RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定果酒中13種酚類化合物

王瀅雪，劉雪平，孫翔宇，侯彩云，戰(zhàn)吉宬（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京市葡萄科學(xué)與釀酒技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定果酒中13種酚類化合物

王瀅雪，劉雪平，孫翔宇，侯彩云，戰(zhàn)吉宬
（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京市葡萄科學(xué)與釀酒技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

摘要：建立了一種適用于多種果酒中13種多酚類化合物（5種黃烷-3-醇、4種黃酮醇、2種酚酸、2種芪類）含量測(cè)定的HPLC分析方法。色譜條件為：LiChrospher 100 RP-18e柱，流動(dòng)相A為水（0.1%磷酸），流動(dòng)相B為甲醇（0.1%磷酸），梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm。在該色譜條件下各個(gè)物質(zhì)在48 min內(nèi)得到了良好的分離，各物質(zhì)的含量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.998，且回收率在73%～123%之間，重復(fù)性好，具有定量準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)。運(yùn)用該方法測(cè)定了6種葡萄酒、7種藍(lán)莓酒、5種桑葚酒中13種酚類化合物的含量。結(jié)果表明，葡萄酒中含有全部13種多酚化合物，藍(lán)莓酒中有10種，桑葚酒中有9種。葡萄酒中黃烷-3-醇的含量較高，藍(lán)莓酒和桑葚酒中黃酮醇的含量較高，葡萄酒和桑葚酒均含有白藜蘆醇，藍(lán)莓酒不含。該方法準(zhǔn)確、可靠，可適用于多種果酒中13種酚類化合物的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：果酒； 酚類化合物； 反相高效液相色譜

果酒是以新鮮水果或果汁為原料，經(jīng)過(guò)破碎、壓榨取汁、發(fā)酵、澄清、陳釀等工藝精心釀制調(diào)配而成的低度飲料酒。根據(jù)國(guó)家優(yōu)質(zhì)食品評(píng)選標(biāo)準(zhǔn)（果酒部分），按原料不同將果酒分為7類：北方漿果類、仁果類、核果類、柑橘類、獼猴桃類、山楂類和棗類［1］。葡萄、藍(lán)莓、桑葚等漿果中含有豐富的黃烷-3-醇、黃酮醇、酚酸、芪類等多酚類物質(zhì)，并且有較高的抗氧化性，其保健功能越來(lái)越為人們所知。近年來(lái)，隨著人們對(duì)保健型果酒的消費(fèi)需求越來(lái)越大，葡萄酒、藍(lán)莓酒、桑葚酒等漿果類果酒也越來(lái)越多的引起人們的重視［2］。多酚類物質(zhì)不僅與果酒的色澤、風(fēng)味等品質(zhì)指標(biāo)密切相關(guān)，而且賦予了果酒一定的保健功效和抗氧化能力［3-7］。所以，對(duì)果酒中重要多酚類物質(zhì)的分析檢測(cè)具有重要意義。

多酚類物質(zhì)主要結(jié)構(gòu)是苯環(huán)，其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)或多個(gè)羥基組?；谒鼈兲辑h(huán)結(jié)構(gòu)的差異，可將多酚劃分為類黃酮和非類黃酮類物質(zhì)。果酒中，類黃酮主要是黃烷醇、黃酮醇、花青素類等，非類黃酮類物質(zhì)主要是酚酸和芪類（白藜蘆醇）等［3］。研究發(fā)現(xiàn)［2-20］，葡萄酒、藍(lán)莓酒、桑葚酒中含量較高的主要多酚類化合物見表1。

表1　葡萄酒、藍(lán)莓酒、桑葚酒中主要酚類化合物

近年來(lái)，許多學(xué)者用HPLC法對(duì)果酒中酚類物質(zhì)進(jìn)行了研究［8-11］。但在這些研究中，多為分別測(cè)定酚酸、黃烷-3-醇、黃酮醇、芪類，并只適用于某一種果酒，很少見到在同一色譜條件下，較短時(shí)間內(nèi)將果酒中主要的、含量較高的黃烷-3-醇、黃酮醇、芪類等酚類化合物同時(shí)分離測(cè)定的報(bào)道。

