非洲菊離體保存技術概述及展望

張志剛

摘要：介紹非洲菊常溫離體保存、低溫離體保存、超低溫離體保存方法的原理、種類、特點、效果及研究進展，展望相關技術的研究前景，為非洲菊種質(zhì)資源保存及其在遼寧地區(qū)的栽培提供參考。

關鍵詞：離體保存；非洲菊；常溫；低溫；超低溫

中圖分類號：S682.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2016）03-0001-02

非洲菊（Gerbera jamesonii）別名扶郎花、燈盞花，是菊科非洲菊屬多年生宿根常綠草本，主產(chǎn)于南非，少數(shù)分布在亞洲。其花大，色彩豐富，花枝挺拔，具有很高的觀賞價值；在適宜的條件下能夠周年開花，產(chǎn)花量高，切花的瓶插壽命長，具有較高的經(jīng)濟價值。目前，非洲菊已成為世界五大切花之一。

1 非洲菊常溫離體保存方法

1.1 一般保存

該方法被廣泛采用。采用此方式雖然可以隨時進行繁殖，但需要不斷的繼代培養(yǎng)，浪費人力物力，占用空間大，管理費用高，且容易造成材料污染、混淆甚至丟失，易導致自然變異和種質(zhì)退化。

1.2 降低培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)水平

通過改變培養(yǎng)基中的物質(zhì)濃度和種類，達到培養(yǎng)物保持最低生長水平的目的。與MS及1/4MS等幾種培養(yǎng)基相比，無菌水保存菠蘿試管苗的效果更好，保存1 a后81%的植株仍有活力。用無菌水保存菠蘿試管苗，在不加任何生長素和細胞分裂素、只加入5.0 mg/L根皮苷的MS培養(yǎng)基上，常溫下短果杜鵑種質(zhì)可保存40個月，解除保存后試管苗恢復生長快，且苗粗壯生長旺盛，形態(tài)結構未出現(xiàn)異常。香青蘭試管苗在1/4MS培養(yǎng)基中保存，前期存活率較低，但保存時間延長4個月以上。

1.3 在培養(yǎng)基中添加生長調(diào)節(jié)劑

在培養(yǎng)基中適當添加一些生長延緩劑，可延緩或抑制植株細胞生長。最常用的生長抑制劑有多效唑（PP333）、丁酰井（B9）、脫落酸（ABA）和矮壯素（CCC）等。唐鳳鸞等用多效唑和矮壯素對保存黃花蒿組培苗時發(fā)現(xiàn)，在未加延緩劑的MS培養(yǎng)基上，材料生長快、節(jié)間長、植株高、莖上部很快在瓶內(nèi)卷曲成團，60 d后植株老化變黃逐漸枯死，到90 d時已無植株存活。而經(jīng)延緩劑處理的試管苗生長速度明顯減慢，植株較矮，節(jié)間短，莖增粗，葉色濃綠?？梢娧泳弰┛山档忘S花蒿試管苗的生長速度，減少營養(yǎng)消耗，從而延長保存時間。洪森榮等以香果樹試管苗的帶芽莖段為離體保存材料，發(fā)現(xiàn)B9，ABA，CCC三種植物生長抑制劑均隨著濃度的增加而使香果樹帶芽莖段的成活率提高，但達到一定濃度后成活率下降。

1.4 提高培養(yǎng)基的滲透壓

通過提高培養(yǎng)基的滲透壓抑制培養(yǎng)材料生長，可達到保存種質(zhì)的目的。最常用的方法是在培養(yǎng)基中加入滲透性化合物，如蔗糖、甘露醇、山梨醇等。這些滲透性化合物能提高培養(yǎng)基的滲透勢負值，造成水分逆境，從而降低細胞生長擴大所必需的膨壓，使細胞吸水困難，減弱其新陳代謝，延緩細胞生長。同時，細胞壁酶的活性受到抑制，生長受阻，減少養(yǎng)分水分的消耗。雖然保存不同培養(yǎng)材料所需要的滲透物質(zhì)含量不同，但試管苗存活率、保存時間、恢復生長率受培養(yǎng)基中高滲物質(zhì)含量影響的變化趨勢基本一致，均呈拋物線型。

一般來說，在保存初期這類化合物對試管苗存活率的影響不大，隨著保存時間的延長，對減緩培養(yǎng)材料生長、延長保存時間的作用愈加明顯。史永忠等認為在培養(yǎng)基中添加甘露醇，可延長蘋果試管苗的保存期，提高其成活率。葉秀仙等以文心蘭叢生芽為離體保存材料，研究限制生長法離體保存文心蘭種質(zhì)的適宜條件，結果表明，在常溫條件下培養(yǎng)基中添加30 mg/L甘露醇，可有效延長文心蘭試管苗繼代間隔時間，保存180 d后存活率達l%。傅伊倩等得出結論：含有高濃度蔗糖和甘露醇的培養(yǎng)基可以使百合品種大花卷丹的試管苗保存1 a以上。岳新麗等的研究表明，20 mg/L山梨醇對馬鈴薯試管苗的保存具有明顯抑制作用，可顯著提高馬鈴薯試管苗成活率。

