黔南60份茶樹種質資源遺傳多樣性的SSR分析

張明澤，姚玉仙，陳世軍

(黔南民族師范學院 生物科學與農學院，貴州都勻 558000)

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黔南60份茶樹種質資源遺傳多樣性的SSR分析

張明澤，姚玉仙，陳世軍*

(黔南民族師范學院 生物科學與農學院，貴州都勻 558000)

摘要:為探索黔南野生茶樹種質資源的遺傳多樣性，利用SSR分子標記技術，對黔南60份茶樹資源進行了DNA遺傳多樣性分析。結果表明：15對引物均顯示多態(tài)性，基因多態(tài)性百分率為98.64%。15對SSR引物共擴增出147個觀測等位基因和73.778 6個有效等位基因，平均每個引物擴增9.8個觀測等位基因，4.918 6個有效等位基因。15個通用位點共產生280種基因型，平均每個位點18.7種基因型。遺傳多態(tài)信息量變異范圍為0.123 9～0.926 8，平均0.572 5，平均觀測雜合度、平均期望雜合度和平均Shannon’s信息指數分別為0.470 0、0.602 3、1.464 4。經聚類分析后，60份材料間遺傳相似系數在0.205 1～0.863 6之間，以平均遺傳相似系數0.477 5為閾值，可將60份種質資源聚為8個類群，其在分子遺傳水平上的分類結果與其材料來源分類的結果并不完全一致，而且材料來源地間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關性，有少部分同一來源的材料分散在各個類群中。研究認為，黔南茶樹資源間的遺傳差異較大，遺傳基礎較寬，具有豐富的遺傳多樣性。

關鍵詞:茶；種質資源；SSR；遺傳多樣性；黔南

貴州地方茶樹資源分布范圍廣，遺傳多樣性豐富，特異型茶樹資源較多[1]。貴州黔南地理環(huán)境獨特，為茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]生長創(chuàng)造了多變的環(huán)境條件，經過長期演化和選擇形成了豐富多樣的野生、半野生茶樹種質資源，這些資源是茶樹品種創(chuàng)新、茶葉品質提升的物質基礎[2]，研究及評價其遺傳多樣性對于茶樹高產、優(yōu)質和高抗育種具有重要的參考價值。

評價茶樹遺傳多樣性的方法很多，劉聲傳等[3]對貴州野生茶樹種質資源研究，張小琴等[4]對黔南貴定鳥王群體種研究，陳正武等[5]對貴州野生、半野生、地方品種變異體及雜交的茶樹種質資源研究，結果都表明茶樹種質資源的生化成分或品質性狀存在豐富的多樣性和遺傳變異。由于茶樹是異花授粉多年生植物，在長期演化中又是高度雜合體，所以傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定周期長、易受生產習慣和環(huán)境的影響。DNA分子標記具有多態(tài)性豐富、準確性高、重復性好等特點，且無器官發(fā)育時期的特異性，不受環(huán)境影響，易于分析，因此在種質鑒定和遺傳基礎分析中顯示出了較大潛力[6]，如云南、貴州、廣西、浙江等茶樹種質資源DNA分子標記研究均有報道[7-9]，鄢東海[10]采用RAPD分子標記對貴州部分地方茶樹品種資源遺傳多樣性進行過研究。但目前，應用DNA分子標記對黔南野生茶樹資源的研究尚少見報道。

SSR與其他分子標記相比，具有多態(tài)性高、多等位性、共顯性、可重復性高、數量豐富和對基因組有很好的覆蓋性等特點，并且該技術簡便、快速、穩(wěn)定性高和等位基因多樣性高，因此在基因組研究中作為一種主要的分子標記技術，已經廣泛地應用于遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學研究[11]，被認為是目前遺傳多樣性分析或種質資源鑒定和評價最為有效的工具之一[12 ]。本研究利用SSR分子標記技術對貴州黔南茶樹資源進行遺傳多樣性研究，旨在明確黔南茶樹種質資源的親緣關系，為茶樹育種、雜交親本選擇提供依據。

表1　供試材料編號及來源

1材料與方法

1.1供試材料

茶產業(yè)是黔南傳統(tǒng)優(yōu)勢產業(yè)，從事茶產業(yè)的相關企業(yè)和技術人員較多，各縣市設置有茶辦等相關管理職能部門。當地從業(yè)人員及茶辦對典型品系有較全面的了解，因此本試驗材料的采集，由各縣市茶辦及當地從業(yè)人員提供線索，課題組及當地從業(yè)人員協同采集，共采集黔南地區(qū)典型野生型茶樹種質資源60個品系(表1)。樣品夏秋季摘取一芽二葉新梢，保存條件-80 ℃。