本研究采用梯度洗脫程序，建立了果酒中主要的、含量較高的13種多酚類化合物含量測(cè)定的HPLC分析方法。13種多酚類化合物包括：5種黃烷-3-醇（兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯）、4種黃酮醇（槲皮素、桑色素、木犀草素、槲皮苷），2種酚酸（沒(méi)食子酸、阿魏酸），2種芪類（白藜蘆醇、虎杖苷）。并且，采用建立的HPLC方法對(duì)7個(gè)品種的藍(lán)莓酒、6個(gè)品種的葡萄酒、5個(gè)品種的桑葚酒進(jìn)行了含量檢測(cè)，獲得了滿意的結(jié)果。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

樣品：6個(gè)品種的葡萄酒（赤霞珠、美樂(lè)、西拉、馬瑟蘭、蛇龍珠、黑比諾），為2012年產(chǎn)自懷來(lái)；7個(gè)品種的藍(lán)莓酒（藍(lán)豐、公爵、達(dá)柔、圓藍(lán)、芝妮、杰兔、美登），由實(shí)驗(yàn)室釀制；5個(gè)品種桑葚酒（紅果、龍桑、沙霓、大十、白玉王），由實(shí)驗(yàn)室釀制。

儀器設(shè)備：Waters-2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters；PDA紫外檢測(cè)器Waters-2996，美國(guó)WatersAUY220；色譜柱LiChrospher 100 RP-18e，德國(guó)Merck；KQ-300TDE型高頻數(shù)控超聲波清洗機(jī)；AUY220分析天平，日本SHIMADZU；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，河南予華。

試劑：兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、槲皮素、桑色素、木犀草素、槲皮苷、沒(méi)食子酸、阿魏酸、白藜蘆醇、虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)），賽默飛世爾科技公司；磷酸（色譜級(jí)），成都西亞化工股份有限公司；乙酸乙酯（分析純），北京化工廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件

色譜柱：LiChrospher 100 RP-18e反相C18柱，流動(dòng)相A為水（0.1%磷酸），流動(dòng)相B為甲醇（0.1%磷酸）。梯度洗脫：0～10 min，B為10%～37%；10～17.5 min，B為37%；17.5～18.5 min，B為37%～40%；18.5～26 min，B 為40%；26～27 min，B為40%～54%；26～47 min，B為54%；47～48 min，B為10%。流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取兒茶素、表兒茶素等13種標(biāo)準(zhǔn)品各25.0 mg，分別用90%甲醇水溶液定容至5 mL棕色容量瓶中，得到各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-30℃保存?zhèn)溆?。使用前，根?jù)實(shí)驗(yàn)需要將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至適合濃度配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3樣品處理

取果酒25 mL，以2倍料液比用乙酸乙酯萃取3次，取出酯相合并，35℃旋蒸至干。殘?jiān)苡? mL 90%甲醇水溶液，過(guò)0.45 μm濾膜，作為樣品溶液。

1.2.4方法學(xué)考察

線性關(guān)系與檢出限：在最佳色譜條件下，選取定量下限濃度以上的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液相分析，分別獲得各自的峰面積，通過(guò)建立樣品濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，考察線性相關(guān)性。將配制的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液逐步稀釋，并以信噪比（RSN）為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含組分的含量為檢出限（LOD）。

精密度與加標(biāo)回收率：向已知單體酚含量的樣品5份，定量精密添加標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，充分混勻后按照1.2.3制備樣品（n=5）。在最佳條件下測(cè)定13種物質(zhì)的回收率。

重復(fù)性與穩(wěn)定性：取同一批次的樣品溶液，在最佳條件下連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積與保留時(shí)間，并計(jì)算各物質(zhì)的含量，計(jì)算RSD值，分析樣品的重復(fù)性。取同一批次的樣品溶液，在最佳條件下分別于0、4 h、8 h、16 h、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積與保留時(shí)間，并計(jì)算各物質(zhì)的含量，計(jì)算RSD值，分析樣品的穩(wěn)定性。

1.2.5樣品測(cè)定

以該方法分別測(cè)定葡萄酒、藍(lán)莓酒、桑葚酒3種果酒中13種物質(zhì)的含量，分析方法對(duì)于樣品的適用性。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜條件的選擇

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用PDA檢測(cè)器對(duì)兒茶素等13種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行最大吸收光譜掃描。13種物質(zhì)的吸收光譜圖顯示，標(biāo)準(zhǔn)樣品的最大吸收峰雖然各不相同，但在272 nm處均有最大或者較大吸收峰。綜合考慮，選取272 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)為宜。

