宮內七氟醚暴露對仔鼠海馬CA1區(qū)caspase-3表達及早期認知功能的影響

陳 弦 萬海方 范 皓 陶 凡

宮內七氟醚暴露對仔鼠海馬CA1區(qū)caspase-3表達及早期認知功能的影響

陳 弦 萬海方 范 皓 陶 凡

目的研究宮內暴露于七氟醚對仔鼠海馬CA1區(qū)神經元凋亡及早期認知功能的影響。方法成年性成熟Wistar雌鼠交配妊娠后取孕鼠8只，隨機分為對照組七氟醚組，每組4只。七氟醚組于孕19天時暴露于2.4%七氟醚6h，對照組不給予任何藥物。應用免疫組化法觀察兩組仔鼠在出生后第1天（PN1）、第14天（PN14）、第21天（PN21）海馬CA1區(qū)caspase-3的表達情況。出生后32～37天對仔鼠進行Morris水迷宮實驗以測定其認知功能。結果出生后第1天，七氟醚組仔鼠海馬CA1區(qū)caspase-3總光密度值（IOD）明顯高于對照組仔鼠[（60309.6±6403.6）比（17680.5± 9326.7），P＜0.05]，出生后第14、21天，七氟醚組仔鼠海馬CA1區(qū)caspase-3總光密度值與對照組仔鼠相比，差異無統(tǒng)計學意義[（3213.7±582.8）象素比（8503.2±2402.5）象素，（2046.0±62.7）象素比（4839.9±716.3）象素，P＞0.05]。七氟醚組仔鼠逃避潛伏期與對照組仔鼠相比，差異無統(tǒng)計學意義[（80.0±13.5）s比（80.7±19.1）s，（52.2±10.3）s比（41.0±19.7）s，（29.2±11.4）s比（28.5±15.3）s，（22.0±5.5）s比（19.2±6.7）s，（16.2±2.8）s比（20.3±4.8）s，P＞0.05]，七氟醚組仔鼠穿越目標象限次數與對照組仔鼠相比無統(tǒng)計學差異[（8.3±0.8）次比（8.2±3.0）次，P＞0.05]。結論孕晚期Wistar母鼠暴露于2.4%七氟醚對仔鼠海馬CA1區(qū)神經元發(fā)育的影響呈“一過性損傷”，并不會引起子代早期認知功能異常。

仔鼠；七氟醚；海馬CA1區(qū)；認知功能；caspase-3；水迷宮

KEY WORDS offspring;sevoflurane;the CA1 region of hippocampus;cognitive function;caspase-3;Morris water maze

隨著二胎政策普遍開放，疤痕子宮妊娠、高齡產婦、妊娠期合并嚴重并發(fā)癥等產婦數量越來越多。在某些緊急狀況下，如胎兒急性窘迫，胎盤早剝大出血、凝血功能障礙等，產婦需在全身麻醉下行緊急剖宮產術。七氟醚屬于新型的鹵素類吸入麻醉劑，因其誘導迅速、刺激性小、血液溶解度低，代謝快等優(yōu)勢而廣泛用于全身麻醉。實驗研究發(fā)現吸入麻醉劑導致神經變性的特性具有劑量依賴性[1]，因此了解孕期手術常用的吸入麻醉濃度是否會導致胎兒大腦神經變性十分重要。

1 材料與方法

1.1 動物選擇與分組成年性成熟雌性Wistar大鼠16只，體質量180～210g，成年性成熟雄性Wistar大鼠8只，體質量300g，由浙江中醫(yī)藥大學動物中心提供,動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002。雌雄大鼠合籠交配。應用托盤陰栓檢查法于次日早晨觀察托盤中是否有陰栓，發(fā)現陰栓當天記為受孕第0日。懷孕雌鼠共8只，采用隨機數字表法分為七氟醚組和對照組，每組4只。七氟醚組于孕19天時吸入2.4%七氟醚6h，對照組不給予任何藥物。

1.2 自制麻醉箱將七氟醚組孕鼠于孕19天放入20cm×12cm×10cm自制小盒內，在盒的兩側各有一小孔，一端接小動物麻醉機（浙江中醫(yī)藥大學動物中心提供），七氟醚濃度2.4%，持續(xù)時間6h。另一端為出氣端，接廢氣吸收罐以吸收CO2等。將孕鼠置于空氣條件下自然蘇醒。

1.3 組織切片制備孕鼠自然分娩，七氟醚組和對照組仔鼠中分別取出生后第1（Postnatal Day 1，PN1）、14（PN14）、21（PN21）天仔鼠各6只，斷頭取腦，固定于10%中性甲醛溶液中72h。切取包含海馬部位的腦組織塊，進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，行冠狀位連續(xù)切片，片厚約4μm。

