電針迎香穴對大鼠嗅覺功能和嗅黏膜成纖維生長因子的干預效應研究

楊曉航，牛文民，王　　淵，劉思洋，朱先偉，王　　強，王衛(wèi)剛，劉智斌（.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽　7046；.西安醫(yī)學院，陜西 西安　700；.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽　7000）

電針迎香穴對大鼠嗅覺功能和嗅黏膜成纖維生長因子的干預效應研究

楊曉航1，牛文民1，王淵1，劉思洋2，朱先偉1，王強1，王衛(wèi)剛3，劉智斌1
（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽712046；2.西安醫(yī)學院，陜西 西安710021；3.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽712000）

［目的］探討電針迎香穴對大鼠嗅覺功能和嗅黏膜成纖維生長因子（FGFs）的干預效應和作用通路。［方法］將50只SD大鼠隨機分為正常對照組、嗅覺功能障礙組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組、嗅覺功能障礙+針刺組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組5組，每組10只。采用Triton X-100鼻腔注射法復制大鼠嗅覺功能障礙動物模型和大鼠嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷動物模型。通過電針迎香穴干預后，分析各組大鼠埋藏食物小球?qū)嶒?、嗅覺迷宮實驗結(jié)果及ELISA法檢測的FGFs含量。［結(jié)果］埋藏食物小球?qū)嶒灱靶嵊X迷宮實驗結(jié)果表明電針迎香穴可以顯著縮短嗅覺功能障礙模型大鼠尋找食物小球的時間（P＜0.01），并且電針迎香穴干預后模型大鼠嗅黏膜組織中FGFs含量明顯升高（P＜0.01）。［結(jié)論］電針迎香穴可顯著提高嗅覺功能障礙模型大鼠嗅黏膜組織中FGFs含量，其作用與三叉神經(jīng)通路的完整性有關(guān)。

電針；迎香穴；嗅覺功能障礙；成纖維生長因子

嗅覺在人類的行為、情感等各種生理及心理狀態(tài)中均發(fā)揮著重要作用。嗅覺功能障礙可直接導致患者認知障礙、生存質(zhì)量下降，例如由于嗅覺功能障礙直接導致味覺異常，進而引起營養(yǎng)失調(diào)和體質(zhì)衰退等。臨床中嗅覺功能障礙自報患病率為15.3%，實際患病率可能更高［1-4］。針刺迎香穴廣泛應用于臨床治療嗅覺功能障礙［5-8］。迎香穴最早見于《針灸甲乙經(jīng)》，另名沖陽，屬手陽明大腸經(jīng)，手、足陽明之會，位于鼻翼外緣中點旁，當鼻唇溝中；主治鼻塞、鼻衄、鼻淵、鼻息肉、口眼斜、面癢浮腫及膽道蛔蟲癥等?！夺樈?jīng)指南》云“鼻室無聞，迎香可引”；《扁鵲神應針灸玉龍經(jīng)》云“不聞香臭從何治，須向迎香穴內(nèi)攻”，其中所謂“不聞香臭”即現(xiàn)代醫(yī)學的嗅覺功能障礙（包括嗅覺減退和喪失）。在本研究中，筆者以嗅覺功能障礙模型Sprague-Dawley（SD）大鼠為研究對象，通過對電針迎香穴干預前及干預2周后5組大鼠間嗅覺行為學、成纖維生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）含量等指標進行比較，為闡明電針迎香穴治療嗅覺功能障礙的效應和作用通路提供實驗依據(jù)。

1　　實驗對象與方法

1.1實驗動物SD大鼠，約250 g，雄性。置于可控的SPF級環(huán)境條件下，室溫保持在21±3°C，光/暗周期為13/11 h，燈光于早晨6時切換，自由飲水采食。所有的實驗均獲得陜西中醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準，并嚴格遵守陜西省實驗動物管理辦法。

1.2器材和試劑Morris水迷宮實驗系統(tǒng)（北京現(xiàn)代太極電子有限公司）；Multiskan MK3全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）。Rat glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）ELISA KIT（武漢巴菲爾生物技術(shù)有限公司）。

1.3方法

1.3.1動物分組將50只SD大鼠隨機分為正常對照組、嗅覺功能障礙組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組、嗅覺功能障礙+針刺組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組等5組，每組10只。

