誘導(dǎo)子和前體協(xié)同添加對懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響

吳桂容，曲芬霞，何彩梅，陳春嵐，陳興田

（賀州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542800）

誘導(dǎo)子和前體協(xié)同添加對懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響

吳桂容，曲芬霞，何彩梅，陳春嵐，陳興田

（賀州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542800）

在雞血藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的動力學(xué)基礎(chǔ)上，研究誘導(dǎo)子（茉莉酸甲酯）、前體（苯丙氨酸、乙酸鈉）以及兩者協(xié)同添加對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響。結(jié)果表明：懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞的異黃酮合成與細(xì)胞生長之間存在半偶聯(lián)關(guān)系，指數(shù)生長期前期的第3 d有最大生長加速度，此時是最優(yōu)添加時間。誘導(dǎo)子和前體單獨添加均能促進(jìn)異黃酮的合成，茉莉酸甲酯、苯丙氨酸和乙酸鈉的最佳添加濃度分別為100、300、100 μmol/L，異黃酮含量分別為對照的1.34、1.83和1.57倍。誘導(dǎo)子和前體協(xié)同添加對異黃酮合成的促進(jìn)作用強于單獨添加，茉莉酸甲酯+苯丙氨酸+乙酸鈉處理下異黃酮含量高達(dá)19.32 mg/L，為對照的3.62倍。

雞血藤；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；異黃酮；誘導(dǎo)子；前體；協(xié)同作用

吳桂容，曲芬霞，何彩梅，等.誘導(dǎo)子和前體協(xié)同添加對懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43 （5）：129-134.

雞血藤是豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤莖，主產(chǎn)廣西，廣東、云南等地也有分布。雞血藤是一種補血、活血的傳統(tǒng)大宗中藥材，具有促進(jìn)造血、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗病毒等多種藥理作用［1-2］。由于長期對野生雞血藤資源的無度利用，我國野生雞血藤數(shù)量急劇減少，資源日益枯竭。目前，雖然已成功通過扦插育苗法對雞血藤進(jìn)行人工栽培繁殖，但其扦插育苗在育苗材料選材上受到限制，需要由兩年生穗條扦插才可成活，其規(guī)?；瘧?yīng)用受到限制［3］。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用植物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)獲得次生代謝產(chǎn)物得到了極大發(fā)展，如大豆異黃酮青天葵［4］、煙草［5］、大豆［6］等，目前尚未見雞血藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的相關(guān)報道。

雞血藤成分構(gòu)成復(fù)雜，其藥理作用的關(guān)鍵活性成分是異黃酮類化合物，主要包括大豆黃酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂異黃酮4種異黃酮活性成分［7］。異黃酮類化合物對組織培養(yǎng)有抑制作用，應(yīng)用植物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)是大規(guī)模獲得異黃酮活性成分的有效手段［8］。目前，本課題組已成功誘導(dǎo)雞血藤愈傷組織［9］，構(gòu)建雞血藤懸浮細(xì)胞系并初步完成培養(yǎng)工藝初步優(yōu)化，但其產(chǎn)量尚未達(dá)到工業(yè)化要求。在植物細(xì)胞培養(yǎng)中添加誘導(dǎo)子是提高目的化合物產(chǎn)量的常用方法，其中茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）是植物細(xì)胞培養(yǎng)中常用的一種化學(xué)誘導(dǎo)子，其能有效調(diào)控次生代謝途徑，提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量［10］。此外，在植物細(xì)胞培養(yǎng)中加入目的化合物生物合成的前體也能大幅提高產(chǎn)物產(chǎn)量，苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）和乙酸鈉（sodium acetate，NaAc）是植物合成異黃酮過程中的關(guān)鍵化合物［11］。本研究在雞血藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的動力學(xué)基礎(chǔ)上，研究誘導(dǎo)子、前體和兩者協(xié)同添加對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響，以期為雞血藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)異黃酮的工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為雞血藤愈傷組織，取自雞血藤嫩葉部位，以MS培養(yǎng)基+1.0 mg/L 6-BA（6-芐基氨基嘌呤）+ 0.5 mg/L NAA（1-萘乙酸）+30 g/L蔗糖+0.1 g/L VC誘導(dǎo)愈傷組織［9］。愈傷組織在25（± 1）℃、暗環(huán)境下培養(yǎng)，每15 d繼代一次。愈傷組織經(jīng)過傳代篩選獲得淺黃色、疏松顆粒狀的愈傷組織培養(yǎng)系，準(zhǔn)備接種。

1.2 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件

將上述愈傷組織（約為5 g鮮重/瓶）接入液體MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+0.1 g/L+3 g/L水解酪蛋白中。細(xì)胞置于含100 mL培養(yǎng)基的300 mL三角燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，于25 （±1）℃暗環(huán)境下以100 r/min的速度搖瓶懸浮培養(yǎng)12 d，每個處理3次重復(fù)。

