2株西瑪津降解菌的降解特性研究

任兵，張金艷，李紹峰

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶163319；2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院深圳市工業(yè)節(jié)水及城市污水資源化技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

2株西瑪津降解菌的降解特性研究

任兵1，2，張金艷1，李紹峰2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶163319；2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院深圳市工業(yè)節(jié)水及城市污水資源化技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

利用2株降解細(xì)菌S-1和S-3對西瑪津進(jìn)行生物降解，研究其降解能力及降解特性。通過紫外可見分光光度法測定OD600考察S-1和S-3的生物學(xué)特性，高效液相色譜法檢測不同條件下兩菌對西瑪津降解效果的影響以及混合菌的降解效果。結(jié)果表明：在30℃，pH 7.5條件下培養(yǎng)72 h后，0.2 mg·L-1西瑪津降解率均可達(dá)到99%以上；兩菌對中低濃度底物（0.2～10.0 mg·L-1）的降解效果較好，72 h幾乎降解完全，高濃度（25.0～50.0 mg·L-1）則不利于降解，50.0 mg·L-1時(shí)S-1和S-3最高降解率分別為56.67%和75.53%，外加少量碳源和氮源后降解速率均有所提高；混合菌的最佳配比為1∶1，此時(shí)西瑪津降解率最高，混菌的降解速率及降解能力均強(qiáng)于單菌，可見S-1和S-3對西瑪津均具有較強(qiáng)的降解能力，說明兩株降解菌在殘留西瑪津污染治理中具有獨(dú)特的應(yīng)用前景。

西瑪津；生物降解；高效液相色譜；混合菌

西瑪津（Simazine）化學(xué)名為2-氯-4，6-二（乙胺基）-1，3，5-三嗪，自1995年起便作為一種高效除草劑使用，主要用于控制多種作物田內(nèi)的闊葉雜草［1］，但由于其具有非常穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)，在環(huán)境中不斷地積累，加之其內(nèi)分泌干擾作用及致癌活性對生態(tài)環(huán)境和人類健康均存在潛在的威脅［2-3］，在許多國家的檢出率均已超出法定限制（>1 μg·L-1）［4］。面臨污染常規(guī)的處理工藝未能取得較好成效，然而利用環(huán)境微生物進(jìn)行降解卻有較強(qiáng)的去除能力，且無二次污染。目前研究者發(fā)現(xiàn)可以降解西瑪津的微生物有很多，細(xì)菌主要有假單胞菌屬（Pseudomonas）［5］、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）［6］等；真菌主要包括青霉菌（Pinicielium）［7］、曲霉菌（Aspergillus）［8］和木霉菌（Trichoderma）［9］等，其中假單胞菌屬的微生物代謝活性相對較高，可降解多種有機(jī)污染物，對三嗪類除草劑西瑪津具有較強(qiáng)的降解能力［10］。

研究利用2株高效降解細(xì)菌S-1和S-3降解西瑪津，對單菌降解能力和降解特性進(jìn)行考察，并對混合菌降解西瑪津時(shí)兩菌之間的相互作用進(jìn)行闡明，目前已有研究證明，兩種以上微生物聯(lián)合作用可以提高降解效果［11］，但也可對降解過程產(chǎn)生抑制［12］，因此對混合菌的研究在理論和實(shí)踐上都有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌株

2株降解菌均由本課題組前期馴化篩選獲得，一株是假單胞菌（Pseudomonas sp.），另一株是嗜麥芽寡氧單胞菌（Stenotrophomnas maltophilia sp.），生理生化特性見文獻(xiàn)［13-14］，分別用S-1和S-3表示。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

LB培養(yǎng)基：1L水中含蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，pH 7.5，121℃高壓滅菌20 min。

西瑪津降解培養(yǎng)基：1 L水中含Na2HPO4·H2O 0.07 g，KH2PO40.01 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，葡萄糖0.1 g，添加一定濃度西瑪津保證終濃度為0.2 mg·L-1，pH 7.5，115℃高壓滅菌30 min。