1.4 免疫組化染色（1）具體步驟：切片置60℃烤箱烘烤2h；切片脫蠟至水；蒸餾水洗2min；高壓熱修復：高壓鍋內放適量自來水，將修復液倒入燒杯內，將燒杯置于高壓鍋內煮沸，將切片放入裝有修復液的燒杯內，蓋緊高壓鍋，加熱至設定壓力冒氣后持續(xù)2min，自來水冷卻；3%H2O2溶液阻斷過氧化物酶，10min；PBS洗5min×3次；滴加一抗，4℃冰箱過夜；PBS洗5min×3次；滴加二抗，37℃孵育15min；PBS洗5min×3次；DAB顯色1～2min；復染、透明后封片。（試劑盒由santa cruz公司提供，批號15383803）。（2）圖像分析：Nikon eclipse 80i顯微鏡（Nikon公司）下觀察，400倍光鏡下觀察細胞內出現棕黃色顆粒為caspase-3陽性細胞，用顯微鏡下拍攝照片，采用Carl Zeiss Imaging Systems圖象分析軟件（Carl Zeiss公司）計算總光密度，以反映caspase-3的表達情況。

1.5 Morris水迷宮實驗兩組分別選取6只仔鼠，于出生后32～37天進行Morris水迷宮實驗。Morris水迷宮由一個直徑120cm，高50cm的圓形水池構成，水池內壁為黑色，水池劃分為4個象限，每個象限設置入水點標記，于第4象限內放置直徑12cm，高29cm的透明平臺，槽內水深30cm，使平臺沒于水下1cm，水溫控制在23～25℃，水池上方安裝自動攝像系統(tǒng)[2]。在前5天的定位航行實驗中，各組仔鼠每日訓練3次，每次間隔1h。將仔鼠分別從第1、2、3象限的入水點面向池壁放入水中。記錄仔鼠在120s內尋找到平臺的時間（逃避潛伏期），超過120s未能找到平臺者，記為120s，所有仔鼠均在平臺上停留10s。取每天3次訓練的平均值為當天的逃避潛伏期；在第6天的空間探索實驗中，撤去平臺，將仔鼠從距離目標象限最遠處面向池壁放入水中，計數仔鼠在1min內穿越目標象限的次數。

1.6 統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（x±s） 表示。采用兩獨立樣本t檢驗：先進行方差方程的Levene檢驗，若方差齊，采用t檢驗；若組間方差不齊，采用近似t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下仔鼠海馬CA1區(qū)caspase-3陽性細胞表達情況的觀察出生后第1天，七氟醚組仔鼠CA1區(qū)的神經元可見大量棕黃色顆粒彌散分布在胞漿內，著色深，細胞失去正常形態(tài)，胞體增大呈多邊形；對照組仔鼠CA1區(qū)的神經元可見少量棕黃色顆粒，著色淺，細胞形態(tài)未見明顯改變。出生后第14天及21天，兩組仔鼠CA1區(qū)的神經元胞漿無明顯著色，細胞形態(tài)未見明顯改變。

2.2 兩組仔鼠海馬CA1區(qū)caspase-3陽性表達出生后第1天，七氟醚組仔鼠海馬CA1區(qū)caspase-3陽性表達強于C組仔鼠（P＜0.05）；出生后第14天及第21天，兩組仔鼠海馬組織caspase-3陽性表達無明顯差異（P＞0.05）。見表1，圖1～2（封三）。

表1 仔鼠海馬組織caspase-3蛋白總光密度值比較（象素，x±s）

2.3 兩組仔鼠逃避潛伏期、穿越目標象限次數的比較兩組仔鼠逃避潛伏期、穿越目標象限次數比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

3 討論

結合預實驗結果及文獻資料，本實驗選擇2.4%（=1MAC）[3]七氟醚吸入6h作用于孕鼠，觀察此濃度對仔鼠大腦神經元發(fā)育可能存在的影響。

大鼠的突觸發(fā)生期主要是在出生前一兩天至出生后2周[4]，有研究[5-6]認為，此期接觸七氟醚會影響仔鼠突觸形成導致神經發(fā)育受損。本實驗選擇在孕晚期突觸形成階段作為研究對象，觀察在神經發(fā)育高峰期吸入七氟醚是否對噬齒類動物子代大腦神經發(fā)育造成影響。

Caspase是細胞凋亡過程中重要的蛋白酶，其中Caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行因子[7]，常用于檢測早期凋亡。海馬CA1區(qū)與記憶、學習密切相關，是藥物導致中樞神經系統(tǒng)毒性的敏感區(qū)域，易受麻醉劑影響而出現神經變性[8]。研究[9]表明，七氟醚可激活caspase-3引起細胞凋亡。在本實驗中，孕19天仔鼠海馬CA1區(qū)的神經細胞在出生后第1天凋亡明顯，隨時間延長，其神經細胞凋亡情況明顯好轉，出生后第14天、21天七氟醚組仔鼠caspase-3總光密度值與對照組仔鼠無明顯差異。提示，孕晚期吸入七氟醚對仔鼠海馬CA1區(qū)神經元的損傷或許僅為一過性損傷，并不持續(xù)到遠期。

