不同紅色釀酒葡萄中多酚物質(zhì)的差異性研究

周鵬輝，李　進(jìn)，李澤福（中糧長(zhǎng)城葡萄酒（煙臺(tái)）有限公司/山東省葡萄酒工程技術(shù)研究中心/山東省企業(yè)技術(shù)中心，山東蓬萊265608）

不同紅色釀酒葡萄中多酚物質(zhì)的差異性研究

周鵬輝，李進(jìn)，李澤福
（中糧長(zhǎng)城葡萄酒（煙臺(tái)）有限公司/山東省葡萄酒工程技術(shù)研究中心/山東省企業(yè)技術(shù)中心，山東蓬萊265608）

摘要：利用高效液相色譜檢測(cè)蓬萊產(chǎn)區(qū)赤霞珠、品麗珠、小味兒多3種葡萄果皮與籽中15種單體酚和5種花色苷的含量。結(jié)果表明，3個(gè)品種的白藜蘆醇含量基本一致；果皮中花色苷含量以小味兒多最高，赤霞珠與品麗珠基本一致；15種單體酚總量以小味兒多最高，品麗珠的最低。

關(guān)鍵詞：釀酒葡萄； 小味兒多； 多酚物質(zhì)； 白藜蘆醇； 花色苷

多酚化合物（Polyphenol）是一類含有酚羥基的物質(zhì)。由于其在植物分類、感官特性以及藥理方面的重要性，成為業(yè)內(nèi)研究最多的天然化合物之一［1］。許多研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)，多酚物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化作用，以及明顯的抑菌、抗癌、抗老化和抑制膽固醇上升等功效，攝取一定量的多酚類物質(zhì)能夠有效地預(yù)防和抑制疾病的發(fā)生。因此，多酚類物質(zhì)被稱為人類健康的“第七營(yíng)養(yǎng)素”［2-3］。在葡萄與葡萄酒學(xué)中，將多酚分為色素和無(wú)色多酚兩大類，其中色素主要有花色素和黃酮兩類，無(wú)色多酚主要分為酚酸（苯酸類和苯丙酸類）、聚合多酚（兒茶素和原花色素）及單寧（縮合單寧和水解單寧等）［4］。葡萄含有豐富的多酚類物質(zhì)，主要分布在果皮和種籽中，紅葡萄果皮中多酚主要有花色素類（如花色苷）、酚酸類（如咖啡酸、香豆酸、阿魏酸等）、黃酮醇類（如槲皮素、堪非醇、楊梅黃酮等）、黃烷醇類（如兒茶素、表兒茶素等）及白藜蘆醇，而葡萄籽中主要是兒茶素、槲皮素、原花青素、單寧等。

紅色釀酒葡萄中多酚類物質(zhì)對(duì)葡萄酒外觀、收斂性、口感以及保健性能起到?jīng)Q定性作用，而不同釀酒品種間也存在著明顯的差異。本研究選擇蓬萊產(chǎn)區(qū)3個(gè)紅色釀酒葡萄品種赤霞珠、品麗珠、小味兒多，采用HPLC技術(shù)以15種單體酚和5種花色素為標(biāo)準(zhǔn)，分析3個(gè)品種果皮和籽中花色苷、酚酸、黃酮醇類、黃烷醇類及白藜蘆醇等多酚類物質(zhì)的組成與含量的差異，以期為蓬萊產(chǎn)區(qū)品種適應(yīng)性選擇及不同品種的釀造技術(shù)提供科學(xué)的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

選取蓬萊產(chǎn)區(qū)2014年成熟采收的赤霞珠、品麗珠、小味兒多3種釀酒葡萄，其采收期分別為10月8日、9月30日、10月15日，要求3種葡萄品種原料的樹(shù)齡、架勢(shì)、田園管理均一致。

