腦膠質(zhì)瘤環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)

鄭克彬解靖李艷萌史帥史彥芳

腦膠質(zhì)瘤環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)

鄭克彬*解靖△李艷萌△史帥△史彥芳*

目的 探討環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測CREB在5例顱腦損傷減壓術(shù)后腦組織切片，55例不同分化程度腦膠質(zhì)瘤組織切片中的表達(dá)，并采用Western blot、RT-PCR檢測CREB在10例顱腦損傷減壓術(shù)后腦組織標(biāo)本，30例不同分化程度腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。結(jié)果 免疫組化法測得CREB的陽性表達(dá)率分別為對照組2/5，Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤10/15，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤11/12，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤28/28，免疫組化顯示數(shù)據(jù)總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（H=28.183，P＜0.05）。RT-PCR法檢測2-ΔΔCt值，對照組：1.00±0.00，Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤：1.35±0.07，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤：2.88±0.11，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤：3.75±0.20。腦膠質(zhì)瘤組織中CREB的表達(dá)均高于對照組腦組織，且各級(jí)別癌組織間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.208，P＜0.05）。Western blot法測得對照組：0.311±0.014，Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤：0.469±0.026，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤：0.641±0.028，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤：0.896±0.024，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.123，P＜0.05）。結(jié)論 CREB在不同分化程度腦膠質(zhì)瘤組織中均存在過表達(dá)現(xiàn)象，與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)，可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

腦膠質(zhì)瘤 CREB過表達(dá)

【Abstract】Objective To investigate the clinical significance and abnormal expression of the CREB in different grade gliomas.Methods The expression of CREB was examined by using immunohistochemistry in brain tissues from the brain injury（5 cases）and different grade gliomas（55 cases）.The mRNA and protein levels of CREB were further assessed using Western blot and RT-PCR in brain tissues from the patients with brain injury（10 cases）and those with different grade gliomas（30 cases）.Results The positive rates of CREB immunohistochemistry were 2/5 in control，10/15 in Ⅰ-，Ⅱ11/12 inⅢ，28/28 inⅣ.The positive rates of CREB were significantly different among different groups（H= 28.183，P＜0.05）.The mRNA levels of CREB were 1.00±0.000 in control，1.35±0.068 inⅠ-Ⅱ，2.88±0.111 inⅢand 3.75±0.196 inⅣ.The expression of CREB was higher in the glioma than in control group，and the mRNA levels of CREB were significantly different among different groups（F=1.208，P＜0.05）.The protein levels of CREB were 0.311± 0.014 in control，0.469±0.026 inⅠ-Ⅱ，0.641±0.028 inⅢand 0.896±0.024 inⅣ.The protein levels of CREB were significantly different among different groups（F=1.123，P＜0.05）.Conclusion The expression of CREB is elevated in gliomas with different differentiation degrees.The expression of CREB was positively correlated with the degree of differentiation，indicating that CREB may have an important regulatory role in the progress of gliomas.

【Key words】Glioma CREB Over-expression

膠質(zhì)瘤目前是神經(jīng)外科領(lǐng)域常見的惡性腫瘤之一，它是發(fā)生于神經(jīng)外胚層，由間質(zhì)細(xì)胞及實(shí)質(zhì)細(xì)胞形成的腫瘤。近年來有關(guān)資料顯示CREB高表達(dá)與多種類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過免疫組化法（Immunohistochemistry，IHC）、蛋白質(zhì)印記法（Western blot，WB）和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RealtimePCR，RT-PCR）的方法在組織水平、基因水平以及蛋白水平探究目的蛋白CREB在不同腦組織的表達(dá)情況，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CREB與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征之間的關(guān)系，進(jìn)而了解CREB在腦膠質(zhì)瘤中的臨床意義，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1　對象與方法

