富血小板血漿對(duì)大鼠海綿體神經(jīng)損傷的修復(fù)效應(yīng)

丁協(xié)剛，李世文，鄭新民，胡萬(wàn)里，羅　儀，王行環(huán)

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科, 湖北 武漢　430071)

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·基礎(chǔ)研究·

富血小板血漿對(duì)大鼠海綿體神經(jīng)損傷的修復(fù)效應(yīng)

丁協(xié)剛，李世文，鄭新民，胡萬(wàn)里，羅儀，王行環(huán)

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科, 湖北 武漢430071)

摘要：目的探討富血小板血漿對(duì)大鼠海綿體神經(jīng)損傷的修復(fù)效應(yīng)。方法24只SD雄性大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、雙側(cè)海綿體神經(jīng)鉗夾損傷組及損傷后富血小板血漿治療組,術(shù)后3個(gè)月通過(guò)電刺激觀察海綿體內(nèi)壓的變化來(lái)反映其勃起功能,隨后取海綿體神經(jīng)干進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色觀察有髓鞘軸突的數(shù)目變化及陰莖組織行煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)染色檢測(cè)一氧化氮合酶(NOS)陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)目來(lái)反映神經(jīng)再生情況。結(jié)果術(shù)后3個(gè)月,損傷組最大海綿體內(nèi)壓為(32.7±12.2)cmH2O,明顯低于假手術(shù)組(108.9±12.8)cmH2O(P<0.01);而富血小板血漿治療組為(83.1±12.9)cmH2O,明顯高于損傷組(P<0.01)。甲苯胺藍(lán)染色損傷組的有髓鞘軸突個(gè)數(shù)為(60.3±14.5)個(gè)，明顯低于假手術(shù)組(180.9±20.7)個(gè)，(P<0.01)，而富血小板血漿治療組為(114.9±23.9)個(gè)，明顯高于損傷組(P<0.01)。陰莖背神經(jīng)NOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)目，治療組為(151.8±20.3)個(gè)與假手術(shù)組(285.6±57.3)個(gè)和損傷組(77.5±16.6)個(gè)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論局部應(yīng)用富血小板血漿能明顯促進(jìn)受損海綿體神經(jīng)的神經(jīng)修復(fù)和勃起功能的恢復(fù)。

關(guān)鍵詞:富血小板血漿；海綿體神經(jīng)； 勃起功能障礙

富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)是通過(guò)離心全血而得到的血小板濃縮物?；谘“寮せ顣r(shí)可釋放多種生長(zhǎng)因子這一特性，國(guó)內(nèi)外大量的文獻(xiàn)報(bào)道PRP在細(xì)胞水平和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和臨床應(yīng)用方面對(duì)骨組織修復(fù)有促進(jìn)作用[1～3]。但關(guān)于其對(duì)外周神經(jīng)的修復(fù)作用，報(bào)道相對(duì)較少[4～6]，我們就其對(duì)陰莖海綿體神經(jīng)(cavernous nerve,CN)損傷的修復(fù)效應(yīng)進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物和試劑SD雄性大鼠30只(購(gòu)于武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，3月齡，體重250～300 g，經(jīng)性交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)均有正常性功能。手術(shù)顯微鏡(SXP-1B型，上海醫(yī)用儀器廠)。生理記錄儀(BL420-E，成都泰盟)。凝血酶(1 000 U/mL，Sigma公司)。硝基四氮唑藍(lán)(NBT,Sigma 公司),β-NADPH(Sigma,type Ⅰ)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組選取24只大鼠隨機(jī)分成3組，即假手術(shù)組、海綿體神經(jīng)損傷組、損傷后局部應(yīng)用PRP組，每組8只。

1.2.2PRP的準(zhǔn)備6只SD成年雄性大鼠，體重250～300 g，2%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔麻醉后在無(wú)菌條件下經(jīng)心臟采血后注入抗凝的試管，立即行兩次離心得到PRP，22 ℃保存。術(shù)中局部應(yīng)用前每200 μLPRP加入20 μL的CaCl2(100 mg/mL)和凝血酶(1 000 U/mL)的混合物，使其激活成凝膠狀，即可局部應(yīng)用。

1.2.3手術(shù)方法20 g/L戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔麻醉后，取下腹正中切口，延長(zhǎng)至陰莖根部，在手術(shù)顯微鏡下于兩側(cè)前列腺背外側(cè)找到盆神經(jīng)節(jié)及海綿體神經(jīng)(cavernous nerve,CN)，假手術(shù)組僅游離海綿體神經(jīng)而避免損傷；損傷組參照HEISH[7]的方法用顯微血管夾嵌夾海綿體神經(jīng)2 min，制作擠壓損傷模型；PRP應(yīng)用組在造成損傷后立即在損傷的局部應(yīng)用術(shù)中激活的PRP每側(cè)200 μL。

