鵝脂肪甘油三酯脂肪酶和長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶1基因表達(dá)差異及其對(duì)脂肪沉積和血清脂類代謝的調(diào)控

王寶維　孔　敏　葛文華　張名愛(ài)　馬傳興　張　肖

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所，國(guó)家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營(yíng)養(yǎng)與飼料功能研究室，青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島266109)

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鵝脂肪甘油三酯脂肪酶和長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶1基因表達(dá)差異及其對(duì)脂肪沉積和血清脂類代謝的調(diào)控

王寶維1,2孔敏1,2葛文華1張名愛(ài)1馬傳興1,2張肖1,2

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所，國(guó)家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營(yíng)養(yǎng)與飼料功能研究室，青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島266109)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶1(ACSL1)基因在鵝的不同組織器官中的表達(dá)差異，并探索2個(gè)基因表達(dá)對(duì)機(jī)體脂肪沉積和血清脂類代謝的調(diào)控。選取16周齡五龍鵝30只(公母各占1/2)，屠宰后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同組織器官(肝臟、心臟、皮下脂肪、腹部脂肪、胸肌、腿肌、肌胃、腺胃、小腸、腎臟、大腦、肺、脾臟)中ATGL、ACSL1基因表達(dá)量。結(jié)果表明：1)在鵝的皮下脂肪、腹部脂肪、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、胸肌和腿肌中均檢測(cè)出ATGL和ACSL1基因的表達(dá)；ATGL基因在皮下脂肪和腹部脂肪中表達(dá)量最高，其次是肝臟和脾臟，在腎臟、心臟、胸肌和腿肌中只有少量表達(dá)；ACSL1基因在皮下脂肪、腹部脂肪、肝臟、脾臟中表達(dá)量較高，在腎臟、心臟、胸肌和腿肌中有少量表達(dá)，而在肌胃、腺胃和肺中幾乎不表達(dá)。2)ATGL基因表達(dá)量與腿肌肌內(nèi)脂肪率、胸肌肌內(nèi)脂肪率、腹部脂肪率、胸肌率和腿肌率呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，與皮下脂肪率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；ACSL1基因表達(dá)量與腿肌肌內(nèi)脂肪率、胸肌肌內(nèi)脂肪率、胸肌率呈正相關(guān)(P>0.05)，與腿肌率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與皮下脂肪率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。3)ATGL基因表達(dá)量與血清甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和葡萄糖含量呈顯著或極顯著正相關(guān)(P<0.05或P<0.01)；ACSL1基因表達(dá)量與血清總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和葡萄糖含量呈負(fù)相關(guān)(P>0.05)，與甘油三酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。由此可見(jiàn)，ATGL和ACSL1基因在鵝的不同組織器官中的表達(dá)具有明顯差異性，對(duì)機(jī)體脂肪沉積和血清脂類代謝具有反向調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：鵝；脂肪甘油三酯脂肪酶基因；長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶基因；組織器官；基因表達(dá)；基因調(diào)控

脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪酶，它主要參與體內(nèi)甘油三酯水解第一步的反應(yīng)[1]，參與脂肪動(dòng)員過(guò)程，能防止脂肪在體內(nèi)的過(guò)度積累，調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育[2]。長(zhǎng)鏈脂肪酸是生物體能量的獲取和脂肪合成的重要代謝底物。長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶1(acyl-CoA synthetase 1，ACSL1)以長(zhǎng)鏈脂肪酸、ATP和輔酶A(CoA)作為底物，可以合成長(zhǎng)鏈酯酰CoA酯，通過(guò)對(duì)脂肪酸酯化反應(yīng)的控制，達(dá)到調(diào)控整個(gè)機(jī)體脂肪酸代謝的目的。Zimmermann等[1]研究發(fā)現(xiàn)，ATGL基因在小鼠脂肪組織中表達(dá)量最高，睪丸、心肌和骨骼肌次之。Dai等[3]發(fā)現(xiàn)，在豬的背部脂肪中ATGL基因表達(dá)量最高，其次是肌肉、小腸和心臟。ATGL基因在雞[4]和鴨[5]的脂肪組織中表達(dá)量最高。王芳等[6]對(duì)朗德鵝的研究顯示，ATGL基因在皮下脂肪和大腦中的表達(dá)量明顯高于其他組織。ACSL1基因在哺乳動(dòng)物不同的組織的表達(dá)量差異較大，Suzuki等[7]在大鼠肝臟中首次克隆發(fā)現(xiàn)ACSL1，同時(shí)在心臟和脂肪組織中檢測(cè)到其mRNA的存在。Mashek等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ACSL1基因除了在棕色脂肪組織、性腺、肝臟和心臟中高表達(dá)外，還在骨骼肌和大腦中有少量表達(dá)。呂佳[9]對(duì)四川白鵝的研究顯示，ACSL1基因在腹部脂肪和皮下脂肪中有極高的表達(dá)。五龍鵝(又稱豁眼鵝)是世界體型最小的鵝種之一，產(chǎn)蛋量高，而腹部脂肪含量較少，脂肪沉積速度要低于大型鵝種。目前，關(guān)于ACSL1和ATGL基因在鵝組織器官中的表達(dá)、機(jī)體脂肪沉積及與血清脂類代謝關(guān)系的研究報(bào)道較少。為此，本試驗(yàn)以5～16周齡五龍鵝為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)正常生理?xiàng)l件下ATGL和ACSL1基因在鵝的肝臟、脾臟、腹部脂肪、皮下脂肪等13個(gè)組織器官中的表達(dá)進(jìn)行研究，旨在探索ATGL和ACSL1基因在鵝不同組織器官中表達(dá)差異；此外，通過(guò)分析與脂肪沉積、肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及脂肪代謝的相關(guān)性，初步探索功能基因與鵝生長(zhǎng)發(fā)育和脂肪代謝的調(diào)控機(jī)理。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

采用相同飼養(yǎng)條件將五龍鵝，從5周齡飼養(yǎng)到16周齡，并于16周齡選擇平均體重差異不顯著(P>0.05)的試驗(yàn)鵝30只(公母各占1/2)進(jìn)行屠宰取樣測(cè)定。

1.2基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參照NRC(1994)家禽營(yíng)養(yǎng)需要量設(shè)計(jì)，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。采用高效液相色譜法測(cè)得基礎(chǔ)飼糧中泛酸含量為9.45 mg/kg。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1　Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)　%

1)多維和微量元素(不含泛酸)為每千克飼糧提供 The multivitamin and trace elements (without pantothenic acid) provided the following per kg of the diet：VA 1 500 mg，VD3200 IU，VE 12.5 mg，VK31.5 mg，VB12.2 mg，VB25.0 mg，煙酸 nicotinic acid 65 mg，VB62 mg，生物素 biotin 0.2 mg，葉酸 folic acid 0.5 mg，膽堿 choline 1 000 mg，F(xiàn)e 85 mg，Cu 5 mg，Mn 80 mg，Zn 80 mg，I 0.42 mg，Se 0.3 mg，Co 2.5 mg。

2)泛酸為實(shí)測(cè)值，其他營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值。Pantothenic acid was a measured value, while other nutrient levels were calculated values.

1.3飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前對(duì)鵝舍進(jìn)行全面消毒；全期采取舍飼，

網(wǎng)上分欄飼養(yǎng)。試驗(yàn)鵝自由飲水和采食，少添喂勤，注意觀察鵝群的生長(zhǎng)狀況。

1.4測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1屠宰指標(biāo)測(cè)定

16周齡末，翅靜脈采血后對(duì)試驗(yàn)鵝進(jìn)行屠宰，宰前禁食12 h，按照《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語(yǔ)和度量統(tǒng)計(jì)方法》(NY/T 823—2004)測(cè)定腹部脂肪重、頸部皮下脂肪重、胸肌重、腿肌重和肝臟重，迅速將采集腹部脂肪、皮下脂肪、腎臟、肝臟、心臟、小腸、胸肌、腿肌、胃和肺等組織樣品，存放于液氮速凍保存，用于提取總RNA試驗(yàn)。并于相同部位采集肝臟、腿肌、胸肌，保存于-20 ℃冰箱中用于測(cè)定肝臟、腿肌、胸肌含脂率[10]。