主要試劑：乙腈為色譜純；甲酸、甲醇等其他試劑為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)品：咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、沒(méi)食子酸、香草酸、水楊酸、堪非醇、楊梅黃酮、兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表?xiàng)攦翰杷貨](méi)食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）、白藜蘆醇、錦葵色素-3-葡萄糖苷（MV）、飛燕草素-3-葡萄糖苷（DEL）、矢車菊素-3-葡萄糖苷（CYA）、芍藥素-3-葡萄糖苷（PEO），均由Sigma公司生產(chǎn)；蘆丁、槲皮素、兒茶素（CAT），均由中國(guó)藥品生物制品鑒定所生產(chǎn)。

儀器：Agilent 1200液相色譜儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、水浴恒溫振蕩器，為國(guó)產(chǎn)。

1.2分析方法

1.2.1樣品前處理

取-20℃冷凍的葡萄，將皮、籽、肉分開(kāi)，將皮和籽用液氮研磨，研磨后置于冰箱中備用。取凍干研磨后的葡萄樣品1 g于提取液（丙酮∶水∶甲酸=80∶19∶1）中，料液比為1∶10（質(zhì)量體積比）。每個(gè)葡萄樣品的皮和籽各做3個(gè)平行樣進(jìn)行提取，記錄每個(gè)平行稱取樣品的實(shí)際質(zhì)量。將提取體系水浴振蕩30 min后，離心取上清液。將皮和籽的提取液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用2 mL色譜級(jí)甲醇重溶，存放于-20℃下避光保存待分析。測(cè)定樣品前需經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.2.2單體酚測(cè)定色譜條件

AgilentZORBAXSB-C18色譜柱（5μm，4.6×250mm），紫外檢驗(yàn)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，以峰面積外標(biāo)法定量。梯度洗脫：流動(dòng)相A：水-甲酸（98∶2，v/v），流動(dòng)相B：乙腈，流速為1 mL/min。洗脫程序：0～7 min，B相為5%～10%；7～10 min，B相為10%～20%；10～15 min，B相為20%～30%；15～20 min，B相為30%～40%；20～30 min，B相為40%～50%；30～40 min，B相為50%～50%。

1.2.3花色苷測(cè)定色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18（3.5 μm，4.6×100 mm），檢驗(yàn)波長(zhǎng)520 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL，以峰面積外標(biāo)法定量。梯度洗脫：流動(dòng)相A：8%甲酸-水，流動(dòng)相B：乙腈，流速1 mL/min。洗脫程序：0～10 min，B相為10%～15%；10～15 min，B相為15%～20%；15～20 min，B相為20%～30%；20～30 min，B相為30%～40%；20～35 min，B相為40%～50%。

2　結(jié)果與分析

2.1白藜蘆醇含量差異性分析

白藜蘆醇（Resveratrol，簡(jiǎn)稱RES），分子式C14H12O3，相對(duì)分子質(zhì)量228.25，存在順式和反式2種結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生于葡萄表皮和漿果果皮中。作為葡萄酒的一種功效成分，其游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)，在順式和反式2種形式時(shí)都具有抗氧化功能，是葡萄植株對(duì)真菌病害感染反應(yīng)產(chǎn)生的一種重要的植物抗毒素，能夠阻止低密度脂蛋白的氧化，因而具有潛在的防心血管疾病、防癌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用［5］。在葡萄酒中的含量受酒種、葡萄品種、產(chǎn)地、栽培條件、發(fā)酵工藝等因素影響，存在較大差異，但一般認(rèn)為紅葡萄酒中含量大于白葡萄酒［6］。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)（圖1），3個(gè)品種果皮與籽的白藜蘆醇總量（干重，下同）基本一致，都在2.0～3.0 mg/kg范圍內(nèi)，但具體分布卻差異較大：在籽中，小味兒多的含量最高，為1.5 mg/kg，而赤霞珠的含量最低，僅為0.6 mg/kg；果皮中含量正好相反，赤霞珠的最高，達(dá)到2.3 mg/kg，小味兒多的僅為0.8 mg/kg；品麗珠籽與果皮中含量差異不大，均在1.2 mg/kg左右。由此可知，在對(duì)該3種葡萄的釀造過(guò)程中，赤霞珠可通過(guò)前期低溫浸漬果皮獲得較多的白藜蘆醇，而小味兒多則需在酒精發(fā)酵后通過(guò)加強(qiáng)對(duì)葡萄籽的浸漬來(lái)獲得較多的白藜蘆醇，品麗珠的工藝處理方式則應(yīng)介于前2種葡萄之間。

