Syndecan-1基因沉默抑制膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞增殖和侵襲☆

石爽鐘東王兵王文濤張福安黃浩洋

Syndecan-1基因沉默抑制膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞增殖和侵襲☆

石爽*鐘東*王兵*王文濤*張福安*黃浩洋*

目的探討多配體蛋白多糖-1（Syndecan-1，SDC1）在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平及其沉默對A172細(xì)胞的增殖和侵襲的影響。 方法 通過實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Western Blotting分析SDC1在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平；將攜帶SDC1 shRNA的慢病毒載體感染A172細(xì)胞，穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株為干擾組，未轉(zhuǎn)染為陰性對照組，轉(zhuǎn)染scramble序列為空白對照組；采用MTT法、臺盼藍(lán)拒然法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖能力，Transwell小室實(shí)驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲力；qRT-PCR和Western Blotting檢測相關(guān)蛋白變化。結(jié)果 SDC1在不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中表達(dá)強(qiáng)度不同，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默SDC1 的A172細(xì)胞株；與陰性對照組和空白對照組相比，干擾組細(xì)胞增殖受到抑制（P＜0.05），遷移力（58.40±5.24 vs. 255.8±16.09、226.5±22.84，F(xiàn)=126.4，P＜0.05）和侵襲力（61.67±16.26 vs.233.70±17.24、244.30±28.15，F(xiàn)=69.87，P＜0.05）明顯抑制；SDC1、PCNA和MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 沉默SDC1基因的表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示SDC1可能成為膠質(zhì)瘤生物治療的新靶點(diǎn)。

膠質(zhì)瘤 Syndecan-1增殖和侵襲

【Abstract】Objective To investigate the expression of syndecan-1（SDC1）in glioma cells and the effects of syndecan-1 knockdown on the proliferation and invasion of A172 cells.Methods The expression of syndecan-1 in glioma cells was analyzed using quantitative Real-time PCR and Western blotting.A172 cells were transfected with lentiviral vector carrying SDC1 shRNA to establish a stable SDC1-silencing cell line.The cell proliferation was analyzed by MTT assay.Trypan blue exclusion assay and flow cytometry，and Transwell assays were performed to measure the migration and invasion abilities，respectively.The mRNA and protein and expression levels of SDC1，Proliferation Cell Nuclear Antigen（PCNA）and Matrix Metalloproteinase 9（MMP-9）were detected by using qRT-PCR and Western blotting.Results The expression levels of SDC1 were significantly different in different glioma cell lines.The stable SDC1-silencing cell line was successfully established，in which the mRNA and protein expression levels of SDC1 were significantly decreased （P＜0.05）.SDC1 knockdown significantly reduced the cell proliferation，migration（58.40±5.24 vs.255.8±16.09、226.5± 22.84，F(xiàn)=126.4，P＜0.05）and invasion（61.67±16.26 vs.233.70±17.24、244.30±28.15，F(xiàn)=69.87，P＜0.05）compared with either control group or blank group.SDC1 knockdown also significantly decreased the mRNA and protein expressionlevels of PCNA and MMP-9（P＜0.05）.Conclusion：SDC1 knockdown suppresses the capacities of proliferation，invasion and migration of glioma A172 cell，implying that SDC1 may serve as a novel target in the biotherapy of glioma.

【Key words】Glioma Syndecan-1 Proliferation and Invasion

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，患者的中位生存期低于15個月，目前臨床綜合治療雖然取得一定進(jìn)展，但其療效并不理想［1］。多配體蛋白多糖-1（Syndecan-1，SDC1）是一類Ⅰ型跨膜蛋白多糖，可與廣泛的胞外配體及胞膜受體相結(jié)合［2］，介導(dǎo)胞內(nèi)外信號的傳導(dǎo)，與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)［3］。然而SDC1在膠質(zhì)瘤上是否表達(dá)尚不確定［4，5］。本課題在此基礎(chǔ)上檢測SDC1在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平，利用RNAi技術(shù)研究SDC1對膠質(zhì)瘤增殖和侵襲的影響，尋找膠質(zhì)瘤生物治療的新靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、SHG-44、A172和U87（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；Syndecan-1-RNAi、scramble序列及轉(zhuǎn)染試劑（上海吉凱基因）；RNA及PCR擴(kuò)增試劑盒（Takara公司）、Syndecan-1、β-actin、MMP-9、PCNA引物（大連寶生物）；MTT試劑（Genview corporation）；Transwell小室（Millipore）；總蛋白提取試劑盒（上海碧云天）；Syndecan-1鼠單克隆單體（Thermo Fisher Scientific）、MMP-9兔單克隆單體（Abcam）、PCNA兔單克隆單體（Abcam）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)加入青霉素-鏈霉素混合液（1：100），37℃、5%CO2的恒溫孵箱中常規(guī)培養(yǎng)U251、SHG-44、A172及U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

