馬藍與路邊青的matK序列差異與分子鑒定方法分析

魏藝聰　陳建雄　黃澤豪　盧　偉　梁一池

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建　福州　350122

?

馬藍與路邊青的matK序列差異與分子鑒定方法分析

魏藝聰陳建雄黃澤豪*盧偉梁一池

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122

【摘要】目的：研究擬基于matK序列分析，探討馬藍與路邊青相互鑒別的新方法。方法：從GenBank核酸數(shù)據(jù)庫下載馬藍與路邊青matK 序列，應(yīng)用ClustalX 2.1軟件進行SNP鑒別位點分析，應(yīng)用 MEGA5.0 軟件計算種內(nèi)和種間的(K2P)遺傳距離，并構(gòu)建鄰接(NJ)系統(tǒng)聚類樹。結(jié)果：獲得8個馬藍matK序列及12個路邊青matK序列，分析顯示馬藍與路邊青的matK序列具有近百個SNP位點，且其中多是馬藍與路邊青特有的，可作為二者間相互鑒別的分子標(biāo)記。且馬藍的最大種內(nèi) K2P 遺傳距離0.001 與路邊青最大種內(nèi) K2P 遺傳距離0.005均遠遠小于馬藍與路邊青的種間 K2P 遺傳距離0.144～0.149，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示馬藍與路邊青單獨聚為一類。結(jié)論：matK序列可為馬藍與路邊青的相互鑒別提供新的分子鑒定方法。

【關(guān)鍵詞】馬藍；路邊青；matK序列；分子鑒別

馬藍為爵床科植物馬藍Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.，根與葉入藥，具有清熱解毒、涼血消腫的功效，可用于預(yù)防流感、流腦，治療腮腺炎、急性腸炎、咽喉炎、口腔炎、扁桃體炎、肝炎等炎癥。路邊青為馬鞭草科植物大青ClerodendrumcyrtophyllumTurcz.，全草入藥，具有祛風(fēng)、除濕、止痛與鎮(zhèn)痙等功效。在部分地區(qū)常習(xí)慣把兩者當(dāng)作中藥“大青葉”使用，由于兩者化學(xué)成分與功效主治均不相同[1-2]，因此在用藥時應(yīng)嚴格鑒別。但兩者常分布于同一地區(qū)，干燥藥材常因變形而不易鑒別，導(dǎo)致相互混淆。兩者傳統(tǒng)鑒別方法有：葉片顯微鑒別法、TLC特征圖譜鑒別法等[3-6]，但是方法均比較繁雜，急需一種簡便、快速、可靠的鑒別方法。

近年來，DNA條形碼分析技術(shù)為中藥基源的分子鑒定提供了可靠的方法，已廣泛應(yīng)用于中藥材的分子鑒定。其中，matK基因為單拷貝編碼基因，序列長度約1500bp，位于葉綠體賴氨酸t(yī)RNA基因(trnK)高度保守的2個外顯子之間的內(nèi)含子中，編碼參與RNA轉(zhuǎn)錄本中II型內(nèi)含子剪切的成熟酶(maturase)。matK基因是葉綠體基因組中進化較快的基因之一，可在科、屬級水平為研究類群內(nèi)部的系統(tǒng)進化分析提供了較多的信息[7]。在某些類群中，matK序列也為種間、種下的系統(tǒng)進化研究提供了一定的價值[8],在植物DNA條形碼研究中被認為是的核心DNA條形碼序列之一，matK基因也被用于藥用植物的分子鑒定研究[9-11]。本研究應(yīng)用matK條形碼對易混品種馬藍與路邊青進行鑒定分析，旨在為馬藍與其易混品路邊青的快速準(zhǔn)確鑒定及其準(zhǔn)確應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣本從GenBank(美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫)下載馬藍(Baphicacanthus cusia(Nees )Bremek.)與路邊青(Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.)的matK基因序列。其中，獲不同來源的馬藍matK序列各8條，路邊青matK序列各12條；樣品采集信息及matK序列的GenBank登錄號見表1。

1.2序列處理應(yīng)用ClustalX 2.1軟件對實驗所獲所有不同來源的matK序列進行多重對比，獲得多重比對的matK序列，應(yīng)用該序列進行SNP鑒別位點分析及后續(xù)遺傳距離及系統(tǒng)聚類分析。

1.3數(shù)據(jù)分析利用MEGA5.0該軟件對經(jīng)過多重比對的受試序列進行種內(nèi)種間Kimura 2-parameter (K2P)遺傳距離分析，并構(gòu)建鄰接(NJ)系統(tǒng)聚類樹。