1.3 添加物質(zhì)的處理

茉莉酸甲酯濃度設(shè)為25、50、75、100、125、150 μmol/L，苯丙氨酸濃度設(shè)為0、50、100、200、 300、400、500 μmol/L，乙酸鈉濃度設(shè)為0、25、50、100、150、200、250 μmol/L，將不同濃度的誘導(dǎo)子和前體經(jīng)除菌過濾后添加細(xì)胞培養(yǎng)液中，添加時間由動力學(xué)研究結(jié)果確定。協(xié)同添加中將最佳濃度的誘導(dǎo)子和前體分別或者共同添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中。

1.4 生物量測定

取雞血藤細(xì)胞培養(yǎng)物，2 000 r/min離心10 min，于60℃干燥至恒重，生物量為每升培養(yǎng)基收獲的細(xì)胞干重（g/L）。

1.5 異黃酮含量測定

將干燥細(xì)胞充分研磨后于95%乙醇冷浸24 h，超聲波處理30 min，過濾。提取3次，合并濾液，40℃下減壓濃縮，100 mL乙酸乙酯∶水（5∶1，V/V）混合溶液萃取3次。而細(xì)胞過濾發(fā)酵液經(jīng)低溫冷凍濃縮后直接通過乙酸乙酯萃取抽提。合并乙酸乙酯抽提液，40℃下減壓蒸餾。甲醇溶解定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后HPLC定量分析。

色譜條件：Agilent1100高效液相色譜儀，色譜柱：Purospher Star Cl8柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流動相為甲醇：水：乙酸（10∶10∶1，V/V/V）溶液，柱溫25℃，進(jìn)樣體積20 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長260 nm，以外標(biāo)法計算總異黃酮含量。單體標(biāo)準(zhǔn)品分別是大豆黃酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂異黃酮（購自Sigma，純度98%）?？偖慄S酮含量為細(xì)胞內(nèi)及發(fā)酵液上清中異黃酮含量之和，以每升培養(yǎng)液內(nèi)4種異黃酮的總量表示（mg/L）。

用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合、模型求導(dǎo)和多重比較分析（LSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸浮培養(yǎng)雞血藤細(xì)胞的生長和異黃酮合成

懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞的生長和異黃酮合成曲線如圖1所示。雞血藤細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)S形分布，其中培養(yǎng)0～3 d為細(xì)胞生長延滯期，生長緩慢，異黃酮合成也未開始。從培養(yǎng)3 d開始進(jìn)入指數(shù)生長期，細(xì)胞快速生長，生物量至培養(yǎng)8 d達(dá)到最大（12.03 g/L），異黃酮含量也在培養(yǎng)4 d開始快速上升。指數(shù)生長期過后即快速進(jìn)入衰亡期，穩(wěn)定期較短，生物量從培養(yǎng)8 d開始衰減，但異黃酮合成繼續(xù)進(jìn)行，異黃酮含量在培養(yǎng)12 d達(dá)到最大（5.34 mg/L）。異黃酮合成與細(xì)胞生長之間存在著半偶聯(lián)關(guān)系，與其他植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)的結(jié)果類似［12］。

圖1 懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞生長和異黃酮合成曲線

2.2 懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞生長動力學(xué)

在批次培養(yǎng)中，一般用Logistic曲線對細(xì)胞生長曲線進(jìn)行擬合。懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞生長的Logistic擬合曲線如圖2。擬合函數(shù)為y=11.18+ （2.11-11.18）/（1+（x/4.59） 6.86）（R2=0.963），表明Logistic函能較好地對細(xì)胞生長進(jìn)行擬合。進(jìn)一步對擬合函數(shù)進(jìn)行一階和二階求導(dǎo)，從而得出雞血藤細(xì)胞生長的速度和加速度（圖3）。結(jié)果表明細(xì)胞生長速率先增大后減小，至培養(yǎng)5 d有最大生長速度（圖3A）；而細(xì)胞生長加速度先增大再減小，再小幅回升，至培養(yǎng)3 d有最大生長加速度（圖3B）?？梢娂?xì)胞生長加速度最大時（通常是指數(shù)生長期的前期）是添加物質(zhì)的最佳時間，此時進(jìn)行處理能顯著促進(jìn)植物細(xì)胞次生代謝物的合成［12-13］。因此，本研究選擇繼代培養(yǎng)后3 d添加誘導(dǎo)子和前體。

