自制帶雙側(cè)給藥管的多通道在體記錄電極對前扣帶皮層神經(jīng)元放電活動的觀察*

秦霞王銳陳晉源王媛彭源舒趙欣秦國華馬洋陳建鳴張策張宇

自制帶雙側(cè)給藥管的多通道在體記錄電極對前扣帶皮層神經(jīng)元放電活動的觀察*

秦霞①王銳①陳晉源①王媛①彭源舒②趙欣①秦國華①馬洋①陳建鳴①張策①張宇①

【摘要】目的：利用在體多通道電生理學(xué)記錄技術(shù)研究前扣帶皮層吻側(cè)部（rostral anterior cingulate cortex，rACC）神經(jīng)元參與情緒情感活動時的放電特征時，除在rACC腦區(qū)埋置多通道電極外，還需同時埋置給藥管以觀察藥物對rACC神經(jīng)元放電特征的影響。本文將介紹帶給藥管的多通道在體記錄電極的制作及埋置方法。方法：自制帶雙側(cè)給藥管的多通道在體記錄電極，所采用給藥管材質(zhì)有三種，分別為金屬、表面無涂層的石英玻璃纖維（玻璃裸管）和表面有聚酰胺膠涂層且具一定柔韌性的石英玻璃纖維（玻璃涂層管），然后埋植電極并記錄神經(jīng)電信號，最后插管位置組織定位。結(jié)果：鹽水被注射到目標(biāo)腦區(qū)，即rACC腦區(qū)；電極絲也定位于雙側(cè)前扣帶皮層吻側(cè)部；用帶金屬給藥管的多通道電極，記錄到的神經(jīng)元放電背景噪音較大（信噪比＜3）。用帶玻璃裸管的電極可清晰記錄到目標(biāo)神經(jīng)元的放電活動（信噪比＞3），信噪比與金屬管組比較［（5.37±1.35）vs（2.35±0.64）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但該玻璃管質(zhì)硬易碎，不易插入堵絲，也不易在慢性實驗中腦部長時間保存。用帶玻璃涂層管的電極也可清晰記錄到神經(jīng)元的放電活動（信噪比＞3），信噪比與金屬管組比較［（5.20±1.21）vs（2.35±0.64）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且易于插入堵絲，便于在動物腦中長時間保留。結(jié)論：自制帶涂層石英毛細(xì)玻璃管的電極成功實現(xiàn)了對某一腦區(qū)或核團(tuán)同步埋植給藥管和電極，使得藥物干預(yù)并記錄清醒活動大鼠腦電活動的實驗便于進(jìn)行。

【關(guān)鍵詞】雙側(cè)給藥管； 多通道電極； 前扣帶皮層； 神經(jīng)元放電； 大鼠

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

在體多通道電生理技術(shù)是采用細(xì)胞外記錄方法監(jiān)測活體動物神經(jīng)元群電活動的方法［1］，最早是將陣列電極植入猴子不同腦區(qū)觀察其大腦神經(jīng)元的放電特征［2］，近些年由于新材料和新技術(shù)的應(yīng)用，使該技術(shù)在多種動物身上得以推廣，研究的內(nèi)容也日益多樣，如研究學(xué)習(xí)記憶、運(yùn)動信息的加工整合、神經(jīng)突觸傳遞的LTP現(xiàn)象等［3-4］。在神經(jīng)電生理學(xué)研究中，為了探討某一核團(tuán)或腦區(qū)在神經(jīng)通路中的作用，往往要結(jié)合藥理學(xué)方法，對目標(biāo)核團(tuán)或區(qū)域給予藥物干預(yù)［5］。目前在體多通道電生理技術(shù)的應(yīng)用日益增多，該技術(shù)有以下優(yōu)點：（1）在清醒的、自由活動的動物身上記錄，并將行為活動與腦電記錄同步觀察；（2）可跨腦區(qū)記錄，進(jìn)行多個核團(tuán)或腦區(qū)之間的同步觀察；（3）具有較高的時間（ms）和空間（μm）分辨率；（4）可以長期記錄，數(shù)周乃至數(shù)月；（5）記錄到的是神經(jīng)元的單位放電而不是神經(jīng)元群的復(fù)合電位；（6）一次記錄可獲得大量神經(jīng)元的放電數(shù)據(jù)［1，6］。正因如此，在體多通道電生理學(xué)技術(shù)受到越來越多的研究者的關(guān)注。目前本實驗室正從事于前扣帶皮層吻側(cè)部（rostral anterior cingulate cortex，rACC）神經(jīng)元參與痛情緒活動的機(jī)制研究［7-10］，涉及到在活體大鼠的雙側(cè)rACC腦區(qū)既要給予藥物干預(yù)又要記錄神經(jīng)元的放電活動，如果將埋管和埋置電極分開操作的話，一方面不能滿足進(jìn)行慢性實驗的要求，另一方面會對動物造成較大的創(chuàng)傷，影響結(jié)果前后的一致性。另外，目前進(jìn)口的帶給藥管的多通道電極價格昂貴、成本太高，而國內(nèi)尚無此類電極上市，為此筆者自行設(shè)計了能雙側(cè)給藥并記錄神經(jīng)元放電的在體記錄電極。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，體重240～260 g，由北京海淀興旺實驗動物養(yǎng)殖場提供。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，飼養(yǎng)室室溫（22±1）℃，相對濕度40%～60%， 12 hrs～12 hrs晝夜循環(huán)光照，適應(yīng)3～5 d后可進(jìn)行相應(yīng)的實驗。將24只大鼠均分到三種材質(zhì)給藥管組中，每組8只。