1.1研究對象收集2010年1月至2012年12月河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科經(jīng)病理證實(shí)腦膠質(zhì)瘤患者30例，男18例，女12例，其中Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤病例10例，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤病例10例，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤病例10例，并采取10例顱腦損傷減壓術(shù)后腦組織作為空白對照，其中男6例，女4例。所選病例年齡25～65歲，平均（53±10）歲。術(shù)后標(biāo)本均儲(chǔ)存于-80℃冰箱保存。另在我院病理科采用60例于2010年至2012年手術(shù)切除且保存完好的組織病理切片，所有切片均以雙盲法經(jīng)病理醫(yī)師進(jìn)行診斷，其中包含5例因顱腦損傷性減壓術(shù)后的標(biāo)本作為空白對照，其余為各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤病例，標(biāo)本均在切除術(shù)后用生理鹽水洗凈，10%的福爾馬林浸泡固定蛋白，石蠟包埋，保存在4℃冰箱備用。60例標(biāo)本臨床資料完整，其中男31例，女29例，年齡在27～73歲，平均（45±11）歲。其中顱腦損傷減壓術(shù)后腦組織5例，Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤病例15例，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤病例12例，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤病例28例。以上組織學(xué)分析按照WHO（2000）膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。所有患者術(shù)前未行放化療，組織標(biāo)本均取自大腦皮層，所取標(biāo)本均已通過患者本人或家屬以及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，對照組的一般人口學(xué)資料與膠質(zhì)瘤組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。主要試劑與儀器：CREB小鼠單抗及GAPDH兔單抗購自Affinity公司，RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購自Aidlab公司，PCR擴(kuò)增儀（Thermo）、Western blot發(fā)光儀（C-DiGit）、尼康熒光倒置顯微鏡（ECLIPSE Ti-S）、酶標(biāo)儀ELx800（Bio-Tek）。

1.2免疫組織化學(xué)SP法檢測 將石蠟切片脫蠟，3%甲醇-過氧化氫浸泡，檸檬酸修復(fù)液抗原修復(fù)，一抗4℃過夜，二抗、三抗各孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染對比，脫水、樹膠封片等具體操作步驟按常規(guī)進(jìn)行。所有步驟之間經(jīng)PBS緩沖液漂洗3×5min，用PBS作為一抗陰性對照。CREB表達(dá)主要位于胞漿中，偶有胞核的表達(dá)，免疫組化染色后陽性結(jié)果呈黃色、棕黃色或棕褐色。在高倍鏡（10×20）下，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞以上，計(jì)算腫瘤細(xì)胞陽性率：染色細(xì)胞＜5%為0分，≥5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%為3分。陽性著色標(biāo)準(zhǔn)為：無色為0分；黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐為3分，以上兩種評分相乘，結(jié)果3分以下記陰性（-），3分記弱陽性（+），4分以上記強(qiáng)陽性（++）［1］。

1.3蛋白質(zhì)印跡檢測 -80℃冰箱中（術(shù)中的新鮮標(biāo)本）組織加入冰凍的RIPA（蛋白裂解液），研磨，按100：1的比例加入PMSF，冰上操作。然后4℃，12000r/min，10min，離心，-20℃保存?zhèn)溆?。常?guī)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗4℃過夜（CREB 1：500，GAPDH 1：8000），二抗（CREB 1：5000，GAPDH 1：5000）37℃，2h，A、B液暗室發(fā)光及熒光影像分析。

1.4RT-PCR檢測將標(biāo)本從-80℃冰箱中取出，按試劑盒說明書，進(jìn)行RNA的提取，-20℃保存。取1μg的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。CREB引物：F 5'-TGCCACATTAGCCCAGGTATC-3'，R 5'-TTCTTCAATCCTTGGCACTCC-3'；GAPDH引物：F5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，R 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'，PCR反應(yīng)體系采用25μL，每組實(shí)驗(yàn)做2個(gè)副孔，精確實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后采用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。結(jié)果參照CREB基因CT值，計(jì)算CREB mRNA的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法［2］，同時(shí)測定標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增效率。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料樣本數(shù)據(jù)以x±s表示，多個(gè)樣本的比較采用方差分析（ANOVA S-N-K）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2　結(jié)果

