瀏陽(yáng)黑山羊瘤胃上皮細(xì)胞周期分布、增殖和凋亡特點(diǎn)

韓奇鵬　羅　玲　揭紅東　王凱軍　張佩華*　周傳社　孔志偉　湯少勛

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；2.中國(guó)科學(xué)院,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站，長(zhǎng)沙410125)

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瀏陽(yáng)黑山羊瘤胃上皮細(xì)胞周期分布、增殖和凋亡特點(diǎn)

韓奇鵬1，2羅玲1揭紅東1王凱軍1張佩華1*周傳社2*孔志偉2湯少勛2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；2.中國(guó)科學(xué)院,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站，長(zhǎng)沙410125)

摘要：本研究旨在建立瀏陽(yáng)黑山羊瘤胃上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，并對(duì)其周期分布、增殖和凋亡特點(diǎn)進(jìn)行研究。試驗(yàn)采集60日齡瀏陽(yáng)黑山羊的瘤胃上皮組織，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化法對(duì)山羊瘤胃上皮組織進(jìn)行消化，得到單個(gè)的山羊瘤胃上皮原代細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過(guò)倒置顯微鏡對(duì)原代和傳代培養(yǎng)階段細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，應(yīng)用細(xì)胞免疫組化學(xué)方法對(duì)傳代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞周期分布情況和凋亡比率。結(jié)果顯示：1)經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化獲得的山羊瘤胃上皮原代細(xì)胞，培養(yǎng)1 d開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，2 d開(kāi)始生長(zhǎng)較快(對(duì)數(shù)期)，呈典型的“波峰”狀生長(zhǎng)，3～4 d生長(zhǎng)最為迅速，7 d生長(zhǎng)速度平穩(wěn)(平臺(tái)期)。2)經(jīng)細(xì)胞免疫組化學(xué)方法的鑒定，細(xì)胞胞漿為黃褐色，即細(xì)胞角蛋白19呈陽(yáng)性表達(dá)。3)膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶聯(lián)合染色顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡比率顯著增加(P<0.01)。結(jié)果表明，通過(guò)0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA的消化方法成功得到了瀏陽(yáng)黑山羊瘤胃上皮細(xì)胞，可為今后研究反芻動(dòng)物瘤胃相關(guān)機(jī)制與功能提供模型。

關(guān)鍵詞：瀏陽(yáng)黑山羊；瘤胃上皮細(xì)胞；周期分布；凋亡

瘤胃作為反芻動(dòng)物重要的消化器官，了解瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能，對(duì)維持消化系統(tǒng)穩(wěn)定和促進(jìn)動(dòng)物健康有著重要的實(shí)際意義。反芻動(dòng)物瘤胃壁分為3層，由腔外向腔內(nèi)分別為豁漿膜層、豁膜肌層和膜層[1]。瘤胃壁中與其吸收代謝功能聯(lián)系最緊密的為瘤胃上皮。瘤胃上皮分為4個(gè)層，由漿膜層向黏膜層依次是角質(zhì)層、基底層、棘突層和顆粒層[2]。瘤胃上皮細(xì)胞分為基底層細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、棘突層和顆粒層細(xì)胞，還有高度分化的角質(zhì)層細(xì)胞[3]。其中，去除角質(zhì)層細(xì)胞等雜細(xì)胞得到較多、較純及生命活性正常的處于中間層的棘突層和顆粒層細(xì)胞，是體外分離、培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞(ruminal epithelium cell，REC)的關(guān)鍵。Weekes[4]采用木瓜酶分裂乳頭組織，得到生長(zhǎng)正常的離體上皮細(xì)胞。Gálfi等[5]為研究瘤胃上皮生酮，首次應(yīng)用胰蛋白酶連續(xù)消化法，先去除堅(jiān)實(shí)的角質(zhì)層細(xì)胞，再連續(xù)消化，得到體外研究瘤胃營(yíng)養(yǎng)代謝最佳的棘狀層和顆粒層細(xì)胞。之后他們又采用同樣的方法，成功地分離培養(yǎng)出了綿羊瘤胃上皮細(xì)胞，但是該法需約8 h從基底層和棘層中分離出細(xì)胞，限制了上皮細(xì)胞代謝研究中的應(yīng)用[6]。Klotz等[7]對(duì)消化緩沖液和胰蛋白酶濃度進(jìn)行了優(yōu)化，獲得大量細(xì)胞形態(tài)正常的瘤胃上皮細(xì)胞。Stumpff等[8]在前人的基礎(chǔ)上改進(jìn)了取材方法，設(shè)計(jì)制作了一種模具，使胰蛋白酶只作用于瘤胃乳頭，從而分離出較純凈的上皮細(xì)胞。范燕茹等[9]為建立馴鹿瘤胃上皮細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)方法，用0.25%胰蛋白酶(trypsin)+0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液37 ℃連續(xù)振蕩3～4 h消化上皮組織，得出傳1代的細(xì)胞活性正常的馴鹿原代離體瘤胃上皮細(xì)胞。

雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞已有研究，但只停留在獲取原代細(xì)胞到傳1代細(xì)胞，對(duì)其后續(xù)試驗(yàn)研究少有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以期建立一種有效、快速的獲得山羊瘤胃上皮細(xì)胞，且成功進(jìn)行原代培養(yǎng)的模型，并對(duì)其周期分布情況和凋亡比率進(jìn)行初步研究，為今后研究反芻動(dòng)物瘤胃相關(guān)機(jī)制與功能提供技術(shù)支持和理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物為3只60日齡健康的瀏陽(yáng)黑山羊，體重為(6.4±0.8) kg。頸靜脈放血致死，取出瘤胃組織，去掉內(nèi)容物后用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，待用于樣品采集。

胎牛血清(FBS)、基本培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12，DMEM/F12)、0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA、青-鏈霉素均購(gòu)自Gibico公司；兩性霉素B+慶大霉素(gentamicin/amphotericin solution)購(gòu)自Thermo公司(R-015-10)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；蘇木素和磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH 7.2～7.6)均購(gòu)自Wellbio公司；兩步法試劑盒和對(duì)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購(gòu)自中山金橋公司；免疫組化細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin-19，CK19)抗體購(gòu)自Abcam公司；常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自上海國(guó)藥生物有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1山羊瘤胃上皮細(xì)胞的采集與原代培養(yǎng)

將瀏陽(yáng)黑山羊稱(chēng)重后，頸動(dòng)脈放血至死，將腹部羊毛用解剖刀刮干凈后，新潔爾滅搽拭體表皮毛，置于試驗(yàn)臺(tái)上，用棉花球沾醫(yī)用碘酒將腹部搽拭3遍，75%酒精1遍，切開(kāi)腹部，取出瘤胃，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗食糜顆粒后，置于無(wú)菌超凈臺(tái)中。采用鈍性剝離瘤胃上皮組織，用含2%青-鏈霉素、1%兩性霉素B和1%慶大霉素的洗滌液沖洗瘤胃上皮組織，并放入含2%青-鏈霉素、1%兩性霉素B和1%慶大霉素的DMEM/F12中帶回細(xì)胞培養(yǎng)室。用PBS清洗瘤胃上皮組織4～5次，剪去結(jié)締、脂肪及可見(jiàn)的導(dǎo)管組織。將瘤胃上皮組織塊盡量剪碎(約1 mm3，肉眼觀(guān)察呈糊狀)，再用PBS和DMEM/F12各洗滌1次。棄去上清液，往沉淀中加入3倍組織體積的0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液，37 ℃空氣浴振蕩消化10 min，消化完成后1 000 r/min條件下離心5 min，取上清液(盡量吹吸，促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞分離)，重復(fù)3～5次。再將收集的消化液加入適量DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含5% FBS、10%青-鏈霉素、0.1 mg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B)重懸細(xì)胞，之后依次經(jīng)100 μm孔徑篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，去上清，此時(shí)可看到細(xì)胞沉淀，如果含有黑色細(xì)胞層或角質(zhì)化細(xì)胞，則舍去(成年羊通常第1次與第2次消化得到的細(xì)胞舍去)。再往沉淀中加入PBS重懸細(xì)胞，繼續(xù)1 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，加入適量DMEM/F12培養(yǎng)液垂懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL，接種于事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)。培養(yǎng)30～60 min后，顯微鏡下觀(guān)察，吸出上清液，1 000 r/min條件下離心5 min，取沉淀，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2山羊瘤胃上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)