1.2 實驗材料及儀器 16通道電極：16通道微電極陣列電極基座和電極電路板（Samtec），0.0013 inch鎳鉻合金絲（CFW），固態(tài)聚乙二醇（Enox）；雙側(cè)給藥管：25G橙色平頭針頭；表面無涂層的石英毛細(xì)玻璃管，內(nèi)徑0.32 mm，外徑0.5 mm；表面有聚酰胺膠涂層且具一定柔韌性的的石英毛細(xì)玻璃管，內(nèi)徑0.32 mm，外徑0.45 mm；另外還需常規(guī)大鼠腦手術(shù)器械、1%戊巴比妥鈉、牙托水、牙托水泥及石蠟油等材料。

1.3 制作流程

1.3.1 16通道電極的制作 （1）將電路板金手指和電極基座一一對應(yīng)焊接；（2）將鎳鉻合金絲切成一定長度，然后一根根排于電路板上，共兩排，每排8根，左右各四根，中間間隔1.2 mm，絲與絲間距300 μm，一根參考電極排于一側(cè)；（3）輕柔剝掉將穿入電路板上金屬孔處電極絲的絕緣層，并將剝好裸露的電極絲一一穿過圓孔；（4）參考電極穿入一側(cè)的孔內(nèi)，另一側(cè)穿入一根地線；（5）將電極絲與電路板金屬孔一一焊好，再將固體聚乙二醇融化后涂于電極絲表面，以起到固定作用；（6）將AB膠1∶1混合后涂于電極基座和電極電路板連接處，以起到固定和絕緣的作用；（7）最后用剪刀剪掉電路板兩側(cè)多余的邊框，用鋒利的眼科剪迅速剪掉電極絲末端部分，保證電極絲末端整齊并暴露橫截面。制作完成的電極見圖1。

圖1 多通道電極圖

1.3.2 給藥管的制作 筆者分別選用了三種材質(zhì)的毛細(xì)管作為給藥管。一種是實驗中常用到的金屬給藥管（圖2A），來自于25G橙色平頭針頭［11］；一種是不帶涂層裸露的石英毛細(xì)玻璃管（圖2B）；一種是表面有聚酰胺膠涂層的石英毛細(xì)玻璃管（圖2C）。

圖2 三種不同材質(zhì)的給藥管

1.3.3 帶雙側(cè)給藥管的電極制作 將給藥管用AB膠粘在已做好的16通道電極其中一面，要保證雙側(cè)給藥管間距離為1.2 mm，給藥管與電極絲間的距離為1 mm，粘好后在兩個給藥管中間插一個U型的堵絲，其中金屬管需與地線焊在一起。具體見圖3。