1.3.2嗅覺障礙模型制作參照秦照萍等［9］和Cummings的方法［10］，將大鼠用0.3%戊巴比妥鈉麻醉后，用微量注射器（注射器針頭磨鈍）對雙側(cè)鼻孔一次性灌注100μl0.7%Triton X-100（PBS配制），灌流時間為1min。

1.3.3眶下神經(jīng)切斷模型常規(guī)消毒大鼠兩側(cè)眶下皮膚區(qū)域，沿兩側(cè)眶下緣做一水平切口，長約0.5 cm，鈍性分離皮下脂肪，暴露眶下孔，仔細分離眶下神經(jīng)及其同名動靜脈，避開血管，切斷眶下神經(jīng)。

1.3.4電針方法迎香穴定位：大鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無毛交界處。電針方法：迎香穴向內(nèi)上方斜刺0.3 cm，電針參數(shù)：1 mA，疏密波；正極和負極各接一側(cè)迎香穴，刺激時間10 m in，1次/日。以上電針處理均在造模成功后第1天進行。5天為1個療程，療程間休息2天，共進行2個療程。未行電針治療組常規(guī)飼養(yǎng)至電針療程結(jié)束［11-12］。

1.3.5埋藏食物小球?qū)嶒灢捎么笮∫恢碌男迈r鼠料（0.5 g），以減少外源性食物味道的干擾。測試前3 d限制大鼠進食，每只給予鼠料0.2 g/d，自由飲水；同時這3 d內(nèi)將單只大鼠分別置入測試時采用的鼠籠（45 cm×24 cm×20 cm）中熟悉10min。測試前將0.5 g的食物小球埋藏在鼠料表面以下5 cm處并隨機更換置放食物小球的位置，記錄大鼠進入鼠籠內(nèi)開始到大鼠用前爪抓住食物小球并啃噬的時間，等大鼠吃完食物后再將其放回籠中。休息4 h后，將食物小球隨機置放在鼠料表面不同位置，重復實驗作為對照。所有實驗以300 s（5次測試的平均值）內(nèi)未找到食物小球的大鼠即定為嗅覺喪失。

1.3.6嗅覺迷宮實驗參考文獻［13-14］方法改良自制圓形迷宮，其中等分為6個小格，將測試用的新鮮鼠料（0.5 g）隨機放置在大鼠不能直接看見的小格后面而僅靠其嗅覺才能找到。實驗時，大鼠首先被放置在迷宮的中間，記錄大鼠進入迷宮內(nèi)到用前爪抓住食物小球并啃噬的時間。等大鼠吃完食物后再將其放回籠中，并取出食物殘渣和大鼠的排泄物，用70%的乙醇和水清潔迷宮防止對后面測試的干擾。陽性對照是將食物小球放置于小格之外，大鼠能夠直接看見的部位。所有實驗以300 s（5次測試的平均值）內(nèi)未找到食物小球的大鼠即定為嗅覺喪失。

1.3.7酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測2個療程結(jié)束后，常規(guī)碘伏消毒局部皮膚，2%戊巴比妥鈉深度麻醉（100 mg/kg）后，取口腔入路斷頸去額部皮膚、肌肉及下頜骨后，將頭顱取下。用血管鉗將一側(cè)鼻腔完全打開，于鼻腔后上的顱底部，可見鼻中隔最后上部的嗅區(qū)呈黃色，與呼吸道黏膜有較明顯的區(qū)別。將此嗅區(qū)鼻中隔（嗅黏膜和骨質(zhì)）完整取下，在顯微鏡下將兩側(cè)的嗅黏膜自骨片上完整刮下。將組織切成碎片并用特定比例的PBS勻漿（每10mg組織對應100μl PBS）。將勻漿液用超聲波進一步進行處理來破壞細胞膜。之后，將勻漿液1 500×g離心15 min，取上清并存儲在-80°C超低溫冰箱。按照ELISA試劑盒說明書操作對組織中FGFs含量進行分析。

2　結(jié)果

2.1行為學實驗結(jié)果各組大鼠在埋藏食物小球?qū)嶒?、嗅覺迷宮實驗中尋找食物小球的時間比較見表1。在兩項行為學實驗中，與正常對照組比較，嗅覺功能障礙組與嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組大鼠尋找食物小球的時間均超過300 s，有極顯著性差異（P＜0.01），可以判斷為嗅覺喪失。嗅覺功能障礙模型大鼠經(jīng)過針刺干預后，與嗅覺功能障礙組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）。嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組大鼠尋找食物小球所用時間依然均超過300 s。