西瑪津（純度≥98%），購于sigma公司，乙腈（色譜純）進(jìn)口，其他試劑（分析純），購于廣州化學(xué)試劑二廠、天津市大茂化學(xué)試劑廠及廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（Waters-2695e）-2998紫外檢測器（美國Waters公司）；UV-7504紫外可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器公司）；HVE-50高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；HZQ-FX恒溫振蕩培養(yǎng)箱（東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液的制備

式中：R為西瑪津生物降解率；C0為接種前培養(yǎng)液中西瑪津濃度（mg·L-1）；C為降解后西瑪津濃度（mg·L-1）。

1.4.4 菌株的生長及對西瑪津的降解

將S-1和S-3菌懸液按2%的接種量分別接入50 mL西瑪津降解培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，在不同時(shí)間段取樣，取不接菌的空白對照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，測定600 nm波長下的吸光度值OD600，采用HPLC測定培養(yǎng)液中西瑪津含量，明確兩菌株的生長和降解趨勢。

1.4.5 降解影響因素考察

設(shè)定不同培養(yǎng)溫度、pH、底物濃度、外加普通碳源和氮源及不同金屬離子，培養(yǎng)條件及檢測方法同（1.4.3），考察不同因素對S-1和S-3生長及對西瑪津降解率的影響，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4.6 兩菌最佳配比及降解效果研究

將S-1和S-3按照體積比為8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4和1∶8的比例分別接種于西瑪津降解培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)條件同（1.4.3），設(shè)不接種的空白對照，考察混合菌降解西瑪津的最佳配比，另將最佳配比下混菌的降解效果與單菌降解效果進(jìn)行對比研究。

將于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24 h的菌液以12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入適量無菌水反復(fù)洗滌、離心3次，然后用無菌水稀釋下層菌體，得到菌密度OD600≈1.0的菌懸液。

1.4.2 菌體生長量測定

采用紫外可見分光光度法［15］測定菌液在600 nm處的光密度（OD600）來表示菌株的生長量變化情況。

1.4.3 西瑪津濃度測定

采用液相色譜法［16-18］測定降解液中西瑪津的含量變化，色譜柱型號4.6 mm×250 mm，5 μm反向C18柱，檢測波長為222 nm，流動(dòng)相乙腈：水（體積比）= 60∶40，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL·min-1，檢測時(shí)間10 min。降解率計(jì)算見公式（1）

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株S-1和S-3的生長及對西瑪津的降解能力

微生物生長一般可分為四個(gè)階段：適應(yīng)期、對數(shù)期、延滯期和衰亡期，本節(jié)對S-1和S-3的生長及對西瑪津的降解情況進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖1所示。

圖1 S-1和S-3的生長及西瑪津降解曲線Fig.1 The curves of the growth and simazine degradation of S-1 and S-3 strains

由圖1可見，S-1和S-3的生長及對西瑪津的降解情況存在一定關(guān)聯(lián)性，生長曲線表明，除生長速率快慢不同外，兩菌的生長情況相似，S-1在0～12 h生長緩慢，應(yīng)處于適應(yīng)期，12 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，36 h后生長速率減緩，開始進(jìn)入延滯期，OD600最大達(dá)到0.923；S-3在0～8 h處于適應(yīng)期，之后進(jìn)入對數(shù)期，24 h后生長速率減慢，最大生長量OD600可達(dá)到0.959，菌株S-3的生長速率比S-1快。降解曲線可見，降解速率與生長速率類似，菌株S-3大于S-1，S-3在24 h時(shí)近乎將西瑪津降解完全，S-1在36 h才能達(dá)到S-3的降解水平，但培養(yǎng)72 h后最終降解率均可達(dá)99%以上，說明兩株降解菌對西瑪津均具有較強(qiáng)的降解能力。