圖1　葡萄籽與果皮中白藜蘆醇含量對(duì)比

2.2酚酸類單體酚含量差異性分析

葡萄漿果中的酚酸，包括羥基苯甲酸和羥基肉桂酸的衍生物，其中前者的衍生物包括五倍子酸、兒茶酸、香子蘭酸和水楊酸，它們可與葡萄酒中的酒精和單寧結(jié)合；后者衍生物的含量較高，包括香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，常以糖、有機(jī)酸及各種醇的酯化形式存在于葡萄酒中［7］，在后期的釀造與陳釀過(guò)程中會(huì)緩慢水解一部分，所以在酒中常以游離和結(jié)合的形態(tài)存在。根據(jù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖2和圖3），標(biāo)樣的5種酚酸類單體酚在3種葡萄籽中均存在，總量以赤霞珠的最高，品麗珠的最低，但各種酸的含量差異較大，赤霞珠中阿魏酸的含量最高，為16.8 mg/kg，其次是13.6 mg/kg的香豆酸，沒(méi)食子酸和水楊酸的含量較低，在0.5 mg/kg水平；品麗珠中香草酸的含量最高，為10.6 mg/kg，其余均較低，在1.5 mg/kg以下；小味兒多中水楊酸的含量最高，為12.3 mg/kg，其次是阿魏酸，為10.5 mg/kg，最低是咖啡酸，為0.5 mg/kg。而在葡萄果皮中，沒(méi)食子酸僅存在于品麗珠中，且含量較低，而品麗珠中不含水楊酸，酚酸總量以小味兒多最高，赤霞珠最低，單體酚在品種間的差異仍較大，赤霞珠中香草酸含量最高，為11.3 mg/kg，品麗珠和小味兒多中都是阿魏酸含量最高，分別為22.5 mg/kg和34.7 mg/kg。

2.3黃酮醇類單體酚含量差異性分析

圖2　葡萄籽中酚酸類單體酚含量

圖3　葡萄皮中酚酸類單體酚含量

黃酮屬于類黃酮化合物，與花色素統(tǒng)稱為色素，其存在于所有品種葡萄的漿果中，分子結(jié)構(gòu)中含有“黃烷構(gòu)架”，可與糖苷結(jié)合，形成一個(gè)或多個(gè)糖的雜多糖苷［8］。因在葡萄酒中的含量較少，對(duì)其的研究認(rèn)識(shí)也不多。實(shí)驗(yàn)以槲皮素、堪非醇、楊梅黃酮、蘆丁4種黃酮醇類單體酚為標(biāo)樣進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)（圖4和圖5），在葡萄籽中，赤霞珠和品麗珠僅含有楊梅黃酮和蘆丁2種單體酚，且都是蘆丁含量較高，而小味兒多除上述2種外，還含有1.4 mg/kg的堪非醇，仍是蘆丁的含量最高，達(dá)到10.8 mg/kg；在葡萄果皮中，3種葡萄均不含堪非醇，赤霞珠和品麗珠仍是以蘆丁含量最高，而小味兒多以4 mg/kg的楊梅黃酮含量最高，槲皮素與蘆丁的含量稍低，在3.0 mg/kg水平。

