玉米不育系回交轉(zhuǎn)育群體遺傳連鎖圖譜的比較分析

孫麗芳，王振，王霞，鄧杰，胡凱鳳，王婧擇，楊克軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶163319）

玉米不育系回交轉(zhuǎn)育群體遺傳連鎖圖譜的比較分析

孫麗芳，王振，王霞，鄧杰，胡凱鳳，王婧擇，楊克軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶163319）

以玉米細胞質(zhì)雄性不育系cms-合344為試驗材料，輻63018為輪回親本構(gòu)建BC1F1群體和BC2F1群體，并分別構(gòu)建SSR標記遺傳連鎖圖譜。結(jié)果表明，331對SSR標記中有60對標記在兩親本間呈現(xiàn)穩(wěn)定多態(tài)性；BC1F1群體覆蓋玉米基因組總長度為1 637.38 cM，標記間平均圖距為27.29 cM，BC2F1群體覆蓋玉米基因組總長度為1 183.64 cM，標記間平均圖距為19.73 cM；兩個圖譜的每條染色體標記數(shù)目和種類一致，然而各標記位置發(fā)生明顯變化。研究為玉米不育系回交轉(zhuǎn)育分子輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

玉米；回交轉(zhuǎn)育；遺傳連鎖圖譜

遺傳圖譜是進行農(nóng)藝性狀QTL定位、分子標記輔助選擇育種、種質(zhì)資源多樣性分析等方面研究重要基石［1-2］。玉米是我國重要的糧食作物，為異花授粉作物，天然異交率在90%以上，雜交制種是保證大田生產(chǎn)用種質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。選育不育系，利用三系配套制種不但有效保證種子質(zhì)量，而且極大降低生產(chǎn)成本。在作物育種實踐中，不育系的獲得可以通過回交轉(zhuǎn)育，然而該方法至少需要4～5個世代才能成功轉(zhuǎn)移性狀。1975年以前玉米遺傳分析主要依賴于后代性狀表現(xiàn)及分離情況等傳統(tǒng)方法。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，在回交育種方法上分子標記輔助選擇極大地提高了選擇效率縮短回交世代［3-4］。目前，利用分子標記輔助選擇、構(gòu)建遺傳圖譜以及基因定位已經(jīng)做了很多工作［5-7］。研究發(fā)現(xiàn)，SSR標記對日本栽培小豆地方品種×野生小豆的回交BC1F1群體作圖，205個SSR覆蓋11個連鎖群，總程度832.1 cM，平均間距為1.85 cM［8］。然而利用分子標記技術(shù)輔助選擇玉米不育系回交轉(zhuǎn)育后代的研究還未見報道，研究以不育系和欲轉(zhuǎn)育為不育系的優(yōu)良自交系為試驗材料，進行雜交和回交獲得回交一代和回交二代分離群體，進行遺傳圖譜構(gòu)建，旨在對不同回交世代遺傳連鎖圖譜進行比較和分析，為進一步進行基因定位和分子標記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

cms-合344：細胞質(zhì)雄性不育系，黑龍江八一農(nóng)墾大學密山試驗實習基地選育；輻63018：由黑龍江省農(nóng)科院玉米所輻射育種室提供。

1.2 試驗方法

2012年以玉米細胞質(zhì)雄性不育系cms-合344為母本與輻63018進行雜交，2013年種植F1與父本進行回交，獲得BC1F1。2013年10月隨機取200粒BC1F1種子和父本輻63018在海南進行回交加代，共獲得120株BC2F1回交后代。

在室內(nèi)隨機取BC1F1和BC2F1兩世代種子各200粒發(fā)芽，提取單株基因組DNA，最后兩世代各保留150株構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

1.3 DNA提取及SSR標記分析

將取回的葉片放入研缽中，加入液氮后迅速研磨至粉末，玉米基因組總DNA的提取參照張玉胡CTAB方法并略有改動。用紫外分光光度計檢測DNA的質(zhì)量濃度，用TE緩沖液將DNA工作液的濃度調(diào)至100 ng·μL-1于4℃保存，保存液濃度為300 ng·μL-1于-20℃保存。