表1　　各組大鼠尋找食物小球的時間比較 （s，±s）

表1　　各組大鼠尋找食物小球的時間比較 （s，±s）

注：與正常對照組比較，①P＜0.01；與嗅覺功能障礙組比較，②P＜0.01

組　別　n　埋藏食物小球?qū)嶒炐嵊X迷宮實驗正常對照組　10　38.2±3.4　52.2±4.8嗅覺功能障礙組　10　　＞300①　?。?00①嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組　10　?。?00①　?。?00①嗅覺功能障礙+針刺組　10　44.5±5.2②　68.4±4.2②嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組　10　?。?00　　＞300

2.2各組FGFs含量結(jié)果見圖1。與正常對照組比較，嗅覺功能障礙組與嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組中大鼠組織中FGFs含量升高，有顯著性差異（P＜0.05）；與嗅覺功能障礙組比較，針刺迎香穴治療后的嗅覺功能障礙+針刺組大鼠組織中FGFs含量升高，有極顯著性差異（P＜0.01），而嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+針刺組大鼠組織中FGFs含量沒有顯著性差異。

圖1　　各組FGFs含量相對濃度比比較

3　討論

本研究中埋藏食物小球和嗅覺迷宮兩項行為學實驗結(jié)果均表明，模型組大鼠尋找食物小球時間超過300 s，證實經(jīng)0.7%Triton X-100的PBS溶液鼻腔灌流的SD大鼠可以成功復制嗅覺功能障礙模型。單純嗅覺功能障礙模型大鼠經(jīng)過電針迎香穴干預后，與模型組比較尋找食物小球時間顯著縮短，說明電針迎香穴有助于嗅黏膜化學損傷后嗅覺功能的恢復。同時電針迎香穴在模型大鼠行眶下神經(jīng)切斷術(shù)后，其改善嗅覺功能障礙的效應消失。神經(jīng)解剖學研究表明：迎香穴位于三叉神經(jīng)上頜支的眶下神經(jīng)分布區(qū)域，因此眶下神經(jīng)是迎香穴的感覺傳入神經(jīng)。而三叉神經(jīng)的眼支分出鼻睫神經(jīng)分布于鼻腔黏膜，包含嗅上皮區(qū)域，由此形成鼻腔內(nèi)嗅覺神經(jīng)與三叉神經(jīng)重疊分布模式。大量研究已表明，嗅覺的產(chǎn)生是嗅覺神經(jīng)和三叉神經(jīng)兩大系統(tǒng)協(xié)同作用的結(jié)果［15-17］。在中樞和外周的嗅覺信息的處理中，兩個系統(tǒng)可以相互影響，三叉神經(jīng)的刺激能反射性地影響心血管反應、呼吸速率、鼻腫脹、鼻分泌和噴嚏［18-21］，有學者發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)可能經(jīng)局部軸突反射合并P物質(zhì)（SP）的釋放參與調(diào)制嗅黏膜上皮嗅受體細胞的活動，從而影響嗅覺功能，調(diào)節(jié)嗅覺系統(tǒng)對氣味分子的反應［22-23］。因此，可以推測三叉神經(jīng)-眶下神經(jīng)通路的完整性與電針迎香穴干預嗅覺功能障礙的效應密切相關(guān)。

嗅感神經(jīng)元（Olfactory Receptorneurons，ORN）是體內(nèi)已明確的唯一具備持續(xù)再生能力的神經(jīng)元［16］。FGFs是調(diào)節(jié)ORN再生的主要細胞因子，其在嗅黏膜的表達促進ORN前體神經(jīng)元的增殖和分化。本次研究結(jié)果表明，電針迎香穴可顯著提高模型大鼠嗅黏膜組織中FGFs含量，且該效應同樣依賴于三叉神經(jīng)-眶下神經(jīng)通路的完整性。

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（編輯熊瑜）

R254.9

A

2095-4441（2016）02－0005－03

2016-04-02

國家自然科學基金（編號：81273859）；陜西省教育廳專項科學研究項目（編號：11JK0679）

劉智斌，博士，教授，研究方向：針灸推拿治療脊柱疾病和老年病的基礎(chǔ)與臨床研究