當(dāng)山羊瘤胃上皮原代細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿的80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞1～2次后，加入1 mL的含0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液，放入含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中消化2～3 min。放在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞開(kāi)始變亮、變圓時(shí)，迅速用含血清的培養(yǎng)基終止消化。將貼壁的細(xì)胞吹打?yàn)閼乙海D(zhuǎn)移到15 mL離心管中，在4 ℃離心機(jī)中1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 mL的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1∶2進(jìn)行傳代。在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，轉(zhuǎn)移含細(xì)胞的培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)1次，此步為純化過(guò)程。

1.2.3山羊瘤胃上皮原代和傳代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察

采用徠卡DMI3000B型倒置顯微鏡觀(guān)察山羊瘤胃上皮原代和傳代細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。

1.2.4山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞免疫組化學(xué)鑒定

根據(jù)上皮細(xì)胞的標(biāo)志性中間絲蛋白為細(xì)胞角蛋白，對(duì)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞角蛋白進(jìn)行細(xì)胞免疫組化學(xué)的鑒定。

步驟：1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞用37 ℃的0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液消化下來(lái)，當(dāng)培養(yǎng)在6孔板進(jìn)行常規(guī)的蓋玻片爬片傳代培養(yǎng)山羊瘤胃上皮細(xì)胞，待生長(zhǎng)到細(xì)胞培養(yǎng)瓶的80%～90%(3 d)。2)取出爬片，先加入PBS清洗數(shù)次后，再加入4%的多聚甲醛固定液固定30 min，室溫干燥5 min，用PBS沖洗3次，每次為3 min。3)每個(gè)孔滴加2滴或100 μL 3%濃度的H2O2，室溫下孵育10 min(此步是為了阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物物酶的干擾)。用PBS沖洗3次，每次為3 min。4)除去PBS，加封閉血清孵育20 min；每孔加入2滴或100 μL的CK19抗體，37 ℃孵育60 min；再用PBS沖洗3次，每次為3 min。放入濕盒中再放入4 ℃冰箱過(guò)夜，放入冰箱時(shí)要注意平穩(wěn)，以防止抗體從組織上滑落下來(lái)，次日放入37 ℃恒溫箱復(fù)溫45 min。5)PBS洗滌5次，每次5 min；每孔滴加50～100 μL抗兔/鼠免疫球蛋白G-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次為3 min。6)除去PBS，每孔加入300～400 μL新鮮配制的DAB染色液，顯微鏡下觀(guān)察1～5 min。7)蒸餾水沖洗10 min，蘇木精復(fù)染5～10 min，0.25%濃度的鹽酸酒精分化5～10 s，PBS藍(lán)化20 min，各級(jí)酒精(60%～100%)脫水，每級(jí)5 min，取出后置于二甲苯內(nèi)10 min，重復(fù)2次，中性樹(shù)膠封片、顯微鏡觀(guān)察。

1.2.5山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞生長(zhǎng)活性檢測(cè)

步驟：1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞用37 ℃的0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液消化下來(lái)，在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液(3×103個(gè)/孔)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)。2)對(duì)培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、9 d的山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)置不含細(xì)胞的培養(yǎng)基為對(duì)照。3)向每孔加入10 μL CCK溶液[注意不要再孔中生成氣泡，它們會(huì)影響光密度(optical density，OD)值的讀數(shù)]。4)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。5)用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的OD(OD450 nm)。6)以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，OD450 nm為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)圖。

1.2.6山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞周期分布情況

利用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)原代不同培養(yǎng)天數(shù)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞周期分布情況。

1)細(xì)胞培養(yǎng)：山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞培養(yǎng)于含5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，收集培養(yǎng)了2、4、8 d的傳代細(xì)胞進(jìn)行周期檢測(cè)，每組重復(fù)3次。

2)細(xì)胞收集：上述處理好的山羊瘤胃上皮細(xì)胞，用37 ℃的0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液消化下來(lái)，PBS洗2～3次，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×106個(gè)/mL。