1.2.4陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定術(shù)后3個(gè)月，各組大鼠再次20 g/L戊巴比妥(40 mg/kg)經(jīng)腹注射麻醉，找到CN，用連接有電刺激儀的雙極電極勾住CN；然后在下腹正中線與陰莖體背側(cè)交點(diǎn)始至龜頭下水平旁開(kāi)中線約1 cm處作一約1.5 cm的斜形切口，分離陰莖體后用無(wú)損傷的血管夾鉗夾陰莖體，鈍性分離陰莖根部，從陰莖腳處切斷坐骨海綿體肌，暴露陰莖海綿體白膜，在陰莖腳處插入1只23號(hào)蝶型針頭，通過(guò)PE-50硅膠管與生理記錄儀的壓力傳感器相連。插入前針頭及導(dǎo)管內(nèi)吸入無(wú)菌的肝素溶液(250 U/mL)，防止血液凝固堵塞針頭和導(dǎo)管。刺激參數(shù)設(shè)置為1.5 mA、20 Hz、0.2 ms脈沖的電流持續(xù)刺激CN 50 s，記錄陰莖海綿體內(nèi)壓(intracavernous pressure, ICP)的變化。

1.2.5海綿體神經(jīng)的甲苯胺藍(lán)染色壓力測(cè)定完成后，立即取嵌夾處以遠(yuǎn)3 mm的CN干置于20 g/L的戊二醛中前固定，20 g/L的餓酸后固定，逐級(jí)乙醇脫水, Epon 定向包埋, 中點(diǎn)半薄橫切片1 μm厚，經(jīng)1% 甲苯胺藍(lán)染色在Olympus-DP12顯微鏡下通過(guò)油鏡(×1 000)觀察整個(gè)橫切面有髓鞘軸突的個(gè)數(shù)。

1.2.6大鼠陰莖組織煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)染色CN取出后，立即取陰莖中段組織，置于新鮮配置的冷固定液中，4 h后將組織移入新鮮配置含30%蔗糖的冷PBS溶液中浸至沉底，OCT包埋。行冰凍切片厚8 μm，反應(yīng)前空氣中干燥5 min；后移入孵育液[0. 1 mol/ L PBS(pH 8. 0)中含0. 2 %Triton-x 100,0. 8 g/ L 硝基四氮唑藍(lán),1 g/ Lβ-NADPH中,37 ℃溫箱中孵育3～4 h，用0. 01 mol/ L PBS(pH7.4) 終止反應(yīng)并漂洗數(shù)次,后予梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。Olympus BH2 顯微鏡放大400倍下觀察雙側(cè)陰莖背神經(jīng)中NADPH陽(yáng)性染色神經(jīng)纖維的數(shù)目。

2結(jié)果

2.1陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定結(jié)果損傷組最大海綿體內(nèi)壓為(32.73±12.21)cmH2O,明顯低于假手術(shù)組(108.87±12.84)cmH2O(P<0.01);而富血小板血漿治療組為(83.11±12.89)cmH2O,明顯高于損傷組(P<0.01)。

2.2甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果損傷組(圖1A)的有髓鞘軸突為(60.3±14.5)個(gè)，明顯低于假手術(shù)組(圖1B) (180.9±20.7)個(gè)，(P<0.01)，且明顯發(fā)生軸突萎縮變小、間質(zhì)增生的變化；而富血小板血漿治療組(圖1C)有髓鞘軸突為(114.9±23.9)個(gè)，明顯高于損傷組(P<0.01)，但仍低于假手術(shù)組(P<0.01)，組織形態(tài)上明顯部分恢復(fù)。

圖1各組海綿體神經(jīng)干甲苯胺藍(lán)染色(×1 000)

A：損傷組；B：假手術(shù)組；C：富血小板血漿治療組

2.3陰莖組織NADPH染色結(jié)果光鏡下CN損傷組陰莖背神經(jīng)中NOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維明顯變少(圖2A);假手術(shù)組大鼠陰莖背神經(jīng)中有大量一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)纖維(圖2B)；富血小板血漿治療組NOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維明顯多于損傷組(圖2C)。損傷組、假手術(shù)組、富血小板血漿治療組陽(yáng)性纖維計(jì)數(shù)分別為77.5±16.6、285.6±57.3、151.8±20.3。富血小板血漿治療組與損傷組和假手術(shù)組相比，均有顯著性差異(P<0.05)。

圖2各組陰莖組織NADPH染色結(jié)果(×400)

A：損傷組；B：假手術(shù)組；C：富血小板血漿治療組。

3討論

在前列腺癌根治術(shù)或盆腔其他手術(shù)的操作過(guò)程中，常因不慎導(dǎo)致CN的各種損傷：如切斷、撕裂、牽拉等[8]，所以術(shù)后勃起功能的恢復(fù)很大程度上依賴(lài)于殘存神經(jīng)的再生修復(fù)狀況。