圖2 溫度對S-1和S-3生長及西瑪津降解率的影響Fig.2 Effects of temperature on S-1 and S-3 growth and simazine degradation

2.2 菌株S-1和S-3降解西瑪津的基本特性

2.2.1 溫度對降解效果的影響

溫度對細(xì)菌生長影響較大，本試驗(yàn)分別考察S-1和S-3在不同溫度下的適應(yīng)性，溫度設(shè)定為15、20、25、30、35、40℃，培養(yǎng)72 h后測定兩菌的生長和對西瑪津的降解情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2可見，當(dāng)溫度在15～40℃之間變化時(shí)，S-1和S-3的生長及對西瑪津的降解均有很大變化，開始時(shí)隨著溫度升高，兩菌的生長量和西瑪津降解率均隨之增加，30℃時(shí)峰值均達(dá)到最大，OD600分別為1.169和1.237，降解率均可達(dá)99.5%以上，溫度繼續(xù)升高，兩菌生長量和西瑪津降解率均呈現(xiàn)降低趨勢，可能因?yàn)闇囟鹊淖兓鹆思?xì)菌體內(nèi)酶活性的變化［19］，最終確定兩菌的最適溫度為30℃，溫度過高不利于降解。

2.2.2 pH對降解效果的影響

隨微生物種類的不同其最適生長pH也不同，pH將直接影響著微生物的生長代謝，試驗(yàn)考察了兩菌對不同pH的適應(yīng)性，pH設(shè)定為5、6、7、8、9、10，培養(yǎng)72 h后測定結(jié)果見圖3所示。

圖3 pH對S-1和S-3生長及西瑪津降解率的影響Fig.3 Effects of pH on S-1 and S-3 growth and simazine degradation

圖3可見，當(dāng)pH在7.0～9.0之間時(shí)，S-1和S-3的生長情況以及對西瑪津的降解效果均較好，pH為7.0和8.0時(shí)降解率相差不大，其中S-1在偏酸性條件下降解能力強(qiáng)于S-3，在偏堿性條件下降解能力弱于S-3，且S-3對pH的適應(yīng)能力強(qiáng)于S-1，綜合考慮，故將pH定為7.5。

2.2.3 初始底物濃度對降解效果的影響

在最適條件下，設(shè)定西瑪津濃度分別為0.2、2.0、5.0、10.0、25.0 mg·L-1和50.0 mg·L-1，考察了不同初始底物濃度對S-1和S-3降解西瑪津效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 S-1（a）和S-3（b）對不同底物濃度西瑪津的降解情況Fig.4 Biodegradation of the different simazine substrate concentrations of S-1（a）and S-3（b）

可見，中低等濃度（10.0 mg·L-1以下）西瑪津降解72 h后，S-1和S-3幾乎將其完全降解，當(dāng)培養(yǎng)液中底物濃度增加至25.0 mg·L-1以上時(shí)，兩株降解菌的降解效率明顯降低，25.0 mg·L-1時(shí)S-1和S-3的最高降解率分別為75.12%和82.25%，50.0 mg·L-1時(shí)最高降解率分別為56.67%和75.53%，可見濃度升高降解率呈現(xiàn)降低的趨勢，說明高濃度底物不利于降解。

2.2.4 外加碳源和氮源對降解效果的影響

碳源和氮源對微生物的生長繁殖有重要的作用，研究選用實(shí)驗(yàn)室中幾種較常見的含碳、氮化合物作為外加碳源和氮源，并設(shè)置不加碳源、氮源及不接種的對照組，在最適條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)72 h，定期取樣測定西瑪津降解率變化情況，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同碳源和氮源對S-1（a）和S-3（b）降解效果的影響Fig.5 Effects of the different carbon and nitrogen sources on the degradation of simazine by S-1（a）and S-3（b）