表1　樣品采集信息及matK序列 GenBank登錄號

2結(jié)果

2.1馬藍與路邊青的matK序列中SNP位點分析所獲序列經(jīng)ClustalX 2.1軟件進行多重序列對比分析顯示，其中8個不同來源的馬藍matK序列樣本種內(nèi)僅有1個SNP位點，而12個不同來源的路邊青matK序列樣本種內(nèi)有6個SNP位點，而馬藍與路邊青的matK序列之間的SNP位點多達近百個，其中多數(shù)SNP位點均屬馬藍與路邊青特異的，可作為馬藍與路邊青相互鑒別的SNP位點。見圖1。

2.2馬藍與路邊青的種內(nèi)與種間的遺傳距離分析應(yīng)用MEGA5.0 軟件進行馬藍與路邊青的種內(nèi)與種間的Kimura2-parameter(K2P)遺傳距離分析表明，8個受試馬藍樣本matK序列的遺傳距離為0～0.001之間，顯示受試馬藍樣本matK序列的種內(nèi)變異極小。12個受試路邊青matK序列的遺傳距離為0～0.005之間，顯示路邊青matK序列的種內(nèi)變異也很小。而馬藍與路邊青的的種間遺傳距離在0.144～0.149之間，結(jié)果表明受試馬藍與路邊青的的種間遺傳距離遠大于受試馬藍與路邊青的的種內(nèi)遺傳距離。因此，matK序列能夠?qū)ⅠR藍與路邊青區(qū)分開，該序列可用于鑒別條形碼。

表2　各樣本matK序列的種內(nèi)與種間遺傳距離

1234567891011121314151617181920120.00030.0000.00040.0020.0020.00250.0020.0020.0020.00060.0030.0030.0030.0010.00170.0050.0050.0050.0020.0020.00180.0050.0050.0050.0020.0020.0010.00090.0050.0050.0050.0020.0020.0010.0020.002100.0050.0050.0050.0020.0020.0010.0020.0020.000110.0050.0050.0050.0020.0020.0010.0020.0020.0020.002120.0020.0020.0020.0000.0000.0010.0020.0020.0020.0020.002130.1470.1470.1470.1440.1440.1460.1470.1470.1440.1440.1470.144140.1470.1470.1470.1440.1440.1460.1470.1470.1440.1440.1470.1440.000150.1470.1470.1470.1440.1440.1460.1470.1470.1440.1440.1470.1440.0000.000160.1490.1490.1490.1460.1460.1470.1490.1490.1460.1460.1490.1460.0010.0010.001170.1470.1470.1470.1440.1440.1460.1470.1470.1440.1440.1470.1440.0000.0000.0000.001180.1470.1470.1470.1440.1440.1460.1470.1470.1440.1440.1470.1440.0000.0000.0000.0010.000190.1470.1470.1470.1440.1440.1460.1470.1470.1440.1440.1470.1440.0000.0000.0000.0010.0000.000200.1470.1470.1470.1440.1440.1460.1470.1470.1440.1440.1470.1440.0000.0000.0000.0010.0000.0000.000

注：1～20編號順序同表1. 1～12為路邊青；13～20為馬藍。

2.3馬藍與路邊青的系統(tǒng)聚類樹鑒定分析所獲所有樣本序列應(yīng)用Meg 5.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹進行分析，進一步分析其相互近源關(guān)系，見圖2。NJ系統(tǒng)聚類樹結(jié)果顯示8個不同來源的馬藍樣本與12個不同源的路邊青樣本分別單獨聚為一類，二者之間沒有交叉。以上結(jié)果表明，matK序列適用于馬藍與路邊青之間的鑒別，可作為馬藍與路邊青之間相互鑒別的提供分子鑒定依據(jù)。

3小結(jié)