1.3 qRT-PCR檢測不同細(xì)胞株中SDC1的表達(dá)水平及A172沉默后相關(guān)基因的表達(dá) 于對數(shù)期收集各組細(xì)胞，Trizol法提取各組總RNA，反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)按說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃5s，58℃30s，40個循環(huán)。引物序列如下：syndecan-1-F 5'-CGTGGGGCTCATCTTTGCT-3'，syndecan-1-R5'-TGGCTTGTTTCGGCTCCTC-3'；β-actin-F 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，βactin-R 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'；PCNA-F 5'-GTAATGTCGATAAAGAGGAGGAAGC-3'，PCNA-R 5'-CATACTGAGTGTCACCGTTGAAGAG-3'；MMP-9-F5'-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3'，MMP-9-R5'-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3'。

1.4 Western blotting檢測不同細(xì)胞株中SDC1的表達(dá)水平及A172沉默后相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，按說明書提取總蛋白于-20℃保存。將各組蛋白質(zhì)樣品于10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳。電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2h，孵育一抗過夜，稀釋比例如下：Syndecan-1 1：200；PCNA 1：200；MMP-9 1：1000；β-actin 1：2000。TBST漂洗后，孵育二抗l h（馬抗小鼠1：4 000；山羊抗兔1：2 000），再次經(jīng)TBST洗膜后，加入ECL發(fā)光液顯影，采集圖像。以β-actin為內(nèi)參照，用圖像處理軟件FUSION對條帶進(jìn)行半定量分析。

1.5慢病毒感染膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞并構(gòu)建穩(wěn)定沉默SDC1的細(xì)胞株 取指數(shù)生長期A172細(xì)胞，按3×105～5×105個/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)12h，根據(jù)預(yù)實(shí)驗選擇含干擾效果最佳的靶點(diǎn)序列5'-GACTGCTTTGGACCTAAAT-3'及空白對照組的scramble序列的病毒懸液，依照病毒轉(zhuǎn)染手冊加入對應(yīng)6孔板，轉(zhuǎn)染12h后更換常規(guī)培養(yǎng)基。72h后于倒置相差顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，嘌呤霉素篩選，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，將穩(wěn)定沉默的命名為干擾組（shSDC1），轉(zhuǎn)染Scramble序列的為空白對照組（Blank Control），未轉(zhuǎn)染者為陰性對照組（Negative Control）。并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及后續(xù)實(shí)驗。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞活性 收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×104個/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板內(nèi)，5%CO2的37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)3d，每孔加入培養(yǎng)液體積10%的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸取含MTT的培養(yǎng)上清，加入DMSO溶解形成甲臜晶體并通過酶聯(lián)免疫檢測儀測量OD值。每組設(shè)6個平行孔，重復(fù)3次。數(shù)據(jù)經(jīng)Graphpad prism5軟件處理，采用多組樣本均數(shù)間比較。

1.7臺盼藍(lán)拒然法繪制生長曲線 取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×104cells/mL接種于6孔板中培養(yǎng)，每組各3個復(fù)孔，每24h收集各組細(xì)胞，臺盼藍(lán)拒然法計數(shù)，每孔計數(shù)3次，連續(xù)測定7次，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，間隔時間為橫坐標(biāo)繪制成生長曲線。數(shù)據(jù)經(jīng)Graphpad prism5軟件處理，通過配對t檢驗分析比較。