SSR引物序列信息摘自玉米基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.maizegdb.org/ssr.php），并由北京華大基因科技有限公司合成。

PCR擴增反應(yīng)總體系為10 μL，ddH2O 5.6 μL， 10×PCR buffer 1.0 μL，dNTP（2.5 mM each）1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR Taq（5 μ·μL-1）0.2 μL，DNA（100 ng·μL-1）1.2 μL。PCR反應(yīng)程序為95℃變性5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃45 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min；12℃保存。擴增后的產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。

1.4 統(tǒng)計分析

1.4.1 SSR帶型統(tǒng)計分析

待膠片取出后置于燈箱上進行觀察、照相。對條帶進行統(tǒng)計并記錄。根據(jù)篩選出的具有多態(tài)性的SSR引物擴增結(jié)果，在相同的遷移位置上，群體中帶型與輪回親本帶型相同者賦值為“0”，為兩親本共同擁有的雜合帶型賦值為“1”，缺失的標記賦值為“-1”。利用EXCEL2003對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。

1.4.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

將統(tǒng)計好的符合要求的數(shù)據(jù)采用QTLIcimapping4.0軟件，對BC1F1、BC2F1群體的SSR標記位點進行遺傳連鎖分析，按照LOD臨界值3.00標準分群，采用Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間多態(tài)性引物篩選

隨機選用玉米10條染色體上的SSR引物331對，對cms-合344和輻63018兩親本進行SSR標記分析，選出具有多態(tài)性標記SSR引物60對（表1），占篩選引物總數(shù)的18.13%。

多態(tài)性SSR引物的選擇，兩親本間存在明顯的差異條帶，PCR擴增后的產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上帶型清晰可見，60對SSR引物對BC1F1和BC2F1兩群體進行多態(tài)性擴增，所篩選出的引物均能在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測到穩(wěn)定的產(chǎn)物條帶。根據(jù)擴增出的電泳條帶進行統(tǒng)計，并計算遺傳背景回復率。見圖1。

圖1 SSR標記um c2067在玉米（cm s-合344×輻63018）回交后代群體中擴增結(jié)果電泳圖Fig.1 The results of amplified by umc2067 in backcross progeny group

表1 60對SSR引物及其圖譜位置Table 1 60 pairs of SSR primers and their map location

2.2 兩群體遺傳連鎖圖譜的比較

根據(jù)60對SSR引物的擴增信息，用QTLIcimapping4.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，BC1F1和BC2F1遺傳連鎖圖譜如圖2和圖3所示，標記在染色體上的分布情況如表2所示。根據(jù)經(jīng)典形態(tài)學標記和SSR標記位點的結(jié)果，60個SSR標記全部可以分布到10條染色體上。從兩遺傳連鎖圖譜可以看出，兩圖譜在個別染色體上的標記位置以及在基因組覆蓋程度上均存在明顯的變化。BC1F1遺傳連鎖圖譜覆蓋玉米基因組總長度為1 637.38 cM，標記間平均圖距為27.29 cM。其中第二條染色體上的標記最多，為11個標記，覆蓋染色體225.85 cM，標記間平均圖距為20.53 cM；第4、6和第7條染色體上的標記最少，都為3個標記，覆蓋染色體分別為84.55 cM、135.70 cM和70.36 cM，標記間平均圖距為28.18 cM、45.23 cM和23.45 cM。在10條連鎖群中最大標記間距離在第1條染色體上，標記間距離為124.07 cM，最小標記間距離在第8條染色體上，標記間距離為2.95 cM（圖2）。

BC2F1遺傳連鎖圖譜覆蓋玉米基因組長度為1 183.64 cM，標記間平均圖距為19.73 cM。在第二條染色體上的標記數(shù)目最多為11個，覆蓋染色體長度為207.9 cM，標記間平均圖距為18.90 cM；在4、6和第7條染色體上的標記最少，各為3條，覆蓋染色體長度分別為90.63 cM、99.71 cM和50.47 cM，標記間平均圖距分別為30.21 cM、33.24 cM和16.82 cM。在10條染色體中最大標記間距離在第4條染色體上，標記間距離為77.65 cM，最小標記間距離在第3條染色體上，標記間距離為2.72 cM（圖3）。