1.4.2腿肌、胸肌、肝臟脂肪率測(cè)定

將樣品從-20 ℃冰箱中取出解凍，剪碎稱重，置于105 ℃烘箱中烘干，用電子天平稱量其絕對(duì)干重，將脫脂濾紙?jiān)?05 ℃烘箱中烘干后稱重，然后將樣品磨碎后取2 g左右包在濾紙中，再在烘箱中烘至絕干，在電子天平上稱出其準(zhǔn)確重量，然后，將濾紙包好，放入索式提取器中用乙醚抽提12 h，水浴溫度為70～80 ℃，脫脂后的樣包烘干后稱出其脫脂后重量。

樣品(絕干)脂肪率(%)=100×

(脫脂前樣包重-脫脂后樣包重)/

(脫脂前樣包重-絕干濾紙重)[10]。

1.4.3血清生化指標(biāo)

16周齡末，翅下靜脈采血5 mL，3 000 r/ min離心10 min，取上清液。血清中甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量均用試劑盒測(cè)定，所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4.4基因表達(dá)定量測(cè)定

將肝臟樣品從液氮中取出，迅速剪取50～100 mg，加入1 mL RNAisoTMPlus試劑，按照說(shuō)明書(shū)方法提取總RNA。用分光光度計(jì)(UV-1100)檢查總RNA濃度及純度；用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，總將RNA溶液稀釋為1.0 μg/μL。

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，用PrimeScriptTMRT reagent Kit (Takara,DRR037D)對(duì)提取的RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×RT Buffer，1 μL隨機(jī)引物(100 pmol/μL)，1 μL RT-mix，5 μL模板(RNA)，3 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水。反應(yīng)條件：輕輕攪拌；25 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后，將反轉(zhuǎn)產(chǎn)物cDNA置于-20 ℃保存。

根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝的ATGLmRNA序列(GenBank登錄號(hào)HQ 914789)和ACSL1 mRNA序列(GenBank登錄號(hào)GQ 891991)與鵝的全部基因組序列相對(duì)比，應(yīng)用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，ATGL基因上游引物5′-TCGCAACCTCTACCGCCTCT-3′，下游引物5′-TCCGCACAAGCCTCCATAAGA-3′；ACSL1基因上游引物5′-GGAGGAAGAGTAAGGCTGATGGT-3′，下游引物5′-CCAGGAACCGACAGTGAGCAT-3′；β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，上游引物5′-GTTCTTGACTCTGGCGATGG-3′，下游引物5′-TAAGGTTTCAGGACAGCGGA-3′。預(yù)測(cè)擴(kuò)增長(zhǎng)度為130 bp左右，基因設(shè)計(jì)的引物由上海生工生物公司合成。

用實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad CFX)對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行定量PCR，PCR反應(yīng)體系為50 μL：25 μL 2×PCR Buffer，1.2 μL Primer(25 pmol/μL)，0.3 μL SYBR Green Ⅰ，1 μL模板(cDNA)，22.5 μL DEPC水，反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；循環(huán)35次，觀察擴(kuò)增曲線。

1.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用2-△△Ct法處理試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)，然后再將所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著性檢驗(yàn)用LSD法，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，同時(shí)對(duì)基因表達(dá)量與其他指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1ATGL、ACSL1基因的RT-PCR擴(kuò)增

以抽提的總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR獲得cDNA，對(duì)ATGL、ACSL1和β-actin基因進(jìn)行擴(kuò)增(圖1)。將提取的總RNA進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)在28S、18S 2條清晰的rRNA條帶，且28S條帶亮度約為18S亮度的2倍，說(shuō)明所提取的總RNA完整。

1：脂肪甘油三酯脂肪酶ATGL；2：長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶1ACSL1；3：β肌動(dòng)蛋白 β-actin。

