酢漿草藥材薄層鑒別方法研究

敖　嬌　劉建軍　鮑家科

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州　貴陽　550002；2.貴州省藥品審評認(rèn)證中心，貴州　貴陽　550004

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酢漿草藥材薄層鑒別方法研究

敖嬌1劉建軍1鮑家科2*

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002；2.貴州省藥品審評認(rèn)證中心，貴州貴陽550004

【摘要】目的：建立酢漿草藥材的薄層鑒別方法。方法：以酢漿草對照藥材、β-谷甾醇為對照品，對影響薄層色譜的各個(gè)因素進(jìn)行考察，篩選出最佳的薄層色譜條件。結(jié)果：篩選出酢漿草薄層鑒別的最佳條件，確定了實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)論：建立了酢漿草藥材的薄層鑒別方法，具有斑點(diǎn)清晰、分離度良好、操作簡便、方法重復(fù)性好的特點(diǎn)，為進(jìn)一步完善酢漿草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】酢漿草；薄層鑒別；方法

酢漿草為酢漿草科植物酢漿草OxaliscorniculataL.的全草,也稱酸漿草、酸草、三葉酸、酸咪咪等, 為貴州等地民間及少數(shù)民族習(xí)用藥材。酢漿草性味功效為酸、涼,具有清熱解毒、利濕消腫、清肺化痰的功效,臨床用于治療神經(jīng)衰弱、失眠、肺炎、扁桃體炎、急性肝炎、小兒上呼吸道感染等多種疾病[1]。酢漿草的化學(xué)成分主要有總黃酮類[2]、羥基肉桂酸、咖啡酸、槲皮素和沒食子酸[3]，楊紅原和李勝華對酢漿草進(jìn)行分離純化得到胡蘿卜苷、β-谷甾醇等化合物[4-5]。目前，在云南、貴州、廣西等省份的地方標(biāo)準(zhǔn)都收載有酢漿草藥材，其鑒別項(xiàng)均以對照藥材為對照進(jìn)行薄層色譜鑒別。為進(jìn)一步優(yōu)化該檢測項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)以β-谷甾醇、酢漿草對照藥材為對照，對展開劑進(jìn)行了調(diào)整，在此基礎(chǔ)上建立了酢漿草藥材的薄層鑒別，該方法具有斑點(diǎn)清晰、分離度良好、操作簡便、方法重復(fù)性好的特點(diǎn)，為進(jìn)一步完善酢漿草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器METTLER TOLEDO XS205分析天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器；DK-98-IIA水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2試藥與試劑β-谷甾醇對照品(批號: 110851-200202、酢漿草對照藥材(批號：1299-0301)均購自中國藥品生物制品檢定所；硅膠G預(yù)制板(批號：20150406)、硅膠G(批號：0140121)、硅膠GF254預(yù)制板(批號：20140703)、硅膠H預(yù)制板(批號：20140806)均為青島海洋化工廠分廠產(chǎn)品;所用試劑均為分析純。

1.3樣品來源實(shí)驗(yàn)收集到來自貴州、云南不同產(chǎn)地的13批酢漿草藥材，來源見表1。由貴州省食品藥品檢驗(yàn)所李楊老師鑒定為酢漿草(OxaliscorniculataL.)。

表1　酢漿草樣品信息表

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備取β-谷甾醇對照品適量，精密稱定，甲醇溶解，制成濃度為0.312mg/ml的溶液。

2.2供試品溶液的制備

2.2.1提取溶劑的考察取酢漿草藥材4份，各1g，精密稱定，分別加入石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇10ml，超聲提取30min，濾過，濾液作為供試品溶液。按照薄層色譜法(2015版《中國藥典》附錄VI B)實(shí)驗(yàn)，分別吸取對照品溶液1μl，供試品溶液2μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶8∶1.2∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于日光下及365nm紫外光下檢視，薄層色譜圖見圖1。結(jié)果表明，石油醚提取液斑點(diǎn)不及其它溶劑提取液的斑點(diǎn)多，乙酸乙酯、甲醇、乙醇提取液的斑點(diǎn)個(gè)數(shù)及大小一樣，考慮毒性及價(jià)格，選擇乙醇作為提取溶劑。

2.2.2提取方法的考察取酢漿草藥材2份，各1g，精密稱定，加入乙醇10ml，分別超聲提取30min和回流提取30min，濾過，濾液作為供試品溶液。分別吸取對照品溶液1μl，供試品溶液2μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶8∶1.2∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下及紫外燈下檢視，薄層色譜圖見圖2。結(jié)果表明，超聲提取與回流提取基本無差別，選取超聲方法為提取方法。