圖5（a和b）可見，菌株S-1和S-3在添加少量碳源和氮源條件下西瑪津的降解速率均有所提高，且提高效果差別較大，外加碳源S-1降解速率提高效果由快到慢分別為葡萄糖＞乳糖＞果糖＞蔗糖＞檸檬酸鈉，S-3順序?yàn)槠咸烟牵竟牵救樘牵菊崽牵緳幟仕徕c，外加氮源S-1降解速率提高效果由快到慢分別為牛肉浸膏＞酵母粉＞蛋白胨＞硝酸銨＞尿素，S-3順序?yàn)榕Ｈ饨啵窘湍阜郏镜鞍纂耍灸蛩兀鞠跛徜@，其中外加碳源和氮源對S-1降解影響均較明顯，但對S-3而言，外加碳源對西瑪津降解產(chǎn)生的影響明顯大于外加氮源，分析表明，兩菌株生長及降解西瑪津的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為牛肉浸膏。由于試驗(yàn)后期要對降解機(jī)理進(jìn)行研究，可能涉及到降解體系中氮的轉(zhuǎn)化，因此試驗(yàn)培養(yǎng)基中不添加任何氮源。

2.2.5 金屬離子對降解效果的影響

金屬離子對微生物的生長、代謝產(chǎn)物的合成及細(xì)胞的生命活動(dòng)都有一定影響，在最適條件下，添加濃度均為1 mmol·L-1的不同金屬離子，培養(yǎng)72 h后測定結(jié)果見圖6所示。

圖6 金屬離子對S-1和S-3降解西瑪津的影響Fig.6 Effects of metal ions on the degradation of simazine by S-1 and S-3

圖6可見，培養(yǎng)液中添加少量的金屬離子對S-1和S-3降解西瑪津存在一定影響，其中與對照組相比，其中Zn2+、Ca2+、Mg2+離子對S-1降解西瑪津產(chǎn)生了促進(jìn)作用，使降解率分別提高了3.1%、7.2%和2.2%，F(xiàn)e3+離子幾乎無影響，而Cu2+、Ba2+、Cr3+、As5+、Co2+、Ni2+離子對S-1降解西瑪津產(chǎn)生了抑制作用，其中Cu2+、Cr3+、Co2+三種離子的抑制作用非常明顯，抑制率分別可達(dá)51.0%、54.7%，Zn2+、Mg2+離子對S-3降解西瑪津具有促進(jìn)作用，使得降解率分別提高了3.6%和3.3%，F(xiàn)e3+和Ca2+離子影響較小，可忽略不計(jì)，剩余離子對S-3降解西瑪津過程均有較強(qiáng)的抑制作用，其中Cu2+抑制作用最明顯，抑制程度達(dá)到69.8%。

2.3 混合菌降解效果

以西瑪津降解率為評價(jià)指標(biāo)，通過實(shí)驗(yàn)測得S-1和S-3的不同配比對降解效果有一定影響，結(jié)果如圖7所示，另外考察了最佳配比下兩菌混合的降解效果，并與單菌進(jìn)行比較，結(jié)果如圖8所示。

圖7可見，當(dāng)VS-1∶VS-3在2∶1～1∶4之間時(shí)，西瑪津降解率均可以達(dá)到90%以上，其中配比為1∶1時(shí)降解率達(dá)到最大值99.6%，說明兩菌混合的最佳配比為1∶1。如圖8可見，在最佳配比條件下，混合菌的降解能力略大于S-3，遠(yuǎn)大于S-1，說明在混合菌的降解過程中S-3的作用占主導(dǎo)地位，S-1作為輔助菌，另外兩菌混合后提高了西瑪津的降解速率，可見S-1和S-3混合降解存在一定互生關(guān)系，相互促進(jìn)。

圖7 不同配比對降解效果的影響Fig.7 Effect of the different proportions on the degradation

圖8 對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Comparison experiment results