圖3 帶雙側(cè)給藥管16通道電極

1.4 手術(shù)流程 大鼠以1%戊巴比妥鈉溶液行腹腔麻醉，固定于腦立體定位儀上，在頭部正中切開皮膚/筋膜，雙氧水清理骨板暴露Bregma點；按照Paxinos&Watson大鼠解剖圖譜［12］，以前囟點為0點，確定rACC下電極的區(qū)域：AP（0.5～4.0）、ML （0.5～1.5）、DV（2.0）。待目標(biāo)腦區(qū)打磨好后用微推儀以1 μm/s的速度下2.0 mm，最后用牙托水泥固定。取下Headstage；大鼠回籠單獨(dú)飼養(yǎng)。待術(shù)后1周狀態(tài)恢復(fù)良好后可進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5 給藥流程 將大鼠自然的固定于嚙齒動物固定裝置上，輕輕地安撫大鼠，小心拔掉給藥管內(nèi)的管芯。進(jìn)藥針末端通過PE-10管連接于5 μL的微量進(jìn)樣器，進(jìn)藥針頭端比給藥管長0.3 mm。抽取1 μL的生理鹽水，用微量給藥泵以0.2 μL/min的速度緩慢將藥物泵入rACC。進(jìn)藥針在給藥結(jié)束后繼續(xù)停留于給藥管里1～2 min，保證藥物被充分吸收；同樣操作另一側(cè)rACC。

1.6 神經(jīng)元活動的在體記錄 筆者采用美國Blackrock公司的Cerbus128通道神經(jīng)電生理信號記錄系統(tǒng)對神經(jīng)信號進(jìn)行采集。該系統(tǒng)主要由多通道電極陣列、Headstage、前置放大器、光纖、神經(jīng)信號處理器（NSP）、PC工作站等組成。采集到的原始信號可經(jīng)高頻和低頻濾波分為兩種信號：高頻（250 Hz～5 kHz）的胞外動作電位；低頻（＜250 Hz）的局部腦區(qū)場電位。再經(jīng)Offline Sorter 和Neuroexplore軟件進(jìn)行處理和分析。

1.7 記錄位點的鑒定 大鼠麻醉后將1 μL的滂胺天藍(lán)從給藥管緩慢注射至目標(biāo)腦區(qū)；然后剪開胸腔，暴露心臟。將注射針頭經(jīng)心尖插入主動脈，剪掉右心耳。先使用約400 mL的生理鹽水沖洗血液，然后緩慢灌注400 mL的4%的多聚甲醛至身體僵硬。灌流結(jié)束后，取出全腦，在4%的多聚甲醛中再浸泡2 h，然后30%的蔗糖4 ℃過夜。待組織沉降后便可進(jìn)行冰凍切片。每片厚30 μm，后貼片，HE染色，中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，采用oneway ANOVA及多重比較進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織定位 組織切片、HE染色顯示：藥物能被準(zhǔn)確注射到目標(biāo)腦區(qū)（rACC腦區(qū)），而且多通道電極也位于目標(biāo)腦區(qū)，見圖4。

2.2 帶給藥管的多通道電極所測神經(jīng)信號 采用帶金屬給藥管的多通道電極記錄到的大鼠前扣帶皮層吻側(cè)部神經(jīng)元放電的動作電位和場電位背景噪音很大，信噪比＜3，信號往往淹沒于背景噪音中無法辨識，將地線纏繞于金屬給藥管也未能明顯改善（圖5A）。采用表面無涂層的毛細(xì)石英玻璃做給藥管，采集到的動作電位和場電位背景噪音較?。▓D5B），其信噪比與金屬管組比較［（5.37±1.35）vs （2.35±0.64）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6；但由于該玻璃纖維太脆，不利于插入堵絲及長時間記錄。采用表面有涂層的石英毛細(xì)玻璃管做給藥管，可清晰記錄到rACC腦區(qū)神經(jīng)元發(fā)放的動作電位和場電位，波形較好、背景噪音較小，信噪比＞3（圖5C）。信噪比與金屬管組比較［（5.20±1.21）vs（2.35±0.64）］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6；且該玻璃管柔韌性較好，便于插入堵絲，長時間記錄也未破損。