圖1總RNA電泳圖

Fig. 1Electrophoretogram of total RNA

2.2ATGL、ACSL1基因在不同組織器官表達(dá)的差異分析

以β-actin為內(nèi)參基因，運(yùn)用RT-PCR的方法檢測(cè)鵝的肝臟、心臟、皮下脂肪、腹部脂肪、胸肌、腿肌、肌胃、腺胃、小腸、腎臟、大腦、肺、脾臟中的ATGL、ACSL1基因表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果表明，ATGL基因在皮下脂肪、腹部脂肪、肝臟、脾臟中表達(dá)量較高，在腎臟、心臟、胸肌和腿肌中有少量表達(dá)，而在肌胃、腺胃和肺中幾乎不表達(dá)；ACSL1基因在皮下脂肪、腹部脂肪、肝臟、脾臟中表達(dá)量較高，在腎臟、心臟、胸肌和腿肌中有少量表達(dá)，而在肌胃、腺胃和肺中幾乎不表達(dá)(圖2)。

M: DL2000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：肝臟；2：心臟；3：皮下脂肪；4：腹部脂肪；5：胸??；6：腿肌；7：肌胃；8：腺胃；9：小腸；10：腎臟；11：大腦；12：肺；13：脾臟。

M: DL2000 DNA maker; 1: liver; 2: heart; 3: subcutaneous fat; 4: abdominal fat; 5: breast muscle; 6: leg muscle; 7: muscular stomach; 8: glandular stomach; 9: small intestine; 10: kidney; 11: brain; 12: lung; 13: spleen.

圖2ATGL和ACSL1基因瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig. 2Agarose gel electrophoresis results ofATGLandACSL1 genes

由圖3所示，ATGL和ACSL1基因擴(kuò)增曲線走勢(shì)正常，熔解曲線都只顯示單峰且峰值單一，沒(méi)有其他雜峰，說(shuō)明引物特異性比較好，沒(méi)有引物二聚

體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，檢測(cè)體系比較穩(wěn)定，可靠性高。

圖3　ATGL和ACSL1基因的熔解曲線Fig.3　Melting curve of ATGL and ACSL1 genes

由圖4所示，ATGL及ACSL1基因的擴(kuò)增曲線的拐點(diǎn)均很清楚，基線平直，S型曲線較好。

圖4　ATGL和ACSL1基因的擴(kuò)增曲線Fig.4　Amplification curves of ATGL and ACSL1 genes

2.3ATGL、ACSL1基因在不同組織器官中的表達(dá)量

由表2可知，ATGL、ACSL1基因在不同組織器官中幾乎都有表達(dá)，尤其是在腹部脂肪和皮下脂肪中表達(dá)最高，在腎臟、心臟、胸肌和腿肌中有少量表達(dá)，而在腺胃、肌胃和肺中幾乎不表達(dá)。其中，ATGL基因在皮下脂肪的表達(dá)量分別是肌胃、腺胃和肺中的24.57、36.86和73.71倍(P<0.01)；在腹部脂肪中的表達(dá)量分別是肌胃、腺胃和肺中的17.57、26.36和52.71倍(P<0.01)。ACSL1基因在皮下脂肪的表達(dá)量分別是肌胃、腺胃和肺中的6.65、6.00和11.71倍(P<0.01)；在腹部脂肪中對(duì)表達(dá)量分別是肌胃、腺胃和肺中的18.16、16.39和32.00倍(P<0.01)。

以上結(jié)果表明，ATGL和ACSL1基因在上述組織器官中的表達(dá)存在差異性，且在腹部脂肪和皮下脂肪中的表達(dá)量最高，說(shuō)明2種基因?qū)χ境练e均有調(diào)控作用。

表2　ATGL、ACSL1基因在不同組織器官中的表達(dá)量Table 2　The ATGL and ACSL1 genes expression in different tissues and organs

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同小寫字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，相鄰小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相間小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

In the same column, values with the same small or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with adjacent small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with alternate small letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

2.4ATGL、ACSL1基因表達(dá)量與脂肪沉積和肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系

由表3和表4可知，ATGL基因表達(dá)量與腿肌肌內(nèi)脂肪率和胸肌肌內(nèi)脂肪率呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與腹部脂肪率、胸肌率和腿肌率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與皮下脂肪率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；ACSL1基因表達(dá)量與腿肌肌內(nèi)脂肪率和胸肌肌內(nèi)脂肪率呈正相關(guān)(P>0.05)，與腿肌率(P<0.05)和胸肌率(P>0.05)呈正相關(guān)，與皮下脂肪率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。腹部脂肪率僅占1.55%，并且與ATGL、ACSL1基因表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P>0.05)，充分表明了五龍鵝低脂的種質(zhì)特性。