2.1.2柱溫與流速的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了色譜柱溫度在25.0℃、30.0℃、35.0℃和40.0℃4個(gè)柱溫條件下13種酚類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品中色譜峰的分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所考察的4個(gè)溫度條件中，30.0℃的分離度最佳，因此本實(shí)驗(yàn)采用色譜柱溫為30.0℃。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)比較了流動(dòng)相流速在0.1～1.0 mL/min內(nèi)13種酚類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品中色譜峰的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流速為0.5 mL/min時(shí)，出峰效果最好，確定流速為0.5 mL/min。

2.1.3梯度洗脫條件

實(shí)驗(yàn)對(duì)洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，確定洗脫程序：0～10 min，B為10%～37%；10～17.5 min，B為37%；17.5～18.5 min，B為37%～40%；18.5～26 min，B為40%；26～27 min，B為40%～54%；26～47 min，B為54%；47～48 min，B 為10%。在此梯度洗脫條件下，13種酚類物質(zhì)達(dá)到很好的色譜分離，標(biāo)樣色譜圖見圖1，樣品色譜圖見圖2。

圖1　13種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2線性關(guān)系與檢測(cè)限

13種酚類化合物的濃度范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限結(jié)果見表2。從表2可以看出，沒(méi)食子酸等13種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.998，質(zhì)量濃度和相應(yīng)峰面積呈良好線性關(guān)系。并且它們的最低檢測(cè)限都較低，能滿足定量分析要求，說(shuō)明此方法靈敏度較高。

圖2　樣品色譜圖

2.3精密度與加標(biāo)回收率

最佳色譜條件下，13種物質(zhì)的回收率結(jié)果見表3。13種物質(zhì)的回收率為73%～123%，回收率的RSD在5.0%以下。結(jié)果表明，該方法精密度良好，加標(biāo)回收率符合要求。

2.4重復(fù)性與穩(wěn)定性

重復(fù)性：最佳色譜條件下，5份樣品測(cè)定結(jié)果顯示，13種物質(zhì)峰面積RSD為0.51%、0.58%、0.44%、0.92%、0.63%、1.97%、1.78%、0.50%、1.83%、1.26%、1.11%、0.79%，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性：最佳色譜條件下，同一樣品5次測(cè)定結(jié)果顯示，13種物質(zhì)峰面積RSD為0.79%、1.03%、1.97%、0.25%、1.34%、0.69%、0.69%、1.71%、0.48%、0.62%、0.47%、1.37%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.5樣品測(cè)定

按照色譜條件對(duì)6個(gè)品種的葡萄酒、7個(gè)品種的藍(lán)莓酒、5個(gè)品種的桑葚酒進(jìn)行了含量檢測(cè)，結(jié)果見表4。

表2　13種酚類化合物的保留時(shí)間、回歸方程、線性范圍和檢測(cè)限

表3　13種酚類化合物的精密度和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4　葡萄酒樣品中13種酚類化合物的含量分析?。╩g/L）

測(cè)定結(jié)果表明，葡萄酒所含酚類化合物種類較多、平均含量較高，尤其是黃烷-3-醇，葡萄酒中含有5種，而藍(lán)莓酒和桑葚酒只含有3種和2種。而就黃酮醇而言，藍(lán)莓酒和桑葚酒中的含量略高于葡萄酒，其中藍(lán)莓酒最高。葡萄酒中沒(méi)食子酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)藍(lán)莓酒和桑葚酒，且葡萄酒中沒(méi)食子酸含量因品種不同差異較大，而藍(lán)莓酒和桑葚酒比較穩(wěn)定，都比較低。葡萄酒和桑葚酒中都含有白藜蘆醇，而藍(lán)莓酒中不含，但藍(lán)莓酒中含有虎杖苷，而桑葚酒中不含。

6種葡萄酒中有4種均可檢測(cè)到13種化合物，其中，馬瑟蘭和赤霞珠所含酚類化合物相對(duì)較多。沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素是葡萄酒中的主要酚類化合物。測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致［9-12］，但本實(shí)驗(yàn)葡萄酒樣品中的表沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量要高于王秀芹等［12］所報(bào)道，這可能與葡萄酒樣品的品種、產(chǎn)地等不同有關(guān)。