圖4 前扣帶皮層吻側(cè)部位置（rACC腦區(qū)）

圖5 三種材質(zhì)給藥管多通道電極記錄的spike波形

圖6 三種帶不同類型給藥管的多通道電極測得神經(jīng)元放電的信噪比比較

3 討論

中樞神經(jīng)元放電的在體多通道同步記錄技術(shù)（in vivo multi-channel recording methods for centural neural activities）是采用細(xì)胞外記錄的方法來監(jiān)測神經(jīng)元群的同步電活動［13-14］。與離體實驗方法相比，應(yīng)用這一方法可以記錄清醒、自由活動動物腦區(qū)神經(jīng)元的放電活動［15-17］，將行為學(xué)和電生理學(xué)的方法相結(jié)合，可直觀地分析大腦對外部事件的編碼機(jī)制［18-19］。與單通道電生理技術(shù)相比，該技術(shù)克服了單通道電生理技術(shù)所具備的弊端，即一次只能記錄一個神經(jīng)元放電，以及單通道記錄時動物活動受限，無法將外部事件與神經(jīng)元放電相同步［17］。由于該技術(shù)的優(yōu)越性，在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域受到廣泛使用，尤其在對與學(xué)習(xí)認(rèn)知相關(guān)機(jī)制的探索中［20-21］，同時在對神經(jīng)環(huán)路的研究中常需要對某個或某幾個核團(tuán)進(jìn)行給藥處理［22］，因此能長期多次給藥并記錄電信號的帶給藥管的多通道電極使之成為可能。由于神經(jīng)元放電活動較微弱，因此很容易受周圍環(huán)境的影響［23］。筆者嘗試用常規(guī)金屬針頭改作為給藥管，發(fā)現(xiàn)電極記錄的信號背景噪音很大，將地線纏繞并焊于其上也未能明顯緩解。然后改用具有絕緣特征的石英毛細(xì)玻璃管作為給藥管，背景噪音明顯減小，但是硬質(zhì)易碎的石英玻璃管不利于筆者實驗操作；最后筆者找到了表面有聚酰胺膠涂層且具一定柔韌性的石英毛細(xì)玻璃管替代，效果很好。經(jīng)筆者改良后的帶雙側(cè)給藥管的多通道電極，可保證藥物擴(kuò)散到目標(biāo)核團(tuán)的，而且能清晰記錄到活體動物在行為活動時神經(jīng)元的同步放電活動。

需要注意的是：（1）應(yīng)保證電極尖端未被絕緣層包裹，這樣才能使得電極與神經(jīng)元接觸；（2）剝離電極表面絕緣層時要輕柔，可多次操作，以免斷開；（3）手術(shù)剝離硬腦膜也要輕柔，切勿損傷腦實質(zhì)或?qū)е鲁鲅?；?）下電極的速度要慢，一般來說，電極經(jīng)過的地方神經(jīng)元會失活，因此記錄電極只進(jìn)不退；（5）電極要固定好以后才可將Headstage拔下，以免將電極位置移動；（6）給藥時速度也要慢，一般為0.2 μL/min，因為如果給藥太快會對細(xì)胞產(chǎn)生沖擊作用，而使其位置發(fā)生改變；注藥結(jié)束后要停留5～10 min再將注射內(nèi)芯移除，這樣有利于藥物被充分吸收。

綜上所述，本實驗成功設(shè)計了帶雙給藥管的16通道電極，使得能在對目標(biāo)核團(tuán)給予藥物處理后記錄神經(jīng)元的放電活動，滿足了筆者的實驗需求，而且，藥理學(xué)實驗與在體記錄相結(jié)合可以獲得更有意義的研究成果。

參考文獻(xiàn)

［1］王錦琰，羅非，韓濟(jì)生.中樞神經(jīng)元放電的在體多通道同步記錄技術(shù)［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2003，47（4）：356-358.

［2］ MacLean P D.Biological and biochemical bases of behavior［J］.Electroencephalography and Clinical Neurophysiology，1960，12 （4）： 946-947.

［3］王一男，唐永強(qiáng)，潘璟瑋，等.大鼠多通道在體記錄［J］.生物物理學(xué)報，2010，26（5）：397-405.

［4］于萍，袁水霞，李霞，等.記憶過程中海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的集群放電特征［J］.心理學(xué)報，2011，56（8）：917-928.

［5］張帆.偏頭痛相關(guān)三叉神經(jīng)疼痛通路的解剖研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（25）：96-97.

［6］馬曉宇，張藝瑤，王麗娜，等.多通道在體記錄技術(shù)——小鼠可推進(jìn)式微電極陣列帽制作與植入手術(shù)［J］.生理學(xué)報，2013，80（6）：637-646.

［7］ Zhang Y，Meng X，Li A，et al.Electroacupuncture alleviates affective pain in an inflammatory pain rat model［J］.European Journal of Pain（London， England），2012，16（2）：170-181.

［8］侯苗苗，楊洋，李振華，等.電針刺激環(huán)跳穴緩解大鼠炎癥性疼痛的方法［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（19）：22-24.

［9］張肖怡.激活前扣帶皮層神經(jīng)元μ阿片受體可緩解大鼠的痛情緒反應(yīng)［D］.太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2014.