以上結(jié)果表明，ATGL和ACSL1基因?qū)Z機(jī)體脂肪沉積和肌肉生長(zhǎng)發(fā)育呈反向調(diào)控，ATGL基因?qū)M織脂肪沉積作用影響要比ACSL1基因更為顯著。

表3　五龍鵝脂肪沉積指標(biāo)Table 3　Fat deposition indices of Wulong geese　%

表4　ATGL、ACSL1基因表達(dá)量與脂肪沉積指標(biāo)的相關(guān)分析Table 4　Correlation analysis among ATGL and ACSL1 gene expressions and fat deposition indices

*、**分別表示在0.05、0.01水平上的差異顯著。表6同。

* and ** mean significant difference at 0.05 and 0.01 levels, respectively. The same as Table 6.

2.5ATGL、ACSL1基因表達(dá)量與血清脂類代謝指標(biāo)的相關(guān)性

由表5和表6可知，ATGL基因表達(dá)量與血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和葡萄糖含量呈正相關(guān)；其中，ATGL基因表達(dá)量與甘油三酯含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。ACSL1基因表達(dá)量與血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和葡萄糖含量呈負(fù)相關(guān)；其中，ACSL1基因表達(dá)量與甘油三酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

以上結(jié)果表明，ATGL、ACSL1基因表達(dá)量與脂類代謝密切相關(guān)，尤其是與甘油三酯代謝關(guān)系更為緊密，并呈反向調(diào)控。

表5　五龍鵝血清脂類代謝指標(biāo)Table 5　Serum lipid metabolism indices of Wulong geese　mmol/L

表6　ATGL、ACSL1基因表達(dá)量與血清脂類代謝指標(biāo)的相關(guān)分析Table 6　Correlation analysis among ATGL and ACSL1 gene expressions and serum lipid metabolism indices

3討論

3.1ATGL和ACSL1基因的組織表達(dá)特異性

ATGL蛋白質(zhì)具有脂肪酶活性的GXSXG模序，在該蛋白質(zhì)的N端含有一個(gè)特殊的Patain結(jié)構(gòu)域，且在不同物種間具有高度的保守性，其在小鼠脂肪組織中表達(dá)量最高，在睪丸、心肌和骨骼肌中次之，在肝臟、脾臟、腎臟、腦和肺組織中也有低水平的表達(dá)[1]。Nie等[11-12]研究表明，ATGL基因在禽類的脂肪組織中有較高的表達(dá)。王芳[6]研究發(fā)現(xiàn)，朗德鵝ATGL基因在皮下脂肪的表達(dá)量較高，顯著高于除腦組織外的其他組織，在胃和肺中的表達(dá)量最低。Mashek等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ACSL1基因除了在棕色脂肪組織、性腺、肝臟和心臟中高表達(dá)外，還在骨骼肌和大腦中有少量表達(dá)。呂佳[9]研究結(jié)果表明，四川白鵝ACSL1基因在腹部脂肪和皮下脂肪中表達(dá)量極高，在肝臟、心臟中次之，在大腦中表達(dá)量極低。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鵝的皮下脂肪、腹部脂肪、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、胸肌和腿肌中均檢測(cè)出ATGL基因的表達(dá)，可看出在正常生理?xiàng)l件下ATGL基因廣泛在鵝的各組織器官中表達(dá)，在脂肪組織中表達(dá)量較高，與Nie等[11]的研究結(jié)果一致。ATGL基因在皮下脂肪和腹部脂肪中表達(dá)量最高，與哺乳動(dòng)物和雞、鴨[12]相似，其次是肝臟和脾臟，在腎臟、心臟、胸肌和腿肌中只有少量表達(dá)，在胃、肺和小腸中幾乎不表達(dá)，表明ATGL基因的表達(dá)在鵝的各組織器官中存在差異性，可以進(jìn)一步推測(cè)出ATGL基因在脂肪組織的表達(dá)有重要的生物學(xué)意義。但在本試驗(yàn)中脾臟中的ATGL基因的表達(dá)量處于中間水平，為在腹部脂肪中表達(dá)量的1/5，而在王芳[6]的研究中脾臟中的ATGL基因的表達(dá)量是腹部脂肪中表達(dá)量的2倍，這個(gè)結(jié)果是因個(gè)體差異或是品種差異還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，在鵝的皮下脂肪、腹部脂肪、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、胸肌和腿肌中均檢測(cè)出ACSL1基因的表達(dá)，與Mashek等[8]的研究具有一致性。在皮下脂肪、腹部脂肪、肝臟、脾臟中表達(dá)量較高，在腎臟、心臟、胸肌和腿肌中有少量表達(dá)，而在肌胃、腺胃和肺中幾乎不表達(dá)，其組織表達(dá)規(guī)律與呂佳[9]的研究類似，并且在其功能區(qū)域序列變異較小，表明該基因在功能上具有一定的保守性，顯示ACSL1基因與脂肪酸的合成代謝有密切的關(guān)系。ACSL1基因在人的HepG2細(xì)胞[13]及大鼠的肝臟[14]、心臟[15]中發(fā)生過(guò)表達(dá)之后，都會(huì)促進(jìn)脂肪酸向甘油三酯的轉(zhuǎn)化。通過(guò)免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(FATP1)基因與ACSL1基因之間存在相互作用，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取[16]。通過(guò)本試驗(yàn)中ACSL1基因的表達(dá)規(guī)律可以看出，ACSL1基因具有促進(jìn)甘油三酯的沉積與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。