Morris水迷宮是評價海馬依賴的空間參考記憶的主要行為學實驗方法之一[10]。海馬區(qū)神經元損傷會影響空間任務的完成。在出生后32～37天間，各組仔鼠的逃避潛伏期隨訓練天數增加逐漸縮短，而孕19天組仔鼠與對照組仔鼠在每一天訓練中逃避潛伏期時間均無明顯差異，提示孕晚期吸入七氟醚并未對仔鼠早期的學習能力造成影響。空間探索實驗反映仔鼠的記憶能力，兩組仔鼠在穿越目標象限次數上并無統(tǒng)計學差異，提示孕晚期吸入七氟醚并不會降低仔鼠的空間記憶能力。

有研究發(fā)現，新生大鼠吸入七氟醚會導致其學習記憶功能降低[11-12]。出生后2周內及出生前1～2天均屬于突觸發(fā)育期，而本實驗結果提示，孕19天母鼠吸入七氟醚并不會導致仔鼠學習記憶能力下降?？紤]原因可能為胎盤屏障對七氟醚擴散入胎鼠體內有部分阻礙作用，因此實際作用于胎鼠的七氟醚濃度較低，使得仔鼠海馬CA1區(qū)神經元損傷僅為一過性，然而具體機制仍需進一步實驗研究來完善。

綜上所述，孕晚期母體暴露于2.4%七氟醚可引起仔鼠海馬CA1區(qū)神經元“一過性損傷”，但不會引起子代早期的認知功能障礙。

表2 兩組仔鼠逃避潛伏期（PN32-26）、穿越目標象限次數（PN37）比較（s，x±s）

［1］Wei H，Liang G，Yang H，et al.The common inhalational anesthetic isoflurane induces apoptosis via activation of inositol 1，4，5-trisphosphate receptors［J］.Anesthesiology，2008，108（2）：251-260.

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［10］Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nat Protoc，2006，1（2）：848-858.

［11］謝娟，孫建良，孔飛娟，等.不同濃度七氟醚麻醉對新生大鼠認知功能的影響［J］.中華麻醉學雜志，2013，33（8）：948-950.

［12］王來，薛慶生，羅艷，等.不同濃度七氟醚麻醉對新生大鼠遠期學習記憶能力的影響［J］.中華麻醉學雜志，2013，33（2）：191-193.

（收稿：2016-07-20修回：2016-10-18）

Effect of Sevoflurane Exposure in the Uterus on Rat Offspring's Caspase-3 Expression in the CA1 Region of Hippocampus and the Early Cognitive Function

CHEN Xian,WAN Haifang,FAN Hao,TAO Fan.Department of Anesthesiology,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou(310003)，China

Objective To investigate the effect of sevoflurane exposure in the uterus on the rat offspring's brain neural apoptosis in the CA1 region of hippocampus and the cognitive function at early age.M ethods Eight adult female Wistar rats got pregnant.With the random number table method,pregnant rats were divided into 2 groups：control group and sevoflurane group,with 4 rats in each group.Rats in sevoflurane group were exposed to 2.4%sevoflurane for 6 h on the gestational 19th day and rats in control group were fed in the same condition in the absence of sevoflurane.The expression of caspase-3 in the CA1 region of hippocampus on PN,PN14 and PN21 were determined by immunohistochemistry.The early cognitive function of the offspring from PN32 to PN37 was tested by Morris water maze test.Results Compared to the offspring of control group,the offspring of sevoflu rane group had higher integral optical density（IOD）of caspase-3 in the CA1 region of hippocampus on PN1（60309.6±6403.6 vs 17680.5±9326.7,P＜0.05）and similar IOD on PN14 and PN21（PN14：3213.7±582.8 vs 8503.2± 2402.5;PN21：2046.0±62.7 vs 4839.9±716.3;all P＞0.05）.No significant differences in escape latency（80.0±13.5s vs 80.7±19.1s,52.2±10.3s vs 41.0±19.7s,29.2±11.4s vs 28.5±15.3s,22.0±5.5s vs 19.2±6.7s,16.2±2.8s vs 20.3±4.8s）and explored number in the target quadrant（8.3±0.8 times vs 8.2±3.0 times）were noted between control group and sevoflurane group（all P＞0.05）.Conclusion The expose to 2.4%sevoflurane during late pregnancy causes temporary injury to brain neural development in the CA1 region of hippocampus of rat offspring.It has no significant effect on the cognitive function of the rats at the early age.

杭州市衛(wèi)生科技計劃項目（No.2012A044）

杭州市紅十字會醫(yī)院麻醉科（杭州310003）

陶凡，Tel：15867199018；E-mail：461226058@qq.com