［10］張肖怡，蘭坤，馮曉璞，等.痛情緒反應(yīng)量化方法的探索［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（18）：45-48.

［11］馮曉璞，蘭坤，張肖怡，等.自制雙管套管在大鼠前扣帶回皮層置管給藥的方法［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（18）：42-45.

［12］ Paxinos G，Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.New York：Carlifomia Aeademic Press，2007：48-124.

［13］徐佳敏，王策群，林龍年.多通道在體記錄技術(shù)——動作電位與場電位信號處理［J］.生理學(xué)報，2014，81（3）：349-357.

［14］王策群，陳強(qiáng)，張櫨，等.多通道在體記錄技術(shù)——神經(jīng)元放電與節(jié)律性場電位間的相位分析方法［J］.生理學(xué)報，2014，81（6）：746-755.

［15］ Chang E H，F(xiàn)rattini S A，Robbiati S，et al.Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice［J］.Journal of Visualized Experiments，2013，56（77）：50 470.

［16］ Kinney J P，Bernstein J G，Meyer A J，et al.A direct-to-drive neural data acquisition system［J］.Frontiers in Neural Circuits，2015，25（9）：46.

［17］ Fan D，Rich D，Holtzman T，et al.A wireless multi-channel recording system for freely behaving mice and rats［J］.PLoS One，2011，6（7）：e22 033.

［18］鄺慧.海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元和多種中間神經(jīng)元在情景事件編碼中的作用［D］.上海：華東師范大學(xué)，2010.

［19］ Berényi A，Somogyvári Z，Nagy A J，et al.Large-scale，high-density （up to 512 channels） recording of local circuits in behaving animals［J］.Journal of Neurophysiology，2014，111 （5）：1132-1149.

［20］ Lin L，Chen G，Kuang H，et al.Neural encoding of the concept of nest in the mouse brain［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104（14）：6066-6071.

［21］ Vargas-Irwin C E，Brandman D M，Zimmermann J B，et al.Spike train SIMilarity Space （SSIMS）：a framework for single neuron and ensemble data analysis［J］.Neural Comput，2015，27 （1）：1-31.

［22］ Williams L R，Vahlsing H L，Lindamood T，et al.A smallgauge cannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain［J］.Experimental Neurology，1987，95（3）：743-754.

［23］趙偉，郭義，劉延祥，等.神經(jīng)再生相關(guān)信號通路的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（12）：138-141.

①山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001

②山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.004

收稿日期：（2016-02-29） （本文編輯：蔡元元）

*基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（81371254）

通信作者：張宇

Observation of Recording the Electrical Activities in Anterior Cingulate Cortex Neurons by Using Home-made Multi-channel Electrode with Double Cannulas

QIN Xia，WANG Rui，CHEN Jin-yuan，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：013-017

【Abstract】Objective：In order to explore the firing characteristics of the rostral anterior cingulate cortex （rACC） neurons，which participate in the emotional activities by using the multi-channel in vivo recording techniques，we should implant a multi-channel electrode and cannulas in the rACC area in rats，while to observe the influence of drugs on the firing characteristics in ACC neurons at the same time.A method of home-made multichannel with double cannulas is introduced here.Method：Three different materials of cannulas，including metal，quartz capillary without or with polyamide coating were applied.Then the home-made electrode was implanted to record the neuronal activity.In the end，the cannula site was localized.Result：The saline were respectively injected into ACC region in different rats，and electrode wire are also located in this region.Using home-made multi-channel electrode with double metal cannulas，the signal to noise ratio were smaller （SNR＜3）.Electral signal could be recorded by using the home-made multi-channel electrode with double quartz capillary without or with polyamide coating， their signals both were excellent （SNR＞3），the SNR compared with metal cannulas one［（5.37±1.35） vs （2.35±0.64）］，there had significant statistical difference（P＜0.05），but the bare quartz capillary was harder，fragile and difficult to maintain for a long time in the brain.With glass coating tube electrode could also be clearly recorded neurons discharge activity（SNR＞3），the SNR compared with metal cannulas one［（5.20±1.21） vs （2.35±0.64）］，there had significant statistical difference（P＜0.05），while the coating one was elastic and easy to insert a plug in it and can maintain a long time.Conclusion：The home-made multi-channel electrodes with double cannulas can be successfully applied to some of experiments，which need to be recorded about neural activities after drugs administration to one brain area or neural nuclei.

【Key words】Double cannulas； Multi-channel electrodes； Anterior cingulate cortex； Neurons activities； Rat