3.2ATGL和ACSL1基因表達(dá)量與機(jī)體脂肪沉積指標(biāo)的相關(guān)性

屠宰性能指標(biāo)能從表觀上反映營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在不同組織及同一組織的不同部位中沉積量差異。Zimmermann等[1]研究發(fā)現(xiàn)，ATGL基因的表達(dá)與機(jī)體脂肪組織的發(fā)育密切相關(guān)。Muoio等[17]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A是生物體進(jìn)行脂類和蛋白質(zhì)合成所必需的底物，當(dāng)ACSL1被抑制后，會(huì)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)甘油三酯等含量出現(xiàn)不同程度的降低。Kim等[4]研究表明，肝臟中的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)作為激動(dòng)劑能誘導(dǎo)ACSL1基因的表達(dá)，增加相關(guān)酶的活性。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ATGL和ACSL1基因的表達(dá)量與腹部脂肪率均呈負(fù)相關(guān)，與Zimmermann等[1]的研究基本一致；由此證明了ACSL1與ATGL基因在長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成和機(jī)體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮積極作用。

Cui等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟是合成脂肪的重要器官，在生長(zhǎng)發(fā)育階段肝臟中脂肪代謝相關(guān)酶活性會(huì)明顯提高。ACSL1基因啟動(dòng)子區(qū)域含有PPAR的作用元件[19]，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與蛋白質(zhì)的合成調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)；ATGL基因則可以通過(guò)調(diào)控脂肪代謝通路中的白細(xì)胞介素、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白和解偶聯(lián)蛋白1調(diào)節(jié)胰島素的分泌和敏感性，促進(jìn)脂肪分解[20]，減少脂肪細(xì)胞的數(shù)量，使肌肉中脂肪增加的速度低于肌肉生長(zhǎng)的速度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，ATGL基因的表達(dá)量與胸肌肌內(nèi)脂肪率、腿肌肌內(nèi)脂肪率呈極顯著負(fù)相關(guān)，ACSL1基因與胸肌肌內(nèi)脂肪率、腿肌肌內(nèi)脂肪率呈正相關(guān)，表明這2個(gè)基因?qū)?nèi)脂肪率呈反向調(diào)控，ATGL基因?qū)π丶『屯燃〉闹韭收{(diào)控作用更加顯著，肌內(nèi)脂肪的主要成分為磷脂和甘油三酯，ATGL是甘油三酯水解的限速酶，有助于防止胸肌和腿肌中脂肪的過(guò)度沉積，減少肥胖及相關(guān)病癥的發(fā)生。本試驗(yàn)選擇的試驗(yàn)動(dòng)物五龍鵝，腹部脂肪含量較低，脂肪沉積速度較慢，原因可能是由于ATGL、ACSL1基因通過(guò)影響肝臟中脂肪代謝相關(guān)酶活性調(diào)控肌肉中脂肪細(xì)胞發(fā)育實(shí)現(xiàn)的，其調(diào)控機(jī)理還有待于繼續(xù)研究。