1.5 降低培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度

通過降低培養(yǎng)基中氧分壓來減慢培養(yǎng)材料的生長速度，從而保存植物組織培養(yǎng)材料的想法最早是由Caplin（1959）提出的，他在離體保存的胡蘿卜根次生韌皮部上覆蓋一層厚達38 mm的重石油，8個月后蓋有重石油的材料生長很少，且培養(yǎng)基未見減少，仍可見鮮綠色，相反未覆蓋礦物油的材料變成褐色，且培養(yǎng)基接近干涸。Gillis和Dengh在23 ℃的常溫條件下，以歐洲甜櫻桃的嫩芽為試材，浸沒在石蠟中離體保存6個月后，也得到了相似的結果。

1.6 膠囊化或脫水處理

膠囊化是指在種質(zhì)保存過程中用海藻酸膠或吉蘭糖膠將保存材料包埋形成膠囊的過程。脫水則是利用硅膠或空氣層流櫥無菌空氣流對種質(zhì)進行干燥或者是將種質(zhì)保存在含有高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中。Nitzsphe于1980年首次報道了將脫水干燥法應用于組培材料中來保存植物種質(zhì)資源中期的方法。隨著人工種子研究的逐漸發(fā)展，該法開始備受重視，并初步在一些物種上實現(xiàn)了3個月到1 a的保存期。

1.7 復合限制生長措施

很多試驗同時采用幾種限制生長方法來實現(xiàn)種質(zhì)的離體保存。蘭芹英等對蒙自鳳仙花莖尖進行了離體保存的研究，結果表明：最適保存條件為12 ℃，甘露醇含量為3%，保存1 a后存活率仍為100%；存活的幼苗及莖尖接種于增殖培養(yǎng)基，仍能正常生長、增殖和生根。

洪森榮等研究了PP333對野葛常溫和低溫保存的影響，得出的結論為：濃度為5 mg/L的PP333結合4 ℃低溫可以提高試管苗的成活率，最適合野葛離體保存。葉景豐以西伯利亞花楸幼嫩莖段為外植體，研究結果表明：試管苗在2±2 ℃的冰箱冷藏室，可有效保存240 d以上，在含有瓊脂7 mg/L和蔗糖50 mg/L的MS培養(yǎng)基上，試管苗的生長得到明顯抑制。

2 非洲菊低溫離體保存方法

緩慢生長保存最常用的方法是降低培養(yǎng)溫度，現(xiàn)已廣泛應用到研究中。獼猴桃、梨、蘋果、草莓和屬于無性繁殖蔬菜的芋頭、馬鈴薯等作物，均可通過降低培養(yǎng)溫度得到最佳保存效果。正確選擇低溫是延長保存時間和提高保存效果的關鍵，不同植物及同一種植物不同基因型對低溫的敏感性是不同的。張玉芹等較系統(tǒng)地研究低溫保存百合試管苗的技術，以鱗片為外植體組織培養(yǎng)并對其試管苗保存，研究結果表明：在常溫條件下，培養(yǎng)基中無論添加ABA還是MNT，每3個月就要繼代1次保存百合試管苗，而在1～5 ℃的低溫條件下保存18個月后，大部分百合試管苗生長正常。

3 非洲菊超低溫離體保存方法

超低溫冷凍保存的冷源一般為深冷冰箱、干冰（-79 ℃）、液態(tài)氮及液氮蒸汽相，保存溫度維持在-196 ℃。在這樣的低溫下，植物材料的新陳代謝和生長活動基本停止，處于生機“停頓”狀態(tài)，很可能極大地延長保存材料壽命，且有效保持材料的遺傳穩(wěn)定性，從而安全長期的保存一些珍貴稀有種質(zhì)。劉燕等曾對18個科47個種花卉種子（包括頑拗性種子和正常性種子）進行超低溫保存，認為目前梅花花粉長期保存的最佳方法是液氮保存。Vida等以栗子莖尖為保存材料，研究了超低溫保存過程中的影響因素，建立了有效的超低溫保存程序。Tsai等研究了木瓜的超低溫保存技術，建立了高效的超低溫保存的玻璃化程序。

超低溫保存法主要包括簡化控速超低溫保存法（慢速降溫法、兩步降溫法、逐級降溫法）、干燥法、預培養(yǎng)法、預培養(yǎng)干燥法、包埋干燥法、玻璃化法和包埋玻璃化法等。

4 結語

非洲菊品種雜合性高，種子實生繁殖的后代易發(fā)生變異。采用離體保存技術可以有效地克服組培生產(chǎn)中存在的問題，打破季節(jié)生長界限，有效節(jié)約空間，方便交通運輸。但是目前關于非洲菊離體保存方面的研究報道幾乎是空白，對保存影響因素的研究及分析也很少。

應用緩慢生長法在培養(yǎng)基中加入生長抑制劑和滲透物質(zhì)對非洲菊試管苗進行保存，既可以在需要時進行快速繁殖，又可以延長保存周期，達到中期保存非洲菊種質(zhì)的目的。因此，有關科研單位和高校應開展非洲菊種質(zhì)資源離體保存研究，并進行遺傳穩(wěn)定性相關試驗，為非洲菊離體保存提供有力的數(shù)據(jù)保障和技術支撐。