2.3對照藥材溶液的制備取酢漿草對照藥材1g，精密稱定，按照供試品溶液的方法制備即得。

2.4酢漿草藥材薄層色譜方法學(xué)考察

2.4.1顯色劑的考察取“2.2項(xiàng)”下的4個(gè)供試品溶液，照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取對照品溶液1μl，對照藥材溶液2μl，供試品溶液2μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶8∶1.2∶0.1)為展開劑，四張薄層板同時(shí)展開，取出，晾干，分別噴以10%硫酸乙醇溶液、5%香草醛硫酸溶液、10%磷鉬酸溶液以及碘蒸氣熏，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下及365nm紫外光下檢視。結(jié)果表明: 在日光下檢視，10%硫酸乙醇溶液和5%香草醛硫酸溶液顯色后斑點(diǎn)較清晰，顏色鮮明，顯色的斑點(diǎn)個(gè)數(shù)一致；磷鉬酸溶液顯色后斑點(diǎn)雖然清晰，但是不能反映出其他有的斑點(diǎn)的顏色，斑點(diǎn)個(gè)數(shù)較少；碘蒸汽熏的方法能使斑點(diǎn)顯色，但斑點(diǎn)個(gè)數(shù)較少，所需時(shí)間較長，不及其他顯色劑方便。在365nm紫外光下觀察，10%硫酸乙醇溶液顯色后的斑點(diǎn)更明顯，在與對照品相對應(yīng)的位置處顯藍(lán)色熒光；5%香草醛硫酸溶液及其他顯色劑顯色后均不顯熒光斑點(diǎn)。為更好體現(xiàn)樣品與對照藥材中的斑點(diǎn)信息，選取10%硫酸乙醇溶液作為顯色劑。

2.4.2展開系統(tǒng)的考察取“2.2項(xiàng)”下的4個(gè)供試品溶液，照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取對照品溶液1μl，對照藥材溶液2μl，供試品溶液2μl，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，所考察的展開系統(tǒng)及結(jié)果見表2。經(jīng)過對比及重復(fù)試驗(yàn)可知環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶8∶1.2∶0.1)的展開系統(tǒng)穩(wěn)定，展開的斑點(diǎn)較多，斑點(diǎn)間距離合適，分離度好，重現(xiàn)性好。因此選環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶8∶1.2∶0.1)作為實(shí)驗(yàn)的展開系統(tǒng)。

表2　展開劑考察結(jié)果

2.4.3點(diǎn)樣量的考察依次精密吸取供試品溶液1、2、3、4 μl；β-谷甾醇對照品溶液 1、2、3、4μl。點(diǎn)于同一薄層板上進(jìn)行考察。結(jié)果表明，供試品溶液隨著點(diǎn)樣量的增加，斑點(diǎn)越加明顯，但也出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，2μl的點(diǎn)樣量合適；β-谷甾醇對照品溶液1μl即很清晰及圓整。因此最佳點(diǎn)樣量確定為供試品溶液為2μl；β-谷甾醇對照品溶液為1μl。

2.4.4展開距離考察考察7、8、10、13cm的不同展開距離。結(jié)果表明，展開距離為7cm與8cm的斑點(diǎn)距離及個(gè)數(shù)相當(dāng)，斑點(diǎn)分離好。展開距離為10cm的斑點(diǎn)距離拉大，但斑點(diǎn)個(gè)數(shù)與7cm、8cm一樣。展開距離為13cm靠近溶劑前沿的斑點(diǎn)不圓整，扁平狀，且出現(xiàn)邊緣效應(yīng)。因此實(shí)驗(yàn)選用7cm作為展開距離。

2.4.5薄層板飽和時(shí)間考察考察0、8、15、30min的不同飽和時(shí)間。結(jié)果表明，飽和時(shí)間越長，斑點(diǎn)移動(dòng)距離越長，15min時(shí)，溶劑前沿附近斑點(diǎn)出現(xiàn)重疊，30min時(shí)，溶劑前沿附近斑點(diǎn)重疊嚴(yán)重。0min和8min時(shí)，斑點(diǎn)分離好，但0min時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，因此，實(shí)驗(yàn)選擇8min作為薄層板的飽和時(shí)間。

2.5方法耐用性考察

2.5.1不同薄層板的考察實(shí)驗(yàn)考察硅膠H預(yù)制板板、硅膠GF254預(yù)制板板、硅膠G預(yù)制板、硅膠G(批號：0140121)自制板4種類型的薄層板，薄層色譜圖見3。結(jié)果表明：斑點(diǎn)在4種類型的薄層板上均能分離，硅膠H板接近溶劑前沿的斑點(diǎn)較硅膠G板上的斑點(diǎn)扁平，有斑點(diǎn)有少量重疊。硅膠GF254板上的斑點(diǎn)日光下檢視與硅膠G板相當(dāng)，在365nm紫外光下斑點(diǎn)顯熒光，但不及硅膠G板清晰；在254nm紫外光下斑點(diǎn)顯黑色，不清晰。硅膠G自制板斑點(diǎn)與相鄰斑點(diǎn)分離度好，其它斑點(diǎn)移動(dòng)距離不及硅膠G預(yù)制板上斑點(diǎn)移動(dòng)距離遠(yuǎn)，但不影響斑點(diǎn)分離效果。硅膠G預(yù)制板與自制板均可作為本實(shí)驗(yàn)用薄層板。