3)細(xì)胞固定：加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，800 r/min×5 min，吸凈上清；加入400 μL PBS，輕輕重懸細(xì)胞，使細(xì)胞分離為單個(gè)，逐滴加入預(yù)冷的100%乙醇1.2 mL，使其終濃度為75%，4 ℃放置過(guò)夜固定。

4)細(xì)胞標(biāo)記：①取出固定的樣品，800 r/min，離心5 min，棄上清；②加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，800 r/min，離心5 min，離心收集細(xì)胞；③重復(fù)1～2次，去除乙醇；④加入150 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)工作液，4 ℃避光染色30 min；⑤轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管，上機(jī)檢測(cè)，PI用488 nm氬離子激光器激發(fā)，由630 nm通濾光片接收，通過(guò)熒光脈沖前向角散射/熒光脈沖側(cè)向角散射(FSC/SSC)散點(diǎn)圖收集1×104個(gè)細(xì)胞，采用設(shè)門(mén)技術(shù)，排除黏連細(xì)胞和碎片，分析PI熒光直方圖上各細(xì)胞周期的百分率。

1.2.7山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率

山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞培養(yǎng)于含5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，收集培養(yǎng)了2、4、8 d的傳代細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，每組重復(fù)3次。步驟：1)用不含EDTA的胰蛋白酶消化液消化，并收集山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞；2)用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次2 000 r/min離心5 min，收集1×105～5×105個(gè)細(xì)胞；3)加入500 μL的結(jié)合緩沖液(binding buffer)懸浮細(xì)胞；4)加入5 μL膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的試劑混勻后，加入5 μL PI，混勻；5)室溫、避光，反應(yīng)5～15 min；6)1 h內(nèi)，上流式細(xì)胞儀觀(guān)察檢測(cè)。

1.3數(shù)據(jù)分析

免疫組化學(xué)的采像用普通的電腦采像，圖像分析軟件為專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件(Image-Pro-Plus，IPP)；細(xì)胞周期與凋亡應(yīng)用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)采集數(shù)據(jù)，并用專(zhuān)業(yè)軟件(Flowjo)進(jìn)行圖像分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 9.2軟件統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)差異顯著性定義為P<0.01，P>0.01則無(wú)顯著差異。

2結(jié)果

2.1山羊瘤胃上皮原代和傳代細(xì)胞形態(tài)

山羊瘤胃上皮原代和傳代細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA酶消化第4次離心后會(huì)看到大量的細(xì)胞白色沉淀，直到消化至第6次時(shí)細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始減少，且組織變得黏膩。收集后在顯微鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)較多的細(xì)胞，且單個(gè)散在，大小均一，具有較好的折光度(圖1-A)。調(diào)整細(xì)胞密度進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后大部分貼壁，有未貼壁懸浮的細(xì)胞，細(xì)胞顏色發(fā)暗，并開(kāi)始生長(zhǎng)，呈島嶼狀分布，細(xì)胞折光度較好，形態(tài)較圓，體積較小(圖1-B)。4 d后開(kāi)始迅速生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖明顯，顯現(xiàn)典型的鵝卵石狀，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(圖1-C)。經(jīng)過(guò)3～4次的傳代純化培養(yǎng)，得到較純的山羊瘤胃上皮細(xì)胞，呈現(xiàn)典型的鵝卵石狀(圖1-D)。

A.原代培養(yǎng)1 d的山羊瘤胃上皮細(xì)胞；B.原代培養(yǎng)2 d的山羊瘤胃上皮細(xì)胞；C.原代培養(yǎng)4 d培養(yǎng)的山羊瘤胃上皮細(xì)胞；D.純化傳代培養(yǎng)4 d的山羊瘤胃上皮細(xì)胞。

A. goat ruminal epithelial cells of primary culture of 1 d; B. goat ruminal epithelial cells of primary culture of 2 d; C. goat ruminal epithelial cells of primary culture of 4 d; D. goat ruminal epithelial cells of purified subculture of 4 d.

圖1山羊瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)

Fig.1Morphology of ruminal epithelium cells of goats (200×)

2.2山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞免疫組化學(xué)鑒定

經(jīng)細(xì)胞免疫組化學(xué)方法的鑒定，細(xì)胞胞漿為黃褐色，即細(xì)胞CK19呈陽(yáng)性表達(dá)(圖2)，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞。

A與B為CK19陽(yáng)性細(xì)胞漿表達(dá)；C與D為PBS陰性對(duì)照。A、B、C、D蘇木素細(xì)胞核染色。

A and B were CK19 positive expression in cell plasma; C and D were PBS negative control. A, B, C and D were haematoxylin nuclear staining.

