童中間型β地貧是有一定療效的。但如果是針對羥基脲的優(yōu)效檢驗，本研究樣本量明顯不足，有待今后擴大樣本量進一步深入考察。

本研究顯示中藥也能提升患兒RBC水平，而RBC上升可能是骨髓造血功能的提升，也可能是外周血中紅細胞破壞的減少。本研究同時顯示中藥能一定程度上提升患兒的網(wǎng)織紅細胞計數(shù)，提示中藥有可能刺激了患兒的骨髓造血。至于羥基脲組RBC及網(wǎng)織紅細胞計數(shù)在治療后均有下降，可能與羥基脲抑制骨髓的毒副作用有關。另外，中藥及羥基脲對患兒的紅細胞脆性似乎也有輕度改善作用，但確切效果未明。后續(xù)我們運用堿性血紅蛋白電泳法檢測了HbF水平，結(jié)果提示中藥及羥基脲均可誘導γ珠蛋白基因表達從而合成HbF，此結(jié)果也進一步提示2組Hb水平的提升主要來源于HbF而不是HbA，而2組紅細胞脆性的改善也可能與γ珠蛋白基因表達合成γ鏈再結(jié)合α鏈生成HbF（α2γ2），從而減少了α鏈四聚體引起的溶血有關。

對于誘導γ珠蛋白基因表達合成HbF的分子機制，本研究從關鍵紅系反式作用因子角度作了進一步分析。反式作用因子BCL11A在沉默γ珠蛋白基因及血紅蛋白發(fā)育轉(zhuǎn)換中的重要作用是近年國際血液學研究的重大發(fā)現(xiàn)之一，相關研究論文相繼發(fā)表在《Science》、《Nature》等頂級學術期刊上［14，18］。我們運用實時熒光定量PCR檢測用藥前后BCL11A基因的mRNA水平，結(jié)果提示中藥可顯著抑制BCL11A基因的轉(zhuǎn)錄表達，而羥基脲則無明顯作用。至于中藥對BCL11A基因在翻譯表達水平的影響，能否真正減少BCL11A的蛋白含量，有待后續(xù)western blot等實驗進一步確認。

BCL11A對γ珠蛋白的抑制與它對β-LCR上的HS3、γ珠蛋白基因啟動子以及γ-δ基因間區(qū)域等作用有關，BCL11A沉默或缺失可使γ珠蛋白基因表達抑制得到解除從而提升HbF［18-21］。某些西藥如泊馬度胺［22］、細胞因子類藥物［23］對γ珠蛋白的誘導即與其抑制BCL11A有關。另有體外研究發(fā)現(xiàn)：存在于葡萄皮及紅酒中的天然物質(zhì)白藜蘆醇能通過抑制細胞株BCL11A從而誘導γ珠蛋白及HbF［24］。目前尚未見中藥對BCL11A影響的研究報道，本研究首次從關鍵紅系反式作用因子BCL11A的前沿角度探討了中藥治療β地貧的分子機制，具有一定的創(chuàng)新性。

在與其他紅系轉(zhuǎn)錄因子的關系方面，BCL11A 與 SOX6、Myb、KLF1的共表達及相互作用也是 γ珠蛋白基因沉默的重要機制［19，25，26］。以BCL11A和/ 或KLF1為靶點的反義寡核苷酸基因治療可有效增加γ珠蛋白的表達［27］。近來研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀與抗氧化藥物丁基氫醌均能通過同時抑制 KLF1及BCL11A表達從而誘導HbF［28］。作為復方中藥其起效機制常常是多靶點、多途徑的，今后研究也可著眼于更廣泛的多種紅系反式作用因子而不一定只局限于BCL11A，同時也可考慮從反式作用因子與順式作用元件相互作用的角度著手。

在安全性指標方面，羥基脲治療后患兒的WBC、NEU均顯著低于中藥治療的患兒，這可能與羥基脲本身的骨髓抑制作用有關。且羥基脲在一定程度上影響患兒的免疫力，并有潛在致癌的風險性。從目前研究數(shù)據(jù)看來，補氣益精生血中藥具有與誘導西藥相近的效果，且毒副作用明顯較低，具有良好的開發(fā)前景。目前研究為初步研究，樣本量較少，有待今后擴大樣本量以更加明確其療效及安全性，并從更多途徑、更多角度研究其起效機制。

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R556.61

B

1000-338X（2016）02-0001-04

2016-01-20

廣東省中醫(yī)藥局科研課題（20141208）；廣東省自然科學基金項目（2015A030310311）；廣東省科學技術廳-廣東省中醫(yī)藥科學院聯(lián)合科研專項（2011B032200002）。

盧焯明，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，主要從事兒科中西醫(yī)結(jié)合臨床研究。