圖4　葡萄籽中黃酮醇類單體酚含量

2.4黃烷醇類單體酚含量差異性分析

葡萄酒中的聚合多酚為黃烷醇，可分為兒茶素（CAT）和原花色素兩大類，都以衍生物或聚合物形式存在，可與糖結(jié)合成苷，也可與有機(jī)酸縮合成酯，如兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表?xiàng)攦翰杷貨](méi)食子酸酯（EGCG）。黃烷醇類是縮合單寧的前體，其中，兒茶素可通過(guò)聚合形成單寧［9］。在葡萄漿果或葡萄酒中，主要形成單寧。通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖6和圖7），黃烷醇類單體酚總量在所有酚類中含量最高，在葡萄籽中，赤霞珠的總量達(dá)到105.3 mg/kg、小味兒多的達(dá)到144.8 mg/kg；在葡萄果皮中，赤霞珠的總量與籽中基本一致，為104.6 mg/kg，品麗珠和小味兒多在70 mg/kg水平左右。而單體酚的含量差異較大，在葡萄籽中，赤霞珠以EGCG含量最高，達(dá)到73.6 mg/kg，其次是22.6 mg/kg的CAT，而EC和ECG的含量在4～6 mg/kg范圍內(nèi)；品麗珠以EC和EGCG的含量稍高，在6～8 mg/kg范圍內(nèi)，其余2種的含量在2 mg/kg以下；小味兒多也以EC和EGCG的含量高，CAT和ECG的含量低，但差異懸殊，前2種在70 mg/kg水平，后2種則在0.5 mg/kg水平。在葡萄果皮中，都是以CAT的含量最高，超過(guò)55 mg/kg，而赤霞珠和小味兒多的表現(xiàn)較為相似。綜合分析，3種葡萄黃烷醇類單體酚的含量可在化學(xué)層面解釋其不同單品種葡萄酒陳釀潛力差異的原因。

圖5　葡萄皮中黃酮醇類單體酚含量

圖6　葡萄籽中黃烷醇類單體酚含量

2.5葡萄皮中花色苷含量差異性分析

花色素與糖苷形成花色苷，存在于葡萄果皮中，在釀造過(guò)程中經(jīng)過(guò)浸漬和發(fā)酵工藝而進(jìn)入葡萄酒中，并可與乙醇、香豆酸、咖啡酸等結(jié)合成?；ㄉ?，色調(diào)、色度都會(huì)發(fā)生明顯的變化［10］。在浸漬及發(fā)酵初期，果皮中部分單體花色苷進(jìn)入酒中，顏色呈鮮艷的紫紅色，發(fā)酵及陳釀過(guò)程中逐漸聚合形成聚合花色苷，使葡萄酒的顏色逐漸變?yōu)榇u紅色。在歐亞種葡萄及葡萄酒中，花色苷主要包括5種花色素形成的糖苷及其衍生物：飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、芍藥素、錦葵花素，其中以錦葵花素為主，也最為穩(wěn)定，飛燕草素最不穩(wěn)定［11］。葡萄及葡萄酒中花色苷的含量及比例直接影響葡萄酒的色度、色調(diào)及化學(xué)穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖8），3種品種中，以小味兒多的花色苷總量最高，達(dá)32.75 mg/g，赤霞珠和品麗珠基本一致，在15.3 mg/g水平；3種均是錦葵花素的含量最高，與前人研究一致，仍以小味兒多的最高，其次都是芍藥素的含量次之，然后是矮牽牛素；赤霞珠和小味兒多2種葡萄中不含矢車菊素，而品麗珠都含有這5種花色苷。

圖7　葡萄皮中黃烷醇類單體酚含量

圖8　葡萄皮中花色苷含量

3　結(jié)論與討論

多酚和單寧類物質(zhì)是葡萄酒存在差異的主要原因之一，決定著葡萄酒風(fēng)味的優(yōu)劣，影響著葡萄酒的生物化學(xué)穩(wěn)定性［12］。本研究針對(duì)蓬萊產(chǎn)區(qū)赤霞珠、品麗珠、小味兒多3個(gè)紅色釀酒葡萄果皮和籽中15種單體酚和5種花色素進(jìn)行對(duì)比測(cè)定，結(jié)果表明：