1.2方法

1.2.1SSR擴增基因組DNA提取采用改進的CTAB[13]法，DNA質量和濃度用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。本試驗引物為SSR熒光引物，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。引物序列參照Kaundun等[14]、金基強等[15]、劉本英[13]、姚明哲[16]的文獻，從中選擇多態(tài)性較高的40對引物，以材料Y1、Y7、Y14、W36、W54基因組DNA作模板，進行多態(tài)性篩選，最終選擇了15對引物(表2)。

1.2.2PCR擴增PCR擴增反應體系(25 μL)為：40 ng/μL 模板DNA(2.0 μL)、引物(各0.5 μL)、10 mmol·L-1dNTPs (0.5 μL)、10×PCR反應緩沖液(2.5 μL)、2UTaqDNA聚合酶(0.5 μL)、ddH2O 18.5(μL)。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃至60 ℃不等退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；循環(huán)結束后在72 ℃延伸10 min。產物4 ℃保存。儀器為：GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer，USA)。擴增產物采用毛細管電泳、自動熒光檢測：在96孔上樣板的每個孔中分別加1 μL純化的PCR產物，8.5 μL甲酰胺和0.03 μL ROX500分子量內標，離心，95 ℃變性5 min，利用DNA測序儀ABI3730(Applied Biosystems，Foster City，USA)進行自動熒光檢測。

1.3數據處理與分析

利用GeneMapper v 4.0軟件收集電泳結果數據，確定擴增片段長度?；蛐蛿?、觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon信息多樣性指數(I)估計值、材料不同來源地間遺傳一致度(genetic identity)和遺傳距離(genetic distance)，以及F-統(tǒng)計量中的Fit、Fis、Fst用PopGene Ver.1.32軟件分析，根據軟件處理需要，將統(tǒng)計的DNA片段長度轉換為A、B等共顯性分子標記基因型數據，其中，Fit指計算出的基因型的實際頻率與理論期望頻率在所有群體中的偏離程度，Fis指基因型的實際頻率與理論期望頻率在亞群體(居群間或物種間)中的偏離程度，Fst表示亞群體之間的遺傳分化程度。根據公式Nm =0.25×(1-Fst)/Fst計算反映基因流強度(Nm)。多態(tài)信息含量(PIC, polymorphism information content)用Powermarker 3.25軟件分析。多態(tài)性條帶數及多態(tài)性條帶百分率(PPB, percentage of polymorphic bands)利用Excel統(tǒng)計。材料個體間遺傳相似系數、遺傳距離用軟件NTSYS 2.10e分析，根據軟件需要，參照夏寒冰等[17]的方法，將不同長度的DNA片段視為一個等位基因，出現該等位基因時賦值“1”，不存在時賦值“0”，建立原始數據矩陣。分子系統(tǒng)樹狀圖采用非加權配對算術平均法(UPGMA)聚類分析方法構建，在軟件中的Matrix comp.plot對聚類結果和相似系數矩陣之間的相關性進行分析。采用TFPGA進行Mantel檢測，測定材料來源地地理距離與材料來源地遺傳距離的相關關系。

表2　引物信息

2結果與分析

2.1SSR引物標記及材料遺傳多樣性分析

利用篩選出的15對SSR引物，擴增黔南不同地理環(huán)境的60份野生茶樹種質資源DNA，結果顯示，全部樣本中均擴增出譜帶(85～287 bp)，并且具有較好的重復性和多態(tài)性。遺傳多樣性分析結果(表3)表明，15對SSR引物共檢測到147個觀測等位基因，等位基因數量(Na)變化為2～23個，平均等位基因數為9.8個，其中多態(tài)性基因145個，占總擴增等位基因數的98.64%。每對 SSR 引物平均有效等位基因數為4.918 6。共檢測到280個基因型，基因型數變化為2～45個，平均基因型數18.7個。觀測雜合度(Ho)變幅在0.000 0～0.850 0之間，期望雜合度(He)變幅在0.128 2～0.938 8之間，平均觀察雜合度(0.470 0)小于平均期望雜合度(0.602 3)。多態(tài)信息含量(PIC)變化范圍較大，最小值為0.123 9，最大值為0.926 8，平均0.572 5；Shannon信息指數(I)變幅在0.309 9～2.862 2之間，平均1.464 4。不同的數據指標表明15對茶樹SSR引物能有效揭示黔南60份野生茶樹資源遺傳多樣性，其中5個SSR引物(QNSSR02、QNSSR04、QNSSR06、QNSSR18、QNSSR23)的I≥1.5、PIC≥0.8及Na≥10，為最有效的引物。