2.1免疫組化檢測CREB在組織中的表達(dá) 顱腦損傷減壓術(shù)后腦組織切片中，CREB的表達(dá)量較少，主要位于胞漿中，偶有胞核的表達(dá)；在人腦膠質(zhì)瘤組織切片中，CREB的表達(dá)量隨著腫瘤級(jí)別的不同，表達(dá)量有所不同，高級(jí)別的腫瘤CREB在胞漿中的表達(dá)逐漸上升，表達(dá)量隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高逐漸升高（H=28.183，P＜0.05）。見表1。由免疫組化切片可見，CREB在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，明顯高于空白對照組腦組織切片，并且隨著病理分級(jí)的增加，CREB在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)量逐漸增高。

表1 CREB在60例人腦組織中免疫組化定性分析

圖1 CREB在減壓術(shù)后腦組織及各個(gè)級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（SP，× 200，標(biāo)尺=50μm）。A：CREB在顱腦損傷減壓術(shù)后腦組織中表達(dá)的量很少，著色評分為0（0×1）；B：CREB在Ⅰ-Ⅱ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織中的成弱陽性，著色評分為3（1×3）；C：CREB在Ⅲ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織中的成強(qiáng)陽性，著色評分為6（2×3）；D：CREB在Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織中的成強(qiáng)陽性，著色評分為9（3×3）

2.2 RT-PCR、Western blot檢測CREB在組織蛋白中的表達(dá) CREB在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與顱腦損傷減壓術(shù)后腦組織相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CREB/GAPDHF=1.123，P＜0.05；RT-PCRF=1.208， P＜0.05），都高于對照組的腦組織，且各個(gè)級(jí)別膠質(zhì)瘤腦組織之間表達(dá)量仍有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著腫瘤級(jí)別的增高，表達(dá)量逐漸增大。見表2。

表2　CREB在40例人腦組織中相對定量分析

圖2 Western blot法檢測CREB在顱腦損傷減壓術(shù)后腦組織及各個(gè)級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)量結(jié)果

3　討論

隨著社會(huì)生活環(huán)境的改變，由于人們身邊接觸的致癌因素加之遺傳因素的影響，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率逐年提高。作為多種腫瘤中高表達(dá)的蛋白，CREB可以與CRE基因特異性結(jié)合，結(jié)合后CRE的下游基因轉(zhuǎn)錄活性會(huì)大大提高，并且它可以通過cAMP信號(hào)通路、Ca2+-CaMK、RAS/ERK、PI3K/AKt等多種磷酸化信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能［3，4］。CREB的這種活性在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。

本次實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，CREB在人腦膠質(zhì)瘤中也存在高表達(dá)的現(xiàn)象。CREB的異常表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。我們的通過免疫組化法的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CREB在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)量明顯高于取自顱腦損傷減壓術(shù)的腦組織，且隨著IHC評分的增高，腫瘤的級(jí)別也在升高，說明CREB表達(dá)水平的上調(diào)與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度有關(guān)，腫瘤惡性程度越高，CREB的相對表達(dá)量也就越高，提示CREB參與腫瘤的進(jìn)展。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們進(jìn)行了以下基因及蛋白水平的實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)原癌基因CREB mRNA表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)，致使膠質(zhì)瘤組織中CREB蛋白過表達(dá)，CREB蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)可能參與腫瘤細(xì)胞中下游基因的活化、細(xì)胞凋亡、癌細(xì)胞的周期運(yùn)轉(zhuǎn)等作用，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。我們還發(fā)現(xiàn)CREB的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，惡性程度越高的膠質(zhì)瘤組織中的CREB表達(dá)量也就越高。本研究結(jié)果顯示：Ⅰ-Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中CREB蛋白的表達(dá)水平隨腫瘤級(jí)別的升高而上升。我們進(jìn)一步通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)CREB mRNA的相對表達(dá)量也隨腫瘤級(jí)別的升高而上升，組間比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），上述結(jié)果表明CREB在誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增值、分化過程中起著重要作用。我們在查閱CREB相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道CREB在T細(xì)胞白血病、卵巢癌、肺癌中的異常表達(dá)與癌細(xì)胞粘附、浸潤與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5-7］。我們的結(jié)果以及以往的研究均提示CREB參與了腫瘤的進(jìn)展。我們之后查閱關(guān)于膠質(zhì)瘤患者生存期的文獻(xiàn)，Log-rank統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示單因素分析中病理學(xué)分級(jí)與膠質(zhì)瘤患者的生存期呈正相關(guān)［8］。通過以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)病理分級(jí)越高，CREB表達(dá)量越高，生存率越低，CREB可能成為早期篩查惡性腫瘤以及生存期評估的最新分子標(biāo)志物，從而為研發(fā)新的抗腫瘤藥物提供思路。另外通過本次研究采用的免疫組化法以及半定量WB、RT-PCR法，我們發(fā)現(xiàn)由于免疫組化得出的數(shù)據(jù)為計(jì)數(shù)資料，結(jié)果為我們?nèi)庋墼u分得出，可能會(huì)帶有一些主觀性，并且沒有嚴(yán)格的界限標(biāo)準(zhǔn)，這種計(jì)數(shù)方法會(huì)有許多不確定的結(jié)果出現(xiàn)。對于非參數(shù)的評分資料，統(tǒng)計(jì)方法的選用也相對比較窄，不能采用方差分析以及T檢驗(yàn)，多數(shù)只能選用秩和檢驗(yàn)來分析數(shù)據(jù)，而且相對于計(jì)量資料，計(jì)數(shù)資料效能也比較低。免疫組化法我們多可以看出目的蛋白在組織內(nèi)表達(dá)的一個(gè)大體趨勢以及在細(xì)胞表達(dá)部位等，而對于是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為了結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性，通過WB、RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證也是有必要的，單獨(dú)的免疫組化結(jié)果則需謹(jǐn)慎對待，并作其他相關(guān)檢測。