（1）3個(gè)品種白藜蘆醇總量基本一致，但赤霞珠果皮中的含量最高，小味兒多的籽中含量最高，品麗珠中兩者基本持平。

（2）3個(gè)品種的15種單體酚總量以小味兒多最高，品麗珠的最低，而葡萄籽中以小味兒多的最高，品麗珠的最低；果皮中以赤霞珠的最高，品麗珠的最低。其中，酚酸類總量以小味兒多最高，品麗珠的最低，而葡萄籽中以赤霞珠的最高，品麗珠的最低；果皮中以小味兒多的最高，赤霞珠的最低。黃酮醇類總量以小味兒多最高，品麗珠的最低，而葡萄籽中以小味兒多的最高，赤霞珠的最低；果皮中以赤霞珠的最高，品麗珠的最低。黃烷醇類總量以小味兒多最高，品麗珠的最低，而葡萄籽中以小味兒多的最高，品麗珠的最低；果皮中以赤霞珠的最高，品麗珠的最低。

（3）3個(gè)品種果皮中花色苷總量以小味兒多最高，赤霞珠與品麗珠基本一致。

（4）對(duì)于赤霞珠葡萄來(lái)說(shuō)，果皮與籽中多酚含量基本一致，都在140 mg/kg水平，建議在釀造過(guò)程中應(yīng)同時(shí)注意加大前期浸漬和后浸漬兩個(gè)工藝，以獲得果皮與籽中較高的酚類物質(zhì)，而對(duì)于小味兒多來(lái)說(shuō)，葡萄籽中多酚含量高于果皮，建議加強(qiáng)后浸漬工藝，以獲得籽中的多酚物質(zhì)；對(duì)于品麗珠來(lái)說(shuō)，因?yàn)楣ぶ蟹宇愇镔|(zhì)較高，故建議加強(qiáng)前期對(duì)果皮的浸漬，以獲得果皮中的多酚。

（5）通過(guò)本研究，可以有效考察蓬萊產(chǎn)區(qū)不同紅色釀酒葡萄漿果中不同部位多酚物質(zhì)的含量與差異，為產(chǎn)區(qū)內(nèi)釀酒葡萄質(zhì)量的評(píng)估及釀造工藝的選擇提供參考。

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優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-04-01；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160401.1346.006.html。

中圖分類號(hào)：TS262.6；TS261.7；S663.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）07-0055-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016053

收稿日期：2016-02-23

作者簡(jiǎn)介：周鵬輝（1987-），男，河南周口人，助理工程師，大學(xué)本科，主要從事葡萄酒釀造相關(guān)的研究，E-mail：zhouph1987@126.com。

The Difference in Polyphenols in Red Wine Grape of Different Species

ZHOU Penghui，LI Jin and LI Zefu
（COFCO Greatwall Winery（Yantai）CO.Ltd.，Shandong Provincial Grape Wine Engineering Research Center，Shandong Provincial Enterprise Technology Center，Penglai，Shandong 265608，China）

Abstract:The content of 15 kinds of free phenol and 5 kinds of anthocyanins in grape peel and grape seed of three kinds of red wine grape including Cabernet Sauvignon，Cabernet Franc and Petit Verdot in Penglai regions was measured by HPLC.The results suggested that，all the three kinds of wine grape had almost the same content of resveratrol，Petit Verdot had the highest content of anthocyanins in grape peel（Cabernet Sauvignon had almost the same content of anthocyanins as Cabernet Franc），and the total content of 15 kinds of free phenol was the highest in Petit Verdot and the lowest in Cabernet Franc.

Key words:wine grapes；Petit Verdot；polyphenols；resveratrol；anthocyanins