數據表明，黔南60份野生茶樹資源具有豐富的遺傳多樣性。有效等位基因數與等位基因變異頻率相關聯。有效等位基因數與Shannon’s信息指數的變化趨勢大體一致，有效等位基因數較大的SSR位點其Shannon’s信息指數也較大，Shannon’s信息指數比有效等位基因數更能反映群體的遺傳多樣性程度，可作為更好的評判指標。

表3　SSR引物擴增結果及多態(tài)性信息

2.2不同來源材料遺傳分化分析

對材料的不同來源地(都勻、貴定、獨山、惠水、三都、龍里、羅甸、甕安、平塘、福泉)間遺傳分化進行分析，結果(表4)表明，同一來源地內基因多樣性(Fis)平均值為-0.040 8，多數位點表現雜合體偏高；不同來源地間基因多樣性(Fit)平均值為0.193 6，表明黔南野生茶樹資源總體雜合子不足。不同來源地間遺傳分化系數(Fst)為0.225 2，表明22.55%的遺傳分化系數存在于材料不同來源地間。材料不同來源地間基因流(Nm)平均值為0.860 1，基因流較小，說明不同來源地間基因交流程度較低。

2.3不同來源材料遺傳一致度和遺傳距離分析

對材料的不同來源地(都勻、貴定、獨山、惠水、三都、龍里、羅甸、甕安、平塘、福泉)間遺傳一致度和遺傳距離進行分析結果(表5)表明，各來源地間遺傳一致度范圍為0.643 0～0.943 9，遺傳距離范圍為0.057 7～0.441 6。都勻與貴定的遺傳一致度最大(0.943 9)，遺傳距離最小(0.057 7)，說明都勻與貴定間材料的遺傳背景較相似，親緣關系較近。而三都與羅甸的遺傳一致度最小(0.643 0)，遺傳距離最大(0.441 6)，說明三都與羅甸間材料的遺傳背景有較大差異，親緣關系較遠?？傮w來說，10個來源地的遺傳一致度都在0.64以上，說明所有來源地之間的遺傳分化整體比較低，這也印證了本研究2.2中‘遺傳變異主要存在于同一來源地內而非來源地之間’結論。利用Mantel檢測分析了茶樹資源10個來源地遺傳距離與地理距離的相關性，結果表明來源地間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關性(r=0.209 7，P>0.05)。

表4　材料來源地間的遺傳分化

表5　材料來源地間遺傳一致度(對角線以上)和遺傳距離(對角線以下)

2.4不同供試材料間的親緣關系

根據SSR標記計算60份供試材料間的遺傳相似系數介于0.205 1～0.863 6之間，平均為0.477 5，其中來自惠水的種質材料W40與來自三都的W41之間的相似系數最大，為0.863 6，遺傳距離小，親緣關系最近；相反來自都勻的種質材料Y32與來自平塘的W57之間的相似系數最小，為0.205 1，親緣關系最遠。各材料間UPGMA聚類(圖1)結果進行cophenetic correlation分析，相關系數為0.691 9，說明聚類效果較好。在遺傳相似系數為0.477 5處，60份茶樹資源被聚為8個類群，第Ⅰ類群共33份種質材料(都勻18份、貴定8份、獨山2份、龍里2份、羅甸1份、甕安1份、福泉1份)；第Ⅱ類群共17份種質材料(平塘5份、都勻4份、惠水3份、貴定2份、獨山1份、龍里1份、羅甸1份)；第Ⅲ類群只有來自都勻的1份種質材料；第Ⅳ類群共有3份種質材料，全部來自獨山；第Ⅴ類群只有來自都勻的1份種質材料；第Ⅵ類群共3份種質材料(三都2份、惠水1份)；第Ⅶ類群只有來自平塘的1份種質材料；第Ⅷ類群只有來自獨山的1份種質材料。以遺傳相似系數0.520 0為閾值，第Ⅰ類群和第Ⅱ類群可細分為3個亞群，第Ⅵ類群可細分為2個亞群。材料Y20、Y32、W51、W55分別單獨聚類，說明它們與其他地方茶樹種質資源間的遺傳差異較大，其余種質資源基本按照地域優(yōu)先聚類。在育種過程中盡量選擇第Ⅰ和第Ⅱ這兩個核心類群的材料作為親本，以增加優(yōu)良性狀的基因交流頻率。

材料編號同表1圖1　基于SSR標記的60個供試材料的UPGMA聚類圖Materials codes are same as Table 1.Fig. 1　Dendrogram obtained using UPGMA based on SSR marker for 60 tea germplasms