圖2山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞免疫組化學(xué)鑒定

Fig.2Immunohistochemical identification of subcultured ruminal epithelium cells of goats (100×)

2.3山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞生長(zhǎng)活性

不同培養(yǎng)時(shí)間山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)活性測(cè)定結(jié)果如圖3所示。山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈典型“S”型。細(xì)胞增殖過(guò)程，1～2 d為潛伏期，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；3～7 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)較快；7～8 d為平臺(tái)期，細(xì)胞增殖相對(duì)平穩(wěn)；8 d后進(jìn)入衰退期，細(xì)胞增殖活性開(kāi)始降低。

圖3　山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.3　The growth curve of subcultured ruminal epithelium cells of goats

2.4山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞周期分布情況

不同培養(yǎng)時(shí)間山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞周期分布情況如圖4所示。細(xì)胞周期一般分為G0/G1、S、G2/M期3部分，在G0/G1期前面都有個(gè)凋亡峰(也稱(chēng)sub-G0期)，證明有細(xì)胞凋亡，且最前面沒(méi)有細(xì)胞碎片峰，證明分析時(shí)細(xì)胞窗口已經(jīng)設(shè)置好。此外，變異系數(shù)(CV)都小于10%，峰形越好，越尖銳，結(jié)果越可信。應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01)，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)。

Channels(FL2-A-PI-Area)為PI紅色熒光通過(guò)PI通道(FL2)的熒光峰面積；Number為細(xì)胞數(shù)量。G1為DNA合成前期(第1紅色峰)；S為DNA合成期；G2為DNA合成后期(第2紅色峰)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2個(gè)圖分別為2個(gè)重復(fù)的。

Channels(FL2-A-PI-Area) was fluorescence peak area of PI red fluorescence passed PI channel (FL2); Number was the number of cells. G1was early stage of DNA synthesis (the 1st red peak); S was DNA synthesis stage; G2was late stage of DNA synthesis (the 2nd red peak). Two figures at each time point were two replicates.

圖4山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞周期分布情況

Fig.4Distribution of cell cycle of subcultured ruminal epithelium cells of goats

2.5山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率

本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)(膜聯(lián)蛋白V/PI雙染法)檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡的結(jié)果，如圖5所示。通過(guò)BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，并用Cell Flowjo專(zhuān)用軟件分析，得出細(xì)胞凋亡的3個(gè)時(shí)期凋亡早期(LR)、凋亡中期(UR)、凋亡晚期/壞死(UL)細(xì)胞所占的百分比，通過(guò)公式“凋亡率(%)=LR+UR+UL”得出山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率。應(yīng)用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表2)發(fā)現(xiàn)，8 d凋亡比率顯著高于2、4 d(P<0.01)。這說(shuō)明隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡比率增加，到8 d時(shí)增加的更為明顯。

表1　不同細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞周期分布Table 1　Cell cycle distribution of subcultured ruminal epithelial cells of goats at different culture time

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母者差異顯著(P<0. 01)。下表同。

Values in the same row with different letter superscripts differed significantly (P<0. 01). The same as below.

PI：碘化丙啶；AV-FITC：膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素。RFI:相對(duì)熒光強(qiáng)度;CC:細(xì)胞數(shù)。LR：凋亡早期；UR：凋亡中期；UL：凋亡晚期/壞死；LL：正常細(xì)胞。

PI: propidium iodide; AV-FITC: annexin-fluorescein isothiocyanate. RFI: the relative fluorescence intensity; CC:cell count. LR: early apoptosis; UR: middle apoptosis; UL: late apoptosis/necrosis; LL: normal cells.