與葡萄酒相比，藍(lán)莓酒中黃烷醇的種類和含量相對(duì)較低，而黃酮醇的含量相對(duì)較高，尤其是槲皮素和槲皮苷。翁芳華等［13］檢測(cè)到藍(lán)莓酒中含有4種黃烷醇，而本實(shí)驗(yàn)中藍(lán)莓酒中能被檢測(cè)到的黃烷醇只有3種，其中表沒(méi)食子兒茶素未曾檢測(cè)到。藍(lán)莓酒的7個(gè)品種中，達(dá)柔和藍(lán)豐所含酚類化合物較多。7個(gè)品種的藍(lán)莓酒中均未檢測(cè)到白藜蘆醇，只有圓藍(lán)檢測(cè)到了虎杖苷。

桑葚酒中所含酚類化合物的種類與藍(lán)莓酒相似，不同之處在于桑葚酒不含表兒茶素沒(méi)食子酸酯，而含有白藜蘆醇。桑葚酒在所含酚類化合物種類上雖不及葡萄酒，但在黃酮醇的總含量上是超過(guò)葡萄酒的，這與李岳珍等［14］所報(bào)道的桑葚酒中黃酮醇含量情況的比較是一致的。

表5　藍(lán)莓酒樣品中13種酚類化合物的含量分析?。╩g/L）

表6　桑葚酒樣品中13種酚類化合物的含量分析?。╩g/L）

表7　3種酒中13種酚類化合物的平均含量　（mg/L）

3　結(jié)論

漿果類果酒風(fēng)味良好，富含多種酚類物質(zhì)，同時(shí)又兼具良好的保健功能，具有良好的發(fā)展前景。但果酒中酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，許多酚類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，使其分離較難。高效液相色譜具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、色譜柱的選擇范圍寬、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是檢測(cè)酚類化合物最常用的方法之一。

本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法，為樣品分析提供了較為豐富的定性和定量信息，并通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、洗脫條件、柱溫、流速等色譜條件的優(yōu)化，在最佳色譜條件下13種酚類物質(zhì)均得到了很好的分離。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，各物質(zhì)的線性關(guān)系良好，檢測(cè)限低，加樣回收率準(zhǔn)確度較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較好，將方法用于葡萄酒、藍(lán)莓酒、桑葚酒等果酒樣品的測(cè)定，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、可靠，適于果酒中酚類物質(zhì)含量的分析。為同時(shí)測(cè)定果酒中不同種類的多酚建立了一種可靠的方法。

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優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-06-16；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160616.1415.001.html。

中圖分類號(hào)：TS262.7；TS261.7；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）07-0103-06

DOI：10.13746/j.njkj.2016150

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303073-01）。

收稿日期：2016-05-03

作者簡(jiǎn)介：王瀅雪（1991-），女，碩士，研究方向?yàn)楣漆勗旒皺z測(cè)。

通訊作者：戰(zhàn)吉宬（1972-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸丫苹瘜W(xué)、葡萄生理生化與分子生物學(xué)；侯彩云（1963-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)技術(shù)的研究與推廣。

Simultaneous Detection of 13 Kinds of Polyphenols in Fruit Wine by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography

WANG Yingxue，LIU Xueping，SUN Xiangyu，HOU Caiyun and ZHAN Jicheng
（Beijing Key Lab of Viticulture and Enology，College of Food Science and Nutritional Engineering，ChinaAgricultural University，Beijing 100083，China）

Abstract:A new method of RP-HPLC has been developed for simultaneous detection of 13 polyphenols（5 flavan-3-ols，4 flavonols，2 phenolic acids and 2 stilbene）in fruit wine.The separation was performed on a LiChrospher 100 RP-18e column at 30℃.The mobile phase was consisted of 0.1%phosphoric acid（A）and 0.1%phosphoric acid methanol（B），with gradient elution at a flow rate of 0.5 mL/min.The injection volume was 10 μL and a Photo-Diode Array（PDA）was used to monitor signals at 272 nm.Under these chromatographic conditions，13 polyphenols were successfully separated in 48 minutes and their contents showed good linear relationships with the peak areas，R2＞0.998.The method had the advantages of high recovery rate（73%～123%），good repeatability，good accuracy，and rapid detection.The contents of 13 polyphenols in six grape wine products，seven blueberry wine products，and five mulberry wine products were determined by this method.The results suggested that，13，10，and 9 polyphenols could be detected in grape wine，blueberry wine，and mulberry wine，respectively；the content of flavan-3-ols in grape wine was higher，on the other hand，the content of flavonols in blueberry wine and mulberry wine was higher；resveratrol was detected in grape wine and in mulberry wine，while there was no resveratrol in blueberry wine.This mehtod was suitable for the detection of mutiple phenolic compounds in various wine products.

Key words：fruit wine；polyphenols；RP-HPLC