2.5.2溫度的考察分別在低溫(4℃)、室溫(22℃)、高溫(40℃)進(jìn)行溫度的考察。結(jié)果表明：供試品和對照品在不同溫度下的色譜行為一致，各斑點(diǎn)能較好的分離，說明溫度對本實(shí)驗(yàn)方法影響不大，薄層色譜圖見4。

2.5.3濕度的考察分別在高濕 (72%)、中濕 (47%)和低濕 (18%) 條件下進(jìn)行考察，濕度以不同濃度的硫酸溶液進(jìn)行控制。將點(diǎn)樣后的薄層板放入展開缸，另一側(cè)的展開槽里放一定濃度的硫酸，密閉10min后再加展開劑展開。當(dāng)硫酸-水(27.5∶100, V/V)時(shí)，相對濕度為72%；當(dāng)硫酸-水 (50∶100，V/V)時(shí)，相對濕度為47%；當(dāng)硫酸-水(100∶95.5, V/V)時(shí)，相對濕度為18%。結(jié)果表明供試品和對照品在高濕、中濕和低濕環(huán)境各斑點(diǎn)均能實(shí)現(xiàn)較好的分離，說明本方法具有良好的環(huán)境適應(yīng)性，薄層色譜圖見5。

2.5.4色譜條件的確定取對照品溶液1μl，對照藥材溶液2μl，供試品溶液2μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶8∶1.2∶0.1)為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下及365nm紫外光下檢視。

2.6酢漿草藥材的薄層色譜圖將收集到的13批酢漿草藥材，按“2.2項(xiàng)”下制備供試品溶液后，按“2.5.4”確定的色譜條件進(jìn)行檢測，薄層色譜圖見6。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的方法分離度高，重現(xiàn)性好，操作簡單，可用于標(biāo)準(zhǔn)不完善的酢漿草藥材的質(zhì)量控制。

3討論

在展開劑考察過程中，曾試用二氯甲烷代替三氯甲烷，但二氯甲烷的沸點(diǎn)低，在常溫下?lián)]發(fā)性較三氯甲烷大，氣壓不穩(wěn)定,展開的斑點(diǎn)位置不穩(wěn)定，且斑點(diǎn)不及三氯甲烷的展開體系展開的斑點(diǎn)清晰，因此選用三氯甲烷為展開溶劑。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)酢漿草對照藥材溶液與樣品溶液點(diǎn)樣斑點(diǎn)大小一致，因此點(diǎn)樣量的考察選用了樣品溶液。

有關(guān)酢漿草的文獻(xiàn)有用到異葒草素[7]、蘆丁[2]為對照品進(jìn)行總黃酮類含量測定，用刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷為對照品進(jìn)行薄層鑒別，刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷為實(shí)驗(yàn)室自制[8]。β-谷甾醇是一種植物甾醇，藥理研究表明：β-谷甾醇具有降低血清膽固醇、抗炎退熱、抑制腫瘤，抑制乳腺增生等作用[9]。在抗癌機(jī)制的探討中，β-谷甾醇對人肝癌 HepG2 細(xì)胞生長具有較強(qiáng)的抑制作用，對正常肝細(xì)胞 QSG7701 的生長及凋亡相關(guān)蛋白幾乎沒有影響，其通過線粒體途徑及膜死亡受體途徑誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡[10]。考慮到β-谷甾醇可能是酢漿草的功效成分之一，實(shí)驗(yàn)采用β-谷甾醇作為酢漿草薄層檢測的對照，對照品易于獲得，檢測成本較為低廉。選用環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶8∶1.2∶0.1)為展開劑，選用10%硫酸乙醇作為顯色劑，樣品中在與對照品及對照藥材的位置處都顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)顏色清晰，且分離度高、重現(xiàn)性好，為完善酢漿草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：貴州省中藥標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究中心(黔科合社字[2008]5002號)。

作者簡介：敖嬌(1990-)，女，苗族，2014級研究生，主要從事中藥及民族藥質(zhì)量控制及新藥研究。E-mail:747767518@qq.com 通信作者：鮑家科，E-mail:bjk2005@163.com

【中圖分類號】R282.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)12-0037-07

(收稿日期：2016.04.29)

Study on TLC identification methods ofOxaliscorniculataL.

AO Jiao1LIU Jianjun1BAO Jiake2*

1.Guiyang college of Traditional Chinese Medicine ,Guiyang 550002, China;2. Guizhou Center for Drug Evaluation and Certification,Guiyang 550004,China

Abstract:Objective To establish a TLC identification method for Oxalis corniculata L.Methods Using both the standard Oxalis corniculata L.and β-sitosterol as the reference substances of TLC idetification, to investigate the factors affecting the thin layer chromatography, select the best thin layer chromatographic conditions. Results Selected the best thin layer chromatographic conditions of Oxlis corniculata L.,experiment method was confirmed. Conclusion Established the thin layer identification method of Oxalis corniculata L.Its characteristics inluded the clear spots, good separating degree, easy operation and the method repeatability well. The method could provide a certain basis for further improving the quality standards of Oxalis corniculata L.

Key words:Oxalis corniculata L.; TLC identification ; Method