通過以上結(jié)果我們推測，當(dāng)特異性的沉默膠質(zhì)瘤中CREB的表達(dá)會(huì)對膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響。之后我們將在U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中對CREB進(jìn)行敲低及過表達(dá)處理，來深入探討它的分子作用機(jī)制以及對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和血管生成的影響，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新的依據(jù)。

［1］CHEN G，LUO D.Over-expression of decoy receptor 3 in gastric precancerous lesions and carcinoma［J］.Ups J Med Sci，2008，113（3）：297-304.

［2何偉，楊炎林，沈曉黎，等.RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子與缺氧誘導(dǎo)因子-1α在AtT-20細(xì)胞的表達(dá)［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2015，41（6）：365-369.

［3］LEE HY，CRAWLEY S，HOKARI R，et al.Bile acid reguhte8 MUC2 transcriptioni in colon cancer cells via positive EGFR/ PKC/Ras/ERK/CREB，PDK/Akt/IkappaB/NF-kappaB and p38/MSKI/CREB pathways and negative JNK/ c-Jun/AP一1 pathway［J］.Int J OncoI，2010，36（4）：941-953.

［4］COMUZZI B，LAMBRINIDIS L，ROGATSCH H，et al.The transcniptional co-activator cAMP response element-binding protein-binding protein is expressed in prostate cancer and enhances androgen-and anti-androgen—induced androgen receptorfunction［J］.Am J Pathol，2003，162（1）：233-241.

［5肖佩芳，柴憶歡，何軍，等.環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)的意義［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2008，23（3）：200-202.

［6葉麗平，馬靜方，楊春雨.CREB特異性siRNA對人卵巢癌CAOV3細(xì)胞增殖的影響［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（47）：40-41.

［7吳勇，薛孟華，劉偉.非小細(xì)胞肺癌CREB表達(dá)的臨床意義［J］.中華胸心血管外科雜志，2010，26（6）：403-404.

［8韓戰(zhàn)栓，陳素娟，王紅濤.腦膠質(zhì)瘤術(shù)后預(yù)后的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析［J］.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2009，23（5）：517-519.

（責(zé)任編輯：甘章平）

The expression of CREB in the Glioma.

ZHENG Kebin，XIE Jing，LI Yanmeng，SHI Shuai，SHI Yanfang.Department of Neurosurgery，Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China.Tel：0312-5981201.

R739.41

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.02.002
*河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（保定071000）△河北大學(xué)

（E-mail：736490196@qq.com）

2015-09-29）