繡球菌多糖提取方法的比較研究

楚　杰，劉守志，張　濤，何秋霞，劉可春

(山東省科學(xué)院生物研究所，濟(jì)南　250014)

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繡球菌多糖提取方法的比較研究

楚杰，劉守志，張濤，何秋霞，劉可春

(山東省科學(xué)院生物研究所，濟(jì)南250014)

摘要：對(duì)繡球菌多糖提取方法做了初步研究，通過熱浸、超聲、剪切、高壓等單一或復(fù)合處理方法，摸索出提取的最佳方法：剪切高壓法，提取條件為高速剪切乳化機(jī)內(nèi)10 000r/min剪切10min，高壓30min后，其提取率達(dá)到5.106%。

關(guān)鍵詞：繡球菌；多糖；提取法

繡球菌(Sparassiscrispa)，又名花椰菜菇、花瓣茸，是一種非常珍稀名貴的藥食兩用菌，含有十分豐富的多糖，具有很好的保健作用和較高的藥用價(jià)值。研究表明，繡球菌多糖有抗腫瘤作用[1-3]，可用于治療各種癌癥，此外，繡球菌多糖還可以提高動(dòng)物的造血功能[4]、加強(qiáng)白細(xì)胞介素-6的生成，能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生干擾素[5-7]、抑制愛滋病毒-1逆轉(zhuǎn)錄超過50%等功能[8]，由于其如此多的功能，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。繡球菌多糖存在于其菌絲體和子實(shí)體中，但因繡球菌子實(shí)體生長緩慢，人工栽培周期太長，采用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)，周期短、成本低，能大大提高多糖的產(chǎn)量。因此本試驗(yàn)針對(duì)繡球菌菌絲體多糖的提取工藝進(jìn)行了比較研究，為繡球菌多糖開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1菌種

繡球菌，引自韓國朝鮮大學(xué)。

1.2試劑

氯仿、正丁醇、無水乙醇、36%HCl、NaOH(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.3儀器

SG-500高剪切乳化機(jī)(上海尚貴有限公司)；XW-80A旋轉(zhuǎn)混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；RE-6000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)； SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；BILON-2000CTG恒溫超聲波提取機(jī)(西安比朗生物科技有限公司)；SBA-40D生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物所)。

1.4繡球菌多糖含量的測(cè)定[9]

取提取液1mL(或多糖1g)，加入5%鹽酸30mL，100℃水解5h，水解后冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至中性，定容到100mL，用SBA-40D生物傳感器測(cè)定其葡萄糖含量，同時(shí)測(cè)定各提取液水解前樣品的葡萄糖含量為空白對(duì)照，計(jì)算多糖含量。

2方法與步驟

2.1繡球菌的培養(yǎng)

2.1.1培養(yǎng)基(1)斜面培養(yǎng)基：PDF培養(yǎng)基。(2)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：20%土豆汁、0.1%硫酸鎂、0.3%磷酸二氫鉀、2%的淀粉、0.3%的蛋白胨、0.01%的復(fù)合維生素B1，pH 5.5。

2.1.2繡球菌菌絲體的培養(yǎng)與收集將繡球菌斜面菌塊接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)至菌絲球長滿為止，5 000r/min離心，將菌絲體收集，存4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2繡球菌多糖的提取

2.2.1熱浸法準(zhǔn)確稱取菌絲體10g于錐形瓶中，加水100mL，振蕩混勻，然后85℃水浴1h，5 000r/min離心15min， 將殘?jiān)俅渭尤?00mL的水，振蕩混勻， 85℃水浴1h，二次浸提，將浸提液合并到一起，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，混勻后，10 000r/min離心15min，去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇，醇沉后離心，沉淀部分烘干即多糖。稱重并按1.3方法測(cè)定多糖含量。

2.2.2熱浸剪切超聲法準(zhǔn)確稱取菌絲體10g于錐形瓶中，加水100mL，振蕩混勻，85℃水浴1h，再放入高速剪切乳化機(jī)中10 000r/min剪切10min，最后放入超聲波提取機(jī)中超聲30min(超聲2.0s，間隙2.0，時(shí)長30min)取出，5 000r/min離心15min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測(cè)定多糖含量。

2.2.3剪切超聲熱浸法取菌絲體10g，加水100mL，振蕩混勻，10 000r/min剪切10min；超聲30min(超聲2.0s，間隙2.0，時(shí)長30min)；85℃恒溫水浴1h。離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測(cè)定多糖含量。

2.2.4剪切熱浸法取菌絲體10g，加水100mL，振蕩混勻，高速剪切乳化機(jī)10 000rpm剪切10min；85℃恒溫水浴1h。5 000r/min離心15min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿∶正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測(cè)定多糖含量。