3 結(jié)論

試驗(yàn)菌株S-1和S-3對西瑪津都具有較強(qiáng)的降解能力，且S-3強(qiáng)于S-1，其中S-3搖床培養(yǎng)24 h幾乎可將0.2 mg·L-1的西瑪津降解完全，S-1要36 h才能達(dá)到同等水平，兩菌株對溫度的適應(yīng)性不強(qiáng)，最適溫度為30℃，高于或低于30℃，菌株的生長量和對西瑪津的降解率均明顯降低，可能因?yàn)闇囟瓤刂浦?xì)菌體內(nèi)酶活性的變化［19］。菌株對培養(yǎng)液酸堿度的適應(yīng)能力相對較強(qiáng)，在pH 7.0～9.0之間時(shí)，兩菌株的生長和降解情況較好，其中S-1在偏酸性條件下的降解能力優(yōu)于S-3，而在偏堿性條件下恰恰相反，但過高或過低均會(huì)對細(xì)菌體內(nèi)酶的誘導(dǎo)活性產(chǎn)生一定影響。

S-1和S-3對相對高濃度西瑪津的耐受能力較差，當(dāng)濃度大于25 mg·L-1后降解明顯受到抑制，降解率隨著底物濃度的增加而降低，與杜彥玲等［20］的研究結(jié)果相符，添加普通碳源和氮源后對最終降解率影響不大，只加快了降解菌的降解速率，該結(jié)果與劉愛菊［21］的結(jié)論相一致。另外發(fā)現(xiàn)不同的金屬離子對降解作用也有一定影響，Cu2+和Cr3+對降解過程有明顯的抑制作用，Zn2+和Mg2+具有一定促進(jìn)作用。

目前為止，對于殘留農(nóng)藥應(yīng)用混合菌的降解研究也已頻繁報(bào)道，其中有很多可以促進(jìn)微生物的降解，也有些對降解過程產(chǎn)生了抑制［12，22］，研究混合菌的降解能力強(qiáng)于單菌，促進(jìn)了西瑪津的降解，存在一種互生關(guān)系。因此，研究結(jié)果可為環(huán)境中西瑪津殘留污染的生物修復(fù)提供新思路。

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Degradation Characteristics of Two Simazine-degrading Bacterial Strains

Ren Bing1，2，Zhang Jinyan1，Li Shaofeng2
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Shenzhen Polytechnic，Shenzhen Key Laboratory of Industrial Water Saving and Municipal SewageReclamation Technology）

Two degradation bacterial strains S-1 and S-3 were used to biodegrade simazine to study their degradation capability and characteristics.The optical density OD600 was determined by Vis-UV Spectrophotometry to study biological characteristics of S-1 and S-3，the effects of different conditions on the simazine degradation was researched by HPLC and the degradation efficiency of mixed bacterias for simazine.The results showed that the degradation rate of 0.2 mg·L-1simazine reached 99%within 72 h under the condition of 30℃，pH 7.5；The lower-middle concentrations（0.2-10.0 mg·L-1）were degraded completely and high concentrations（25.0-50.0 mg·L-1）were not conducive to degrade within 72h by S-1 and S-3，the maximum degradation rate of S-1 and S-3 were 56.67%and 75.53%respectively，when the concentration was 50.0 mg·L-1.The degradation efficiency was improved by adding a small amount of carbon source and nitrogen source.The degradation rate of simazine reached the highest when the ratio was 1∶1，the degradation rate and ability was better than single bacterium.S-1 and S-3 had stronger degradation capacity，which illustrated they had special application potential in dealing with the pollution caused by simazine.

simazine；biodegradation；HPLC；mixed bacterias

S482.4

A

1002-2090（2016）03-0099-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.020

2015-04-15

廣東省自然科學(xué)基金（S2012040007855）。

任兵（1989-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院2013級農(nóng)藥學(xué)碩士研究生。

張金艷，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：nyxsh086@163.com。