圖2 雞血藤細(xì)胞生長的Logistic擬合曲線

圖3 雞血藤細(xì)胞生長的Logistic函數(shù)的一階求導(dǎo)（A）和二階求導(dǎo)（B）

2.3 誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響

本研究于繼代培養(yǎng)第3 d加入不同濃度茉莉酸甲酯，于第12 d收獲細(xì)胞，結(jié)果如圖4所示。隨著茉莉酸甲酯濃度的升高，雞血藤細(xì)胞生長受到的抑制作用增強，在150 μmol/L茉莉酸甲酯作用下生物量僅剩對照的55.78%。而異黃酮含量隨著茉莉酸甲酯濃度的升高先增加后減少。其中低濃度的茉莉酸甲酯（25 μmol/L）對異黃酮的合成未見顯著促進(jìn)作用；在100 μmol/L茉莉酸甲酯作用下異黃酮含量達(dá)到最高、達(dá)8.21（±0.45 ）mg/L（為對照組的1.34倍）。以上結(jié)果說明誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯能顯著促進(jìn)異黃酮的合成，其最佳添加濃度為100 μmol/L。

2.4 前體苯丙氨酸和乙酸鈉對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響

圖4 不同濃度茉莉酸甲酯對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響

圖5 不同濃度苯丙氨酸對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響

圖6 不同濃度乙酸鈉對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響

本研究對兩種前體物質(zhì)苯丙氨酸和乙酸鈉分別進(jìn)行研究，分別于繼代培養(yǎng)后3 d添加。不同濃度的前體苯丙氨酸對細(xì)胞生長和異黃酮合成的影響如圖5所示。結(jié)果顯示隨著苯丙氨酸濃度的升高，其對細(xì)胞生長的抑制作用增強，在500 μmol/L苯丙氨酸作用下生物量僅剩對照組的44.67%。苯丙氨酸的添加對異黃酮合成具有明顯的促進(jìn)作用，在50～300 μmol/L苯丙氨酸作用下異黃酮含量不斷增加，隨后則開始下降。其中在300 μmol/L苯丙氨酸作用下異黃酮含量達(dá)到最高、達(dá)8.21（± 0.45）mg/L（為對照的1.83倍）。以上結(jié)果說明前體物質(zhì)苯丙氨酸能顯著促進(jìn)異黃酮的合成，其最佳添加濃度為300 μmol/L。

不同濃度的前體乙酸鈉對細(xì)胞生長和異黃酮合成的影響如圖6所示。在25～100 μmol/L乙酸鈉作用下，其對異黃酮合成具有促進(jìn)作用，其中在100 μmol/L苯丙氨酸作用下異黃酮含量最高、達(dá)8.21（±0.45）mg/L（為對照的1.57倍）。隨著乙酸鈉濃度的升高，其對細(xì)胞生長的抑制作用增強，在250 μmol/L乙酸鈉作用下生物量僅剩對照的37.51%。說明前體物質(zhì)乙酸鈉也能顯著促進(jìn)異黃酮的合成，其最佳添加濃度為100 μmol/L，但其促進(jìn)效果要低于苯丙氨酸。

圖7 誘導(dǎo)子和前體協(xié)同添加對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響

2.5 誘導(dǎo)子和前體協(xié)同添加對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響

誘導(dǎo)子誘導(dǎo)和前體喂養(yǎng)兩條途徑均能促進(jìn)產(chǎn)物合成［14］，為進(jìn)一步研究誘導(dǎo)子和前體協(xié)同添加對雞血藤細(xì)胞產(chǎn)異黃酮的影響，于繼代培養(yǎng)后3 d分別將最佳濃度的誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯和前體苯丙氨酸和乙酸鈉分別或協(xié)同添加于懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞培養(yǎng)液中，結(jié)果見圖7。誘導(dǎo)子和前體協(xié)同添加對細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)強于誘導(dǎo)子的單獨添加，但弱于兩種前體物質(zhì)的協(xié)同添加。不同處理對類黃酮合成的促進(jìn)作用依次為：茉莉酸甲酯+苯丙氨酸+乙酸鈉＞茉莉酸甲酯+苯丙氨酸＞茉莉酸甲酯+乙酸鈉＞苯丙氨酸+乙酸鈉＞茉莉酸甲酯＞對照組。前體和誘導(dǎo)子對異黃酮合成表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，茉莉酸甲酯聯(lián)合苯丙氨酸、乙酸鈉的產(chǎn)量〔分別為17.14（±0.45）、15.69（±0.37）mg/L〕顯著高于茉莉酸甲酯的單獨添加（8.21± 0.47 mg/L）；茉莉酸甲酯+苯丙氨酸+乙酸鈉處理下異黃酮含量高達(dá)19.32 mg/L，為對照組的3.62倍。說明茉莉酸甲酯、苯丙氨酸和乙酸鈉三者的協(xié)同添加對促進(jìn)異黃酮合成具有最佳促進(jìn)效果。