神經(jīng)損傷后的自身修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)外周神經(jīng)的生長(zhǎng)需要各種因子。JUNG[9]等發(fā)現(xiàn)單側(cè)CN損傷的大鼠6個(gè)月后隨著陰莖含一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)神經(jīng)纖維的增多和勃起功能的改善，陰莖內(nèi)多種促神經(jīng)生長(zhǎng)因子只有胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)的表達(dá)顯著增加，提示IGF-Ⅰ 、TGF-β2在CN的再生中起重要作用。HEISH等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)陰莖海綿體注射腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)有助于損傷的CN的恢復(fù)。后續(xù)有BELLA等[10]報(bào)導(dǎo)在CN損傷局部使用一種膠質(zhì)細(xì)胞系的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Neurturin可促進(jìn)其功能的恢復(fù)。HANNAN等[11]通過(guò)離體組織培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)BDNF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)、膠質(zhì)細(xì)胞起源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)對(duì)CN再生起重要作用。因此有理由相信，神經(jīng)的修復(fù)是一個(gè)多因子參與的過(guò)程，而且這些因子不僅單獨(dú)起作用，另可有協(xié)同作用。

PRP是通過(guò)離心全血而得到的血小板濃縮物。血小板激活時(shí)，可釋放多種生長(zhǎng)因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等[12]。這些生長(zhǎng)因子在PRP中的濃度很高，約為體內(nèi)正常濃度的3～17倍，它們對(duì)細(xì)胞的增殖、基質(zhì)合成及血管再生起著重要作用。結(jié)合PRP這一特性及CN損傷修復(fù)過(guò)程需要多因子的參與，因此我們有理由相信，PRP對(duì)CN損傷的修復(fù)有促進(jìn)作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)嵌夾CN制作神經(jīng)性ED，并在損傷的局部應(yīng)用激活的PRP；術(shù)后3個(gè)月，通過(guò)測(cè)定最大海綿體內(nèi)壓的變化，反映其勃起功能的恢復(fù)情況；甲苯胺藍(lán)染色來(lái)直接觀察起受損CN干組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)狀態(tài)；另一方面通過(guò)陰莖背神經(jīng)NADPH染色來(lái)反映遠(yuǎn)端神經(jīng)再生的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損傷組ICP的變化明顯降低，且CN干橫切面有髓鞘軸突和陰莖背神經(jīng)中NOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維出現(xiàn)明顯萎縮和減少；應(yīng)用PRP組，雖與假手術(shù)相比恢復(fù)情況還有一段距離，但與損傷組相比ICP的變化和CN干有髓鞘軸軸突的個(gè)數(shù)和陰莖背神經(jīng)中NOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)目均得到了明顯恢復(fù)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn)，PRP對(duì)CN損傷的修復(fù)有明顯促進(jìn)作用。這與我們實(shí)驗(yàn)前的推斷是相吻合的。一方面，在損傷的局部應(yīng)用激活的成凝膠狀的PRP可以覆蓋傷口，另一方面在局部能夠釋放各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子，它們可以單獨(dú)或協(xié)同對(duì)殘存的神經(jīng)元進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和支持作用，促進(jìn)軸突的再生，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。

綜上所述，富血小板血漿(PRP)能明顯促進(jìn)受損海綿體神經(jīng)(CN)的神經(jīng)再生和其勃起功能的恢復(fù)。但PRP與其他單一因子對(duì)CN的修復(fù)效應(yīng)的差別有待在后續(xù)研究中進(jìn)一步論證。

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(編輯王瑋)

收稿日期：2015-05-14修回日期：2015-07-02

通訊作者:李世文，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師.E-mail:drlishiwen@sina.com

作者簡(jiǎn)介:丁協(xié)剛(1980-)，男(漢族)，博士，主治醫(yī)師，主要從事泌尿外科及男科的基礎(chǔ)與臨床研究. E-mail:dxg1014@aliyun.com

中圖分類(lèi)號(hào):R698

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.01.016

The therapeutic effect of platelet rich plasma in a rat model of cavernous nerve injury

DING Xie-gang, LI Shi-wen, ZHENG Xin-min, HU Wan-li, LUO Yi, WANG Xing-huan

(Department of Urology,Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of platelet rich plasma (PRP) on the recovery in a rat model of cavernous nerve injury. MethodsA total of 24 Sprague-Dawley male adult rats were equally randomized into 3 groups, receiving sham operation, bilateral cavernous nerve crushing with no further intervention, and bilateral cavernous nerve crushing with an immediate application of PRP to the site of cavernous nerve crush injury, respectively. Erectile function was assessed by cavernosal nerve electrostimulation after 3 months and nerve regeneration was assessed by toluidine blue staining of CN and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)-diaphorase staining of penile tissue. ResultsThe mean maximal intracavernous pressure (ICP) in the PRP treated group (83.1±12.9)cmH2O was significantly higher than in injured control group (32.7±12.2, P<0.01), but lower than in sham group (108.9±12.8, P<0.01). The PRP treated group had more myelinated axons of CNs (114.9±23.9) than the injured control group (60.3±14.5, P<0.01), but fewer than the sham group (180.9±20.7, P<0.01). Furthermore, the PRP treated group had more NOS diaphorase positive nerve (151.8±20.3) than the injured control group (77.5±16.6, P<0.05), but fewer than the sham group (285.6±57.3, P<0.05). Conclusion The application of PRP to the site of CN-crush injury facilitates nerve regeneration and recovery of erectile function.

KEY WORDS:platelet rich plasma; cavernous nerve; erectile dysfunction