3討論

茶樹種質資源及遺傳育種研究以遺傳多樣性為基礎，從而選育新的優(yōu)良品種。SSR分子標記技術在茶樹遺傳多樣性及種質鑒定研究方面應用廣泛，本研究利用該技術揭示了黔南地區(qū)60份野生茶樹種質資源的遺傳多樣性水平，篩選出15對SSR核心引物。多態(tài)性信息量PIC為評價引物多態(tài)性的重要指標，當PIC>0.5時，該位點為高度多態(tài)位點；當0.250.5的有8對，占總量的53.3%；0.25

相似系數平均值是用來比較不同群體遺傳多樣性大小的重要指標。本研究結果顯示茶樹種質資源間遺傳相似系數變化范圍為0.205 1～0.863 6，平均為0.477 5，相似系數范圍較大，表明資源間遺傳基礎較寬。牛素貞等[19]研究貴州黔南地區(qū)茶樹地方品種的EST-SSR遺傳多樣性發(fā)現Na、Ne、Ho、He和PIC的平均值分別為3.970 0、3.120 0、0.620 0、0.690 0和0.610 0，這與本研究結果有所區(qū)別，可能是由于使用的引物種類不同、供試材料不同以及采用分辨率更高的毛細管電泳所致[20]。本研究60份野生茶樹種質資源在遺傳相似系數0.477 5處分為8個類群，其在遺傳水平上的分類結果與其材料來源分類的結果并不完全一致，材料來源地間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關性，有少部分同一來源地的材料分散在各個類群中，這與Yao等[21]研究西南地區(qū)茶樹資源的結果有些類似，可能是因為引種交流導致少部分基因在不同地區(qū)間滲入[22-23]。

黔南州是中國十大名茶之一“都勻毛尖”的原產地，茶葉是該地區(qū)主要經濟作物之一，目前黔南州茶樹主栽品種的選育主要通過資源引進與篩選，自育品種很少。本研究中供試材料所表現出較高的多態(tài)性和較大的遺傳距離，說明該地區(qū)茶樹種質資源豐富，遺傳背景復雜，今后研究的重點在于從這些茶樹種質資源中發(fā)掘優(yōu)異的基因資源，進行遺傳定位和分子標記，為優(yōu)異基因聚合新種質的創(chuàng)造奠定基礎，從而促進茶樹種質資源的創(chuàng)新與利用、新品種選育等研究的進一步開展。

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(編輯:宋亞珍)

文章編號:1000-4025(2016)06-1117-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1117

收稿日期:2016-03-25;修改稿收到日期:2016-05-06

基金項目:貴州省普通高校教育質量提升重點科研項目(2011017)；黔南民族師范學院項目(QNSY2010014)

作者簡介:張明澤(1986-)，男，碩士，講師，主要從事茶樹生理生態(tài)和種質創(chuàng)新研究。E-mail：710645368@qq.com *通信作者:陳世軍，教授，主要從事植物種質資源研究與利用。E-mail：280241879@qq.com

中圖分類號:Q346+.5;Q789;S571.1

文獻標志碼:A

Genetic Diversity Analysis of Tea Germplasm in Qiannan Prefecture by SSR Markers

ZHANG Mingze, YAO Yuxian, CHEN Shijun*

(College of Bioscience and Agronomy, Qiannan Normal University for Nationalities, Duyun, Guizhou 558000, China)

Abstract:In this study, fifteen SSR primer pairs with polymorphism were used to assess genetic diversity and relationship of 60 wild tea germplasms from Qiannan prefecture. The results showed that the percentage of polymorphic bands (PPB) was 98.64%. A total of 147 observed alleles and 73.778 6 effective alleles were generated, with a mean of 9.8 and 4.918 6 per locus. Totally 280 genotypes were detected in all materials, with a mean of 18.7 for each polymorphism primer pairs. The polymorphism information content varied from 0.123 9 to 0.926 8, with an average of 0.572 5. The average observed and expected heterozygosities were 0.470 0 and 0.602 3, respectively. The average Shannon’s information index was 1.464 4. The similarity coefficient among 60 tea germplasms was 0.205 1 to 0.863 6. When the similarity coefficient was 0.477 5, eight major groups were generated from all the accessions tested by UPGMA clustering analysis. The results showed that there were no significant correlation between genetic and geographic distance among the tea germplasms, and some individuals in the same population distributed in different groups of the cluster. These results suggested that the materials used in the experiment possessed a broad genetic variation, showing a high level of genetic polymorphism among tea germplasms revealed by SSR markers.

Key words:tea; germplasm resources; SSR molecular mark; genetic diversity; Qiannan prefecture