另外，從表2中可以看出在每條染色體上BC2F1遺傳連鎖圖譜覆蓋玉米基因組長度和平均圖距都要小于BC1F1群體。同時，比較圖2和圖3可以發(fā)現(xiàn)，在每條染色體上BC1F1和BC2F1的標記數(shù)目和種類是一致，而標記的位置發(fā)生明顯變化，如在第1條染色體的標記umc1774在BC1F1群體圖譜位置為0.0 cM，而該標記在BC2F1群體圖譜位置為163.53 cM。

表2 BC1F1和BC2F1群體遺傳連鎖圖譜染色體上的標記分布情況Table 2 Distribution of markers on chromosome of genetic linkage map in BC1F1 and BC2F1 populations

圖2 BC1F1遺傳連鎖圖譜Fig.2 BC1F1 genetic linkage map

圖3 BC2F1遺傳連鎖圖譜Fig.3 BC2F1 genetic linkage map

3 結(jié)論與討論

隨著分子標記技術(shù)的問世，Helentjaris構(gòu)建了首張玉米RFLP連鎖圖譜，但由于該標記技術(shù)費用昂貴、信息量小、操作時間長等缺點逐漸被淘汰［9，10］。微衛(wèi)星DNA分子標記，即SSR標記廣泛存在于真核生物中，具有多態(tài)性豐富、共顯性、操作簡單等優(yōu)點正大量應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、品種純度鑒定以及物種進化等方面的研究［8］。實驗以玉米細胞質(zhì)雄性不育系cms-合344和輻63018為試驗材料，以輻63018為輪回親本構(gòu)建BC1F1群體和BC2F1群體，利用60對在兩親本間呈現(xiàn)多態(tài)性的SSR標記，構(gòu)建兩個世代群體遺傳圖譜。BC1F1群體覆蓋玉米基因組總長度為1 637.38 cM，標記間平均圖距為27.29 cM，BC2F1群體覆蓋玉米基因組總長度為1 183.64 cM，標記間平均圖距為19.73 cM，分析兩個群體圖譜間的差異是由于BC2F1經(jīng)回交兩代后群體內(nèi)雜合度降低而導致標記交換的可能性變小，最終使得覆蓋長度和平均圖距減少。圖譜為玉米不育系回交群體的分子標記奠定了基礎(chǔ)，對于發(fā)掘雙親之間其他優(yōu)異農(nóng)藝性狀基因資源具有非常重要的價值。

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Comparative Analysis of Genetic Linkage M ap of M aize Sterile Line Backcross Transformation Populations

Sun Lifang，W ang Zhen，W ang Xia，Deng Jie，Hu Kaifeng，W ang Jingze，Yang Kejun
（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Maize sterile line CMS-He as materials，344BC1F1 and BC2F1 populations were built by using Fu63018 as recurrent parent and their SSR markers genetic linkage maps were obtained.The results showed that a total of 60 pair markers displayed steady polymorphism between two parents；the BC1F1 group covered 1 637.38 cM length of maize genome，and the BC2F1 group covered 1 183.64 cM，the average marker interval was 27.29 cM and 19.73 cM，respectively；the number and type of markers in each chromosome were consistent with two maps，but the position of each marker was changed.The analysis laid the theoretical basis for molecular assisted selection of maize sterile line backcross transportation.

maize；backcross；genetic linkage map

S513

A

1002-2090（2016）03-0001-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.001

2015-07-15

農(nóng)業(yè)部公益性項目（201303007）；黑龍江省青年科學基金（QC2015029）；黑龍江八一農(nóng)墾大學作物學科學技術(shù)骨干科研啟動項目（ZWXQDJ-6）。

孫麗芳（1981-），女，講師，吉林大學畢業(yè)，現(xiàn)主要從事玉米遺傳育種方面的研究工作。

楊克軍，男，教授，博士研究生導師，E-mail：byndykj@163.com。