對馬藍與路邊青之間的傳統(tǒng)鑒別方法主要有葉片顯微結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分差異等方面[1-2]。何報作等[3]應(yīng)用LMVP(葉形態(tài)-脈序圖譜鑒別法與QAERM)定量分析評價法對馬藍與路邊青進行相互鑒別；覃繼佳等[4]采用顯微鑒別法馬藍葉與混淆品路邊青葉的脈末梢顯微鑒別特進行鑒別。而通過化學(xué)成分差異分析進行鑒別的研究有，黃燮才等[5]提出用 TLC 區(qū)別馬藍葉與其同屬植物的易混淆品；薛漓等[6]提出鑒別路邊青葉的TLC特征圖譜、重現(xiàn)性較好。隨著DNA 條形碼技術(shù)易于形成統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)，可靠性與穩(wěn)定性高，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用中藥材的鑒定[9-11]。本研究對馬藍與路邊青的綠體DNA中matK基因序列分析，結(jié)果顯示，馬藍與路邊青的matK序列具有豐富的SNP位點，且其中多是馬藍與路邊青特有，可用于相互鑒別的分子標(biāo)記。且馬藍最大種內(nèi) K2P 遺傳距離 0.001 遠遠小于馬藍與路邊青的種間 K2P 遺傳距離 0.144～0.149，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示馬藍與路邊青之間沒有交叉，分別聚為單獨一類。結(jié)果均顯示，matK序列作為 DNA 條形碼的可為準(zhǔn)確、簡便地鑒定馬藍與路邊青相互鑒別提供新的分子鑒定方法。

參考文獻

[1] 國家中醫(yī)藥管理局，《中華本草》 編委會. 中華本草(第七冊)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1999： 450-451.

[2] 國家中醫(yī)藥管理局，《中華本草》 編委會. 中華本草(第六冊) [M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1999： 566-567.

[3] 何報作，覃繼佳，朱意麟，等. 馬藍葉與其易淆品路邊青葉的葉形態(tài)-脈序圖譜的鑒別特征[J].中藥材，2012，35(3)：385-391.

[4] 覃繼佳，何報作.馬藍葉與混淆品路邊青葉的脈末梢顯微鑒別特征[J].廣西中醫(yī)藥，2011，34(6)：55-57.

[5] 黃燮才，楊芬，韋家福.中藥馬藍葉及其混亂品的比較鑒別[J].廣西植物，1988， 8(3)：239-243.

[6] 薛漓，饒偉文. 路邊青的鑒別研究[J].中草藥，2004，35(4)：455-457.

[7] Plunkett, G., D. Soltis, and P. Soltis, Clarification of the relationship beteen Apiaceae and Araliaceae based on matK and rbcLsequence data[J]. American Journal of Botany, 1997，84(4):565-565.

[8] Stanford A M, Harden R, Parks C R. Phylogeny and biogeographyof Juglans (Juglandaceae) based on matK and ITS sequence data[J].Am J Bot, 2000, 87(6): 872-882.

[9] 劉靜，何濤，淳澤.藥用石斛的葉綠體 matK 基因序列分析及鑒別[J].藥學(xué)學(xué)報, 2009, 44(9) :1051-1055.

[10]陳士林，宋經(jīng)元，姚輝,等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關(guān)鍵技術(shù)分析[J].中國天然藥物,2009,7(5)322-327.

[11]陳士林，姚輝，宋經(jīng)元，等.基于DNA barcode ( 條形碼)技術(shù)的中藥材鑒定[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9(3)：7-12.

基金項目：中醫(yī)藥公益性行業(yè)專項(201407002)。

作者簡介：魏藝聰(1981-)，福建漳浦人，講師，碩士，主要從事中藥生物技術(shù)的研究。E-mail: yicongwei@126.com 通信作者：黃澤豪，主要從事中藥生藥學(xué)研究。E-mail: huangzehao@fudan.edu.cn

【中圖分類號】R282.5

【文獻標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)12-0027-03

(收稿日期：2016.04.15)

Identification ofBaphicacanthuscusiaandClerodendrumcyrtophyllumBased on GenBank Nucleotide Database matK Sequence

WEI YicongCHEN JianxiongHUANFG Zehao*LU weiLIANG Yichi

College of Pharmacy，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China

Abstract:Objective To establish a new molecular method to authenticate Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum by using matK sequences in GenBank nucleicacid database. Methods Based on GenBank Nucleotide Database，matK sequences of Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum were downloaded. The SNP sites of them were checked by ClustalX 2.1 software ,K2P Distances were calculated using MEGA 5.0 software and neighbor-ioining(NJ) phylogenetic tree was established. Results There many specific SNP sites can be used to molecular identification of Centella asiatica and Baphicacanthus cusia. K2P genetic distance of intraspecific genetic distance of Baphicacanthus cusia is 0.001,and Baphicacanthus cusia is 0.005,which was far less than K2P genetic distance between Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum (0.144～0.149). Results of NJ phylogenetic tree showed that Baphicacanthus cusia can be separated from Clerodendrum cyrtophyllum and classified into a separate one.Conclusions MatK sequence is suitable for molecular authentication n of Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum and provides reference for quality and safety identification of Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum .

Key words:Baphicacanthus cusia; Clerodendrum cyrtophyllum; matK sequence; Identification