圖5　山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率Fig.5　Apoptosis ratio of subcultured ruminal epithelium cell of goats表2　不同細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率Table 2　Apoptosis ratio of subcultured ruminal epithelium cells of goats at different culture time　%

3討論

3.1山羊瘤胃上皮細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)

體外分離培養(yǎng)一般分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)2大類(lèi)[10]，而原代培養(yǎng)方法通常分為時(shí)間段、產(chǎn)量高、形態(tài)分化良好、組織需要量大的酶消化法和易脫落、成功率低、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、需要組織量少的組織塊培養(yǎng)方法[11]。孫志洪等[12]針對(duì)建立山羊瘤胃上皮細(xì)胞(RNC)的原代培養(yǎng)方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)瀏陽(yáng)黑山羊瘤胃上皮組織用2.50%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化后獲得的細(xì)胞分離效果及細(xì)胞增殖活性最為理想，可用于原代培養(yǎng)。于是本試驗(yàn)應(yīng)用2.50% 胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液10 min連續(xù)消化的方法，100 μm孔徑篩網(wǎng)過(guò)濾，得到較多、活力較強(qiáng)的單個(gè)細(xì)胞。此外，本試驗(yàn)在瘤胃組織取樣中采用的組織洗滌液和原代細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了2%青-鏈霉素、1%慶大霉素和兩性霉素B，瘤胃上皮細(xì)胞可傳代到4代以上，且細(xì)胞生長(zhǎng)活性及形態(tài)正常。

由于原代細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)參雜有生長(zhǎng)速度比上皮細(xì)胞快的成纖維細(xì)胞[13]。根據(jù)成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶+EDTA較敏感，較先脫落，且易貼壁等特點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞純化[14]。細(xì)胞純化方法有很多種，常用的方法有相差消化法、相差貼壁法和刮除法等[15]，還有克隆環(huán)和96孔有限稀釋法等[16]。Inooka等[17]應(yīng)用相差消化法，以胰酶消化預(yù)處理，再用胰酶消化約2 h，使上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分離，并成功培養(yǎng)出瘤胃上皮細(xì)胞。而本試驗(yàn)采用了相差貼壁的方法。具體操作是待原代細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪面培養(yǎng)皿底面積的80%～90%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，用含2%青-鏈霉素的PBS洗滌2～3次，再用0.25%胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化處理；消化處理后垂懸的細(xì)胞放入37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)30 min，轉(zhuǎn)移含細(xì)胞的培養(yǎng)基到新的培養(yǎng)皿中，重復(fù)操作1次，經(jīng)過(guò)2～3代的純化后，可得到較純(80 %)的瘤胃上皮細(xì)胞。

3.2山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率與細(xì)胞周期分布情況

隨著細(xì)胞與分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，對(duì)細(xì)胞凋亡的機(jī)理認(rèn)識(shí)不斷成熟，相應(yīng)的檢測(cè)細(xì)胞凋亡技術(shù)隨之完善，主要包括流式細(xì)胞術(shù)DNA瓊脂糖凝膠電泳、電化學(xué)方法、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)、原位末端缺Ⅱ標(biāo)記、RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)等[18-20]。其中流式細(xì)胞術(shù)根據(jù)凋亡細(xì)胞從細(xì)胞核、細(xì)胞器到細(xì)胞膜均發(fā)生不同程度的細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)改變的特性，對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行快速定量檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)不但可以檢測(cè)處于細(xì)胞凋亡中、晚期的細(xì)胞，而且可以檢測(cè)出處于凋亡早期的細(xì)胞。

本試驗(yàn)采用膜聯(lián)蛋白V和PI聯(lián)合染色法檢測(cè)不同培養(yǎng)天數(shù)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率，發(fā)現(xiàn)凋亡比率隨時(shí)間的增加而增加，到8 d時(shí)增加的最多。引起細(xì)胞凋亡比率升高的原因可能與極性線(xiàn)粒體受損有關(guān)。譚秀文等[21]采用玫瑰紅123(rhodamine 123)熒光染色和PI聯(lián)合染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡比率與極性線(xiàn)粒體受損呈正相關(guān)。這是由于線(xiàn)粒體內(nèi)自由基的積累導(dǎo)致極性線(xiàn)粒體膨大，線(xiàn)粒體內(nèi)膜產(chǎn)生非特異性孔道，使一些啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)流至胞質(zhì)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。此外，本試驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同培養(yǎng)天數(shù)的山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞周期分布情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，2、4、8 d內(nèi)增殖期(S、G2/M期)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而靜止期(G0/G1期)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞由靜止期進(jìn)入增殖期沒(méi)有產(chǎn)生嚴(yán)重的影響?？赡艿脑蚴请S著時(shí)間增加，DNA聚合酶、RNA聚合酶、基因調(diào)節(jié)蛋白或細(xì)胞自身遺傳物質(zhì)未發(fā)生損傷。但是，細(xì)胞凋亡卻隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡比率隨之增加，這與G0/G1期阻滯成負(fù)相關(guān)，所以，此問(wèn)題有待進(jìn)一步對(duì)凋亡機(jī)制進(jìn)行試驗(yàn)研究。