尹靖東等[21]認(rèn)為，鵝腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量比胸肌高，其原因與不同的部位脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、ACSL1的活性及微小血管組織的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，五龍鵝腿肌肌內(nèi)脂肪率同樣高于胸肌肌內(nèi)脂肪率，組織表達(dá)中也證實(shí)ACSL1基因在2個(gè)器官中均有表達(dá)，表明ACSL1基因?qū)?nèi)脂肪代謝起重要調(diào)控作用。

3.3ATGL和ACSL1基因表達(dá)量與血清脂類代謝指標(biāo)的相關(guān)性

家禽脂肪的發(fā)育和沉積主要受血清中甘油三酯的含量影響[22]。聞治國(guó)等[23]在對(duì)北京鴨的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)高密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的分泌速度低于甘油三酯的合成速度時(shí)，脂肪在肝臟大量沉積，血液中甘油三酯含量顯著升高。Zechner等[25]研究證實(shí)，ATGL催化機(jī)體整個(gè)脂解過(guò)程中的第一步，也是脂解限速的關(guān)鍵一步。在哺乳動(dòng)物中ACSL1基因主要表達(dá)于脂肪組織和肝臟，定位于細(xì)胞內(nèi)膜，與甘油三酯的合成和脂肪酸的攝取有關(guān)[26]。ATGL參與水解甘油三酯的第1步反應(yīng)，生成甘油二酯和游離脂肪酸[27]；ACSL1能夠以長(zhǎng)鏈脂肪酸(C12～C22)、ATP和CoA作為底物，生成相應(yīng)長(zhǎng)鏈脂酰CoA酯[28]，脂酰輔酶A酯又是體內(nèi)合成甘油三酯的重要底物。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ATGL基因表達(dá)量與甘油三酯含量呈極顯著正相關(guān)，ACSL1基因表達(dá)量與甘油三酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)；這表明在五龍鵝脂肪代謝過(guò)程中，ATGL和ACSL1基因?qū)Υ龠M(jìn)脂質(zhì)合成和脂肪酸的運(yùn)轉(zhuǎn)都發(fā)揮了積極的作用，并且這2個(gè)基因?qū)χ惔x呈反向調(diào)控作用。

葡萄糖是機(jī)體積累和轉(zhuǎn)化能量的主要方式，李金鋒[24]在肉種雞后代脂肪代謝研究結(jié)果表明，葡萄糖是動(dòng)物機(jī)體的主要功能物質(zhì)，是機(jī)體內(nèi)脂肪合成的前體，血清葡萄糖含量受到機(jī)體脂肪代謝程度的影響。肝臟為調(diào)節(jié)糖代謝的樞紐[29]，ATGL和ACSL1基因參與肝臟內(nèi)糖和脂肪代謝，調(diào)控甘油三酯及相關(guān)蛋白質(zhì)合成與分解[30]，釋放甘油和游離脂肪酸，參與三羧酸循環(huán)過(guò)程而影響葡萄糖含量，也可以通過(guò)對(duì)胰島素分泌的抑制，有效的減少脂肪的生成和積蓄，促進(jìn)能量消耗，維護(hù)機(jī)體的正常生理功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，ATGL基因表達(dá)量與葡萄糖的含量呈正相關(guān)，ACSL1基因與之呈負(fù)相關(guān)，這表明這2個(gè)基因?qū)ζ咸烟谴x也呈反向調(diào)控。而王海威等[31]在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖的含量與體內(nèi)脂類代謝基因無(wú)顯著相關(guān)性，其原因是與物種有關(guān)還是由于試驗(yàn)誤差造成的還有待于繼續(xù)研究。

4結(jié)論

①ATGL和ACSL1基因在五龍鵝不同組織器官中表達(dá)具有明顯差異性，尤其是在腹部脂肪和皮下脂肪中表達(dá)最高，表明這2個(gè)基因的表達(dá)均對(duì)脂肪沉積有調(diào)控作用。