3 結(jié)論與討論

自19世紀(jì)40年代植物細(xì)胞的實驗室培養(yǎng)技術(shù)建立以來，植物細(xì)胞培養(yǎng)快速發(fā)展，其中紅豆杉、人參、長春花、三七等珍稀藥用植物的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是國內(nèi)外研究的熱門方向［15］。藥用植物的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有生長快速、條件可控、次生代謝產(chǎn)物易合成的特點，是大規(guī)模獲得藥物有效成分、緩解珍稀中藥材供應(yīng)緊張的重要手段，但產(chǎn)量過低限制了植物細(xì)胞培養(yǎng)的商業(yè)化推廣［15-16］。誘導(dǎo)子（如茉莉酸甲酯）和前體（如苯丙氨酸、乙酸鈉）的添加是提高目的次生代謝物產(chǎn)量的常用手段，在植物細(xì)胞培養(yǎng)被中廣泛使用［13，17］。

誘導(dǎo)子能夠選擇性地誘導(dǎo)植物特定基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)特定的次生代謝物合成途徑，是影響植物次生代謝的有效因素［14］。研究表明，外源茉莉酸甲酯主要通過提高植物細(xì)胞的苯丙氨酸解氨酶（PAL）促進(jìn)異黃酮的合成［18］。而前體主要是植物次生代謝途徑的中間產(chǎn)物，前體的添加能有效消除途徑中的關(guān)鍵酶或化合物的阻礙作用，從而大幅度提高次生代謝物的產(chǎn)量［19］。如前體苯丙氨酸是黃酮類化學(xué)物B雜環(huán)和C雜環(huán)的直接組成部分，而乙酸鈉則能為黃酮類化學(xué)物A雜環(huán)中乙酸提供來源［11，20］。誘導(dǎo)子和前體的作用機制并不重疊，兩者具有協(xié)同添加的基礎(chǔ)。曲均革等［21］研究表明，誘導(dǎo)子和前體具有協(xié)同作用，茉莉酸甲酯、苯丙氨酸和光照的聯(lián)合使用使葡萄細(xì)胞培養(yǎng)合成花青素提高了2.5～5.2倍。

本研究中，懸浮培養(yǎng)的雞血藤細(xì)胞的異黃酮合成與細(xì)胞生長之間存在著半偶聯(lián)關(guān)系。動力學(xué)研究表明在指數(shù)生長期前期的第3 d有最大生長加速度，適宜作為誘導(dǎo)子和前體添加的時間。誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯的最佳添加濃度為100 μmol/L，異黃酮含量為對照的1.34倍；前體苯丙氨酸和乙酸鈉的最佳添加濃度分別為300、100 μmol/L，異黃酮含量分別為對照的1.83和1.57倍；誘導(dǎo)子和前體協(xié)同添加對異黃酮合成的促進(jìn)作用強于單獨添加，茉莉酸甲酯+苯丙氨酸+乙酸鈉處理下異黃酮含量高達(dá)19.32 mg/L，為對照組的3.62倍。誘導(dǎo)子和前體的協(xié)同添加大幅度了提高異黃酮產(chǎn)量，為雞血藤細(xì)胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)異黃酮的工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 白雪娜）

Synergistic effects of elicitors and precursors on the synthesis of isoflavones in cell suspension culture of Spatholobus suberectus Dunn.

WU Gui-rong，QU Fen-xia，HE Cai-mei，CHEN Chun-lan，CHEN Xing-tian
（College of Chemical and Biological Engineering，Hezhou University，Hezhou 542800，China）

The study investigated the effects of elicitors （methyl jasmonate，MJ），precursors （phenylalanine，Phe and sodium acetate，NaAc） and their synergistic effects on the synthesis of isoflavones in cell suspension culture of Spatholobus suberectus Dunn.，based on the result of kinetics research.The results showed that a semi-coupling relationship existed between cell growth of S.suberectus and isoflavone synthesis.At the 3rd d，the maximum acceleration of growth was found，indicating that it's suitable adding time for elicitors and precursors could promote the isoflavone synthesis，as the best added concentration for MJ，Phe and NaAc were 100 μmol/L，300 μmol/L and 100 μmol /L，which were 1.34，1.83 and 1.57 times to the control，respectively.The synergistic addition of elicitors and precursors significantly promoted isoflavone synthesis，with isoflavone content up to 19.32 mg/L in MJ+Phe+NaAc treatment （as 3.62 times to the control）.This study provided the theory basis for scale amplification in suspension cell culture of S.suberectus.

Spatholobus suberectus Dunn.；cell suspension culture；isoflavone；elicitors；precursors；synergistic effect

Q814

A

1004-874X（2016）05-0129-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.05.025

2016-01-18