1.8流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化 收集各對數(shù)生長期細(xì)胞，以3×105～5×105個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，12h后更換無血清培養(yǎng)基饑餓16h，再次更換正常培養(yǎng)基，3d后收集各組細(xì)胞，75%預(yù)冷乙醇固定消化好的單細(xì)胞懸液過夜，再次離心收集細(xì)胞，加入溴化乙錠（50μg/mL），RNase A （100μg/mL），4℃避光孵育30 min。上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.9 Transwell小室實(shí)驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力收集對數(shù)生長期細(xì)胞，于Transwell上室加入200μL細(xì)胞懸液，使上室細(xì)胞總數(shù)為7×105個，并移入含600μL培養(yǎng)基的24孔板中。常規(guī)培養(yǎng)8h后，取出Tranwell小室，多聚甲醛固定并結(jié)晶紫染色，PBS洗去多余染色，棉簽輕輕拭去上層細(xì)胞并晾干。將小室的下表面置于光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野（上、中、下、左、右）進(jìn)行計數(shù)并統(tǒng)計分析。侵襲實(shí)驗需按1：5的比例加入Matrigel包被，遷移時間為20h，其余步驟相同。每個實(shí)驗組均重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad prism5分析處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較用單因數(shù)方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey test。生長曲線采用配對t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1 SDC1在不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中表達(dá)強(qiáng)度不同qRT-PCR和Western Blotting顯示SDC1在膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞中高表達(dá)，其mRNA相對表達(dá)量約是U251星形膠質(zhì)細(xì)胞的4.38倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=26.01，P＜0.05）；其蛋白的相對表達(dá)量約是U251的5.05倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.37，P＜0.05），SHG-44星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)量與U251無明顯差異（圖1，表1）。

圖1 SDC1在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的相對表達(dá)水平

表1 SDC1在不同細(xì)胞株中的相對表達(dá)量（n=3）

2.2成功夠建穩(wěn)定沉默SDC1的A172細(xì)胞株將含Syndecan-1-RNAi和Scrambled序列的病毒懸液轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞，鏡下見細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，嘌呤霉素篩選后，流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染率分別為 97.82%±0.04%和 83.50%±0.23%（圖 2）。qRT-PCR和Western Blot顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組中SDC-1mRNA（17.10%±3.63%vs.100.00%、75.78%± 9.82%，F(xiàn)=149.1，P＜0.05）和蛋白水平（47.29%± 16.17%vs.100.00%、91.80%±26.88%，F(xiàn)=14.71，P＜0.05）明顯降低（圖3A和表2），提示成功構(gòu)建穩(wěn)定株，用于后續(xù)實(shí)驗。

2.3 SDC1的沉默抑制膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞的增殖能力 與陰性對照組和空白對照組相比，MTT法顯示干擾組生長緩慢，在第3天出現(xiàn)明顯的差異（1.44± 0.11 vs.2.22±0.28、2.19±0.10，F(xiàn)=17.3，P＜0.05），隨著時間的延長，生長曲線顯示差異更加明顯（P＜0.05）；流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)干擾組S期細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，其增殖率（S+G2）/（G1+ S+G2）明顯降低（30.84%±3.4%vs.47.76%±0.38%、50.02%±3.38%，F(xiàn)=42.38，P＜0.01）（圖4）。

2.4 SDC1的沉默抑制膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞侵襲和遷移能力 與陰性對照組和空白對照組相比，Transwell遷移實(shí)驗顯示干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)（58.40± 5.24 vs.255.8±16.09、226.5±22.84，F(xiàn)=126.4，P＜0.01）明顯降低；Transwell侵襲實(shí)驗顯示干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)（61.67±16.26 vs.233.7±17.24、244.3± 28.15，F(xiàn)=69.87，P＜0.01）也明顯降低，差異具有顯著性，陰性對照組和空白對照組無明顯差異（圖5）。

圖2慢病毒成功感染A172細(xì)胞 A：攜帶靶點(diǎn)序列和Scrambled序列的慢病毒感染A172細(xì)胞后綠色熒光蛋白的表達(dá)（×200）；B：嘌呤霉素篩選后的轉(zhuǎn)染率