2.2.5剪切超聲法取菌絲體10g，加水100mL，振蕩混勻，高速剪切乳化機(jī)10 000r/min剪切10min；恒溫超聲波提取機(jī)超聲30min(超聲2.0s，間隙2.0，時(shí)長30min)。離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測(cè)定多糖含量。

2.2.6剪切高壓法取菌絲體10g，加水100mL，振蕩混勻，高速剪切乳化機(jī)10 000r/min剪切10min；然后121℃ 30min。離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測(cè)定多糖含量。

2.3試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

圖1　熱浸剪切超聲法與剪切超聲熱浸法比較

2.3.1熱浸剪切超聲法與剪切超聲熱浸法比較 由圖1數(shù)據(jù)可知，熱浸剪切超聲法收率為0.492 3g，其含糖量365mg/g；在相同質(zhì)量菌絲體條件下，剪切超聲熱浸法的收率為0.5078g，其含糖量每克870mg/g。從數(shù)據(jù)看出，雖然步驟一樣，但前后順序不一樣，對(duì)多糖的提取結(jié)果影響很大，先剪切超聲再熱浸，更加有利于繡球菌多糖的浸出，這是因?yàn)榻?jīng)剪切超聲后菌絲體細(xì)胞壁破碎，經(jīng)過熱浸，多糖被充分浸出，提高了多糖的溶出率，而先熱浸再剪切超聲，破碎后細(xì)胞內(nèi)多糖并沒有完全溶出，因此，剪切超聲熱浸法比熱浸剪切超聲法提取效率高。

2.3.2剪切超聲法與剪切超聲熱浸法比較由圖2可知，在采用相同質(zhì)量菌絲體下，剪切超聲法收率為0.304 7g，其糖含量為640mg/g；剪切超聲熱浸法收率為0.507 8g，其糖含量為870mg/g。因此，剪切超聲熱浸法收率和糖含量均比剪切超聲法要高。這是因?yàn)榧羟谐暫?，雖然菌絲體細(xì)胞破碎，但多糖并沒有完全得到釋放，只有再經(jīng)過熱浸后多糖才能完全被提取出來。

圖2　剪切超聲法與剪切超聲熱浸法比較

2.3.3剪切超聲法，剪切熱浸法和剪切高壓法由圖3可知，在采用相同質(zhì)量菌絲體下，剪切超聲法收率為0.304 7g，其糖含量為640mg/g；剪切熱浸法收率為0.472 8g，糖含量為790mg/g；剪切高壓法收率為0.600 7g，收率為850mg/g。3種方法收率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，糖含量也呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。剪切高壓法的提取收率最高， 因?yàn)榧?xì)胞經(jīng)剪切后，細(xì)胞壁破碎，超聲法只是起到進(jìn)一步破碎的作用，多糖并沒有溶出；熱浸起到了多糖溶出的作用；而高壓既有進(jìn)一步破碎細(xì)胞的作用，又能使多糖組分溶出。

圖3　剪切超聲法、剪切熱浸法和剪切高壓法

2.3.4熱浸法與剪切熱浸法由圖4可知，在采用相同質(zhì)量菌絲體下，熱浸法為0.394 2g，其糖含量為365mg/g；剪切熱浸法收率為0.472 8g，糖含量為790mg/g。說明在剪切的基礎(chǔ)上再熱浸能更好的釋放胞內(nèi)多糖。

圖4　熱浸法與剪切熱浸法

3結(jié)論

本試驗(yàn)為能更好地提取繡球菌菌絲體多糖，對(duì)從繡球菌菌絲體中提取多糖的方法進(jìn)行了比較研究，選用剪切、熱浸、超聲、高壓等做為提取多糖的方法，通過單一或復(fù)合處理，采用生物傳感器測(cè)定多糖含量，對(duì)比了不同處理方法的提取效果，得出剪切高壓法提取效果最好。剪切高壓法利用剪切乳化機(jī)的剪切作用對(duì)繡球菌細(xì)胞壁的破壞與高壓對(duì)繡球菌菌絲體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞并使多糖充分溶出，使其對(duì)多糖的提取收率增加，其提取率最高，達(dá)到5.106%，且含糖含量也高，因此是一種理想的提取繡球菌多糖的方法。◇

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(責(zé)任編輯李燕妮)

作者簡介：楚杰(1965—)，女，學(xué)士，研究員，研究方向：生物研究。

Comparative Study on Extraction Methods of Hydrangea Polysaccharide

CHU Jie，LIU Shou-zhi，ZHANG Tao，HE Qiu-xia，LIU Ke-chun

(Institute of Biology，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China)

Abstract：The extraction methods of hydrangea polysaccharide was preliminarily studied and through the contrast including hot dipping，ultrasonic，shear，high-pressure and using single or complex treatment method， we explored the best extraction method were cut and high-pressure treatment, cut 10min at 10 000r/min, and high pressure treatment 30min，its extraction rate could reach 5.106%.

Keywords：Sparassis crispa；polysaccharide；extraction method