4結(jié)論

① 應(yīng)用0.25 %胰蛋白酶+0.02% EDTA連續(xù)消化及相差貼壁的方法得到較多、較純，且細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常和生命活性較強(qiáng)的山羊瘤胃上皮細(xì)胞。

② 應(yīng)用細(xì)胞免疫組化學(xué)方法對(duì)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，細(xì)胞胞漿為黃褐色，即細(xì)胞CK19呈陽(yáng)性表達(dá)。

③ 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，其生長(zhǎng)活性曲線(xiàn)呈典型“S”型。

④ 采用膜聯(lián)蛋白V和PI聯(lián)合染色法檢測(cè)原代細(xì)胞不同培養(yǎng)天數(shù)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡比率顯著增加，到8 d時(shí)增加的最多。

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(責(zé)任編輯王智航)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.034

收稿日期：2016-01-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31372342)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD14B17)；中國(guó)科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃(STS計(jì)劃)課題(KFJ-EW-STS-071)

作者簡(jiǎn)介：韓奇鵬(1988—)，男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。E-mail: 18711069677@163.com *通信作者：張佩華，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: peiqin41-@163.com；周傳社，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: zcs@isa.ac.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：S826

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)07-2269-09

*Corresponding authors: ZHANG Peihua, associate professor, E-mail: peiqin41-@163.com; ZHOU Chuanshe, professor, E-mail: zcs@isa.ac.cn

Characteristics of Ruminal Epithelium Cell Cycle Distribution,Proliferation and Apoptosis ofLiuyangBlack Goats

HAN Qipeng1,2LUO Ling1JIE Hongdong1WANG Kaijun1ZHANG Peihua1*ZHOU Chuanshe2*KONG Zhiwei2TANG Shaohui2

(1. Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Key Laboratory for Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Hunan Research Center of Livestock &Poultry Sciences, South-Central Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science of Ministry of Agriculture, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China)

Abstract:The present study was carried out to establish an in vitro culture model of rumen epithelial cells of Liuyang black goats and investigated cell cycle distribution, proliferation and apoptosis. Ruminal epithelium tissue of 60-day-old Liuyang black goats was collected, and digested with 0.25% trypsin and 0.02% ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) to obtain individual primary cultured ruminal epithelium cells for in vitro culture. The morphous of ruminal epithelial cells in primary culture and subculture was observed under inverted microscope, the growth activity curve of cells was tested by cell number count assay, the identification of subcultured ruminal epithelium cells was carried out using the method of immunohistochemistry, and the subcultured ruminal epithelium cells cycle distribution and apoptosis ratio were determined through flow cytometry method. The results showed as follows: 1) the primary cultured ruminal epithelium cells of goats were obtained by digestion of 0.25% trypsin and 0.02% EDTA, began adherent growth after cultured for 1 d, an exponential growth started and resembled a “hill” in appearance since 2 d, the cell growth rate reached the highest at 3 to 4 d, and got stable at 7 d. 2) Identified by immunohistochemistry method, the cytoplasm was brown, which meant that cytokeratin 19 (CK19) was positive expressed. 3) The combination staining of Annexin V and propidium iodide showed that the apoptosis ratio of cells significantly increased with the prolongation of culture time (P<0.01). In conclusion, the ruminal epithelium cells of Liuyang black goats are obtained successfully by the method of 0.25% trypsin+0.02% EDTA digestion, which provided cell model for further study on mechanism and the function of ruminant rumen.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2269-2277]

Key words:Liuyang black goat; ruminal epithelium cell; cycle distribution; apoptosis