2.5 SDC1的沉默降低PCNA和MMP-9的表達(dá)水平 與陰性對照組和空白對照組相比，qRT-PCR顯示干擾組中PCNA mRNA（20.67%±7.38%vs. 100.00%、109.80%±4.01%，F(xiàn)=304.7，P＜0.05）和MMP-9 mRNA（27.76%±4.62%vs.100.00%、104.0%±5.98%，F(xiàn)=289.8，P＜0.05）相對表達(dá)量明顯降低；Western blotting顯示干擾組中PCNA（65.83%±10.38%vs.100.00%、103.00%±17.68%，F(xiàn)= 9.14，P＜0.05）和 MMP-9（55.82%±9.93%vs. 100.00%、100.50%±4.97%，F(xiàn)=47.92，P＜0.05）蛋白相對表達(dá)量明顯降低（圖3B，C和表2）。

圖3 SDC1的沉默抑制PCNA和MMP-9的表達(dá)

表2 SDC1的沉默抑制PCNA和MMP-9的表達(dá)（n=3）

3　討論

多配體蛋白多糖（Syndecan）是一類Ⅰ型跨膜蛋白多糖，由跨膜的核心蛋白及其胞外相連的糖胺聚糖鏈共同組成；其核心蛋白的多功能區(qū)和糖胺聚糖鏈的多態(tài)性使其廣泛參與細(xì)胞的分化、增殖和侵襲［6］。SDC1是一類廣泛研究的亞型，其在腫瘤組織間質(zhì)和瘤細(xì)胞的高表達(dá)與腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)，如乳腺癌、胃癌、胰腺癌［3］、前列腺癌［7］和B淋巴瘤［8］等。然而SDC1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)有相反報道，姜華［4］等發(fā)現(xiàn)SDC1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)較正常組織低，其與腫瘤的級別無相關(guān)性；XU［5］等檢測到SDC1高表達(dá)于膠質(zhì)瘤組織中，且其表達(dá)強(qiáng)度與膠質(zhì)瘤的等級和腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)［4，5］。因此SDC1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)尚無定論，其分子功能是否影響膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為并不清楚。

圖4 SDC1的沉默抑制A172細(xì)胞的增殖。A：MTT法顯示SDC1的沉默抑制A172的增殖能力；B：生長曲線顯示干擾組生長緩慢；CD：流式細(xì)胞術(shù)顯示干擾組細(xì)胞增殖率（S+G2/G1+S+G2）明顯下降（mean±SD，n=3，**P＜0.05，***P＜0.01）

圖5 SDC1的沉默抑制A172的遷移和侵襲。AC：SDC1的沉默抑制A172細(xì)胞的遷移（×200）；BD：SDC1的沉默抑制A172細(xì)胞的侵襲（×200）（mean±SD，n=3，***P＜0.01）

基于以上研究背景和組織標(biāo)本對蛋白質(zhì)與RNA提取純度影響較大，本研究在不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，SDC1高表達(dá)于A172和U87細(xì)胞，低表達(dá)于U251和SHG-44細(xì)胞（圖1和表1）。鑒于A172和U87細(xì)胞來源于GradeⅣ級的膠質(zhì)瘤，U251和SHG-44來源于Grade Ⅱ-Ⅲ級膠質(zhì)瘤，推測SDC1可能與膠質(zhì)瘤的等級相關(guān)。這一結(jié)果與Xu等人的研究相符，進(jìn)一步提示SDC1可能是膠質(zhì)瘤的特異性分子標(biāo)記物。