②ATGL基因表達(dá)量與腿肌肌內(nèi)脂肪率、胸肌肌內(nèi)脂肪率、胸肌率和腿肌率呈負(fù)相關(guān)，與皮下脂肪率呈顯著正相關(guān)；ACSL1基因表達(dá)量與腿肌肌內(nèi)脂肪率、胸肌肌內(nèi)脂肪率、胸肌率和腿肌率呈正相關(guān)，與皮下脂肪率呈顯著負(fù)相關(guān)。

③ATGL基因表達(dá)量與血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和葡萄糖含量呈正相關(guān)；ACSL1基因表達(dá)量與血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和葡萄糖含量呈負(fù)相關(guān)；尤其是與甘油三酯代謝關(guān)系更為緊密。

④ATGL、ACSL1基因表達(dá)量對(duì)鵝脂肪沉積和血清脂類代謝具有反向調(diào)控作用。

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Author, WANG Baowei, professor, E-mail: wangbw@qau.edu.cn

(責(zé)任編輯武海龍)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.012

收稿日期：2016-01-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)基金(CARS-43-11)；山東省良種工程(2014LZ19)

作者簡(jiǎn)介：王寶維(1959—)，男，山東榮成人，教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與保健。E-mail: wangbw@qau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S835

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)07-2079-11

Differential Expression of Adipose Triglyceride Lipase and Long-Chain Acyl-CoA-Synthetase 1 Genes and Their Regulation of Fat Deposition and Serum Lipid Metabolism of Geese

WANG Baowei1,2KONG Min1,2GE Wenhua1ZHANG Ming’ai1MA Chuanxing1,2ZHANG Xiao1,2

(1.Nutrition and Feed Laboratory of China Agriculture Research System, Institute of High Quality Waterfowl,Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

Abstract:This experiment was conducted to study the difference of adipose triglyceride lipase (ATGL) gene and long-chain acyl-CoA-synthetase 1 (ACSL1) genes expression in different tissues and organs of geese, and to explore the expression of two genes on body fat deposition and serum lipid metabolism regulation. Selected thirty 16-week-old Wulong Geese (half male and half female), and the ATGL and ACSL1 gene expressions in different tissues and organs (liver, heart, subcutaneous fat, abdominal fat, breast muscle, leg muscle, muscular stomach, glandular stomach, small intestine, kidney, brain, lung, spleen) were detected by real-time quantitative PCR after slaughter. The results showed as follows: 1) The expressions of ATGL and ACSL1 genes were detected in subcutaneous fat, abdominal fat, liver, spleen, kidney, heart, breast muscle and leg muscle of geese; ATGL gene expression in subcutaneous fat and abdominal fat relative was the highest, followed by that in the liver and spleen, in kidney, heart, breast muscle and leg muscle only a few of expression. ACSL1 gene expression in subcutaneous fat, abdominal fat, liver and spleen was the highest, and slightly expressed in kidney, heart, breast muscle and leg muscle, and almost no expression in muscular stomach, glandular stomach and lung. 2) ATGL gene expression showed a significant negative correlation with intramuscular fat (IMF) percentage in leg muscle, IMF percentage in breast muscle, percentage of abdominal fat, percentage of leg muscle and percentage of breast muscle (P<0.05 or P<0.01), and was significant positively correlated with percentage of subcutaneous fat (P<0.05); ACSL1 gene expression was positively related with IMF percentage in leg muscle, IMF percentage in breast muscle and percentage of breast muscle (P>0.05), and was significantly positively correlated with percentage of leg muscle (P<0.05), while it showed a significant negative correlation with percentage of subcutaneous fat (P<0.05). 3) The ATGL gene expression was significantly positively correlated with the contents of total cholesterol (TCH), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and glucose (GLU) in serum (P<0.05 or P<0.01); the ACSL1 gene expression was negatively correlated with the content of TCH, HDL-C, LDL-C and GLU in serum(P>0.05), and it were significantly negatively correlated with the triglyceride content. In conclusion, the expressions of ATGL and ACSL1 genes in different tissues and organs of geese have obvious differences, which have a negative regulation on fat deposition and serum lipid metabolism.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2079-2089]

Key words:geese; ATGL gene; ACSL1 gene; tissues and organs; gene expression; gene regulation