實(shí)驗發(fā)現(xiàn)SDC1同時高表達(dá)于A172和U87細(xì)胞，但是其在A172細(xì)胞的蛋白水平表達(dá)更穩(wěn)定（圖1）。本課題組在此基礎(chǔ)上，通過RNAi技術(shù)建立穩(wěn)定沉默SDC1的A172細(xì)胞株。通過MTT實(shí)驗、臺盼藍(lán)拒然法和Transwell小室實(shí)驗發(fā)現(xiàn)SDC1基因的沉默抑制了A172細(xì)胞的增殖和侵襲（圖4A，B和圖5）。同時流式細(xì)胞術(shù)顯示SDC1的沉默抑制細(xì)胞的S期，使干擾組細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，細(xì)胞的增殖率降低（圖4C），與細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗相一致。最后qRT-PCR和Western blotting發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞的PCNA和MMP-9表達(dá)降低（圖3B，C和表2）。PCNA是一種小分子的核蛋白，與細(xì)胞DNA的合成關(guān)系密切，在S期的合成達(dá)成高峰，其量的變化反應(yīng)DNA的合成情況和腫瘤細(xì)胞增殖及分化程度［9］；MMP-9能夠裂解腫瘤細(xì)胞表面重要的粘附分子，降解膠原蛋白、明膠蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移［10］。PCNA和MMP-9的降低進(jìn)一步證實(shí)SDC1的沉默抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。

綜上所述，SDC1在不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中都有表達(dá)，且其表達(dá)強(qiáng)度可能與膠質(zhì)瘤的等級相關(guān)。SDC1的沉默可能通過抑制膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞的PCNA和MMP-9途徑抑制其增殖與侵襲，有望成為膠質(zhì)瘤生物治療的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗為尋找膠質(zhì)瘤的特異靶點(diǎn)提供了基礎(chǔ)，但SDC1基因沉默后通過何種機(jī)制引起PCNA和MMP-9表達(dá)的改變，又有哪些信號通路參與，目前尚不清楚，我們將在下一步進(jìn)行深入的研究。

［1吳勁松，毛穎.腦膠質(zhì)瘤手術(shù)理念和研究熱點(diǎn)［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2009，35（6）：376-379.

［2］XIAN X，GOPAL S，COUCHMAN JR.Syndecans as receptors and organizers of the extracellular matrix［J］.Cell and Tissue Research，2010，339（1）：31-46.

［3］GHARBARAN R.Advances in the molecular functions of syndecan-1（SDC1/CD138）in the pathogenesis of malignancies［J］. Critical Reviews in Oncology/Hematology，Elsevier Ireland Ltd，2015，94（1）：1-17.

［4姜華，周幽心，邵忠，等.Syndecan-1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2005，25（1）：113-114.

［5］XU Y，YUAN J，ZHANG Z，et al.Syndecan-1 expression in human glioma is correlated with advanced tumor progression and poor prognosis［J］.Molecular Biology Reports，2012，39（9）：8979-8985.

［6］KWON MJ，JANG B，YI JY，et al.Syndecans play dual roles as cell adhesion receptors and docking receptors［J］.FEBS Letters，F(xiàn)ederation of European Biochemical Societies，2012，586（16）：2207-2211.

［7］SHIMADA K，ANAI S，F(xiàn)UJII T，et al.Syndecan-1（CD138）contributes to prostate cancer progression by stabilizing tumour-initiating cells.［J］.The Journal of pathology，2013，231（4）：495-504.

［8］GHARBARAN R，GOY A，TANAKA T，et al.Fibroblast growth factor-2（FGF2）and syndecan-1（SDC1）are potential biomarkers for putative circulating CD15+/CD30+cells in poor outcome Hodgkin lymphoma patients.［J］.Journal of hematology&oncology，Journal of Hematology&Oncology，2013，6（62）：62.

［9許州，袁先厚，江普查等.Aurora A、PCNA在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義［J］.武漢大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010（02）：227-229，136.

［10姚益群，劉莉萍，傅丹，等.膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織和血漿中MMP-9的表達(dá)及意義［J］.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2014，13（4）：322-325.

（責(zé)任編輯：甘章平）

Syndecan-1 knockdown inhibits the proliferation and invasion of A172 glioblastoma multiforme cells.

SHI Shuang，ZHONG Dong，WANG Bing，WANG Wentao，ZHANG Fuan，HUANG Haoyang.Department of Neurosurgery，The 1st Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Youyi Road，Chongqing 400016，China.Tel：023-89012163.

R739.41

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.02.003
☆重慶市科委自然科學(xué)基金科研項目（編號：cstc2011jjA10091）；財政部、衛(wèi)生部國家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項目［編號：財社（2001）170號］
*重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗研究中心（重慶 400016）

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2015-11-28）