iTRAQ技術(shù)在消化道腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展

陳敏 劉莉萍 綜述 張玲 審校

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它能夠?qū)?xì)胞和組織內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、修飾、功能和表達(dá)情況等信息進(jìn)行大規(guī)模、全方位的研究。在過(guò)去幾十年中，針對(duì)消化道惡性腫瘤的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，但在腫瘤的發(fā)生機(jī)制、臨床檢測(cè)以及治療預(yù)后等方面仍有待進(jìn)步。iTRAQ技術(shù)作為一種新的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在消化道腫瘤的應(yīng)用中比以往雙向電泳技術(shù)、同位素親和標(biāo)記技術(shù)具有更加明顯的優(yōu)勢(shì)[1]，該技術(shù)不僅可以為疾病做出早期檢測(cè)，而且可以用來(lái)闡明疾病的復(fù)雜分子機(jī)制，更能為消化道腫瘤治療和預(yù)后提供更有效的方法。事實(shí)上，許多其他惡性疾病的研究中已經(jīng)用iTRAQ結(jié)合LC/MS等技術(shù)來(lái)研究蛋白質(zhì)組譜，該技術(shù)亦有可能為探索消化道腫瘤提供一種全新的方法。因此本文分析相關(guān)文獻(xiàn)資料后，現(xiàn)就iTRAQ技術(shù)在消化道腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 iTRAQ技術(shù)在食管癌領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

食管癌包括食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma，EAC)，是第八大常見的癌癥，也是全球與癌癥相關(guān)的第六大常見的死亡原因，其中ESCC在全球范圍內(nèi)較為普遍，占全部食管癌的90%[2]。雖然早期診斷、手術(shù)策略以及輔助治療等方法對(duì)于食管癌的發(fā)生發(fā)展有所改善，但ESCC患者的預(yù)后仍然很差，5年總生存率僅為15%～25%[3]。許多研究發(fā)現(xiàn)NK1R的高表達(dá)預(yù)示著疾病已發(fā)展至晚期并提示更差的預(yù)后。在2019年Wang等[4]采用免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡分析等方法檢測(cè)了NK1R在人ESCC細(xì)胞系EC109中的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)NK1R在ESCC上調(diào)，其過(guò)表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤浸潤(rùn)深度、神經(jīng)周圍浸潤(rùn)程度相關(guān)，最終導(dǎo)致總生存率降低。并通過(guò)iTRAQ蛋白譜和生物信息學(xué)分析進(jìn)一步研究NK1R在ESCC增殖中作用的下游機(jī)制。結(jié)果表明，與EC109-NK1R-NC(陰性對(duì)照)細(xì)胞相比，EC109-NK1R-KD(NK1R敲除)細(xì)胞中有440種蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變化(84種蛋白質(zhì)上調(diào)，356種蛋白質(zhì)下調(diào))，并進(jìn)一步分析鑒定了15個(gè)分子，其中Hes1被鑒定為有功能相關(guān)性和表達(dá)意義的目標(biāo)。因此他們假設(shè)NK1R通過(guò)調(diào)節(jié)Hes1的表達(dá)，并最終促進(jìn)ESCC的細(xì)胞增殖。這一研究中iTRAQ技術(shù)為進(jìn)一步探究食管腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制提供了易操作性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。此外有研究發(fā)現(xiàn)，ILK的異常表達(dá)與ESCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Ma等[5]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選與ESCC放化療療效相關(guān)的血清差異表達(dá)蛋白。結(jié)果顯示食管癌患者(放化療前)的ILK表達(dá)水平高于對(duì)照組(放化療后)，放化療敏感患者的ILK表達(dá)水平低于放化療耐受組。這些發(fā)現(xiàn)表明ILK的異常表達(dá)可能與ESCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，ILK可能參與放化療敏感性調(diào)節(jié)。通過(guò)進(jìn)一步研究ILK表達(dá)對(duì)ESCC細(xì)胞特性的影響，目前的研究首次表明ILK沉默顯著抑制增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)ESCC細(xì)胞凋亡。綜上所述，運(yùn)用iTRAQ技術(shù)不僅能探究食管癌細(xì)胞的增殖機(jī)制，而且可以深入了解食管癌放化療耐藥的分子機(jī)制，探索靶向放化療耐藥的新策略，這將對(duì)食管癌患者提高治療效果具有重要的臨床意義。

2 iTRAQ技術(shù)在胃癌領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

胃癌是具侵襲性的惡性腫瘤之一。全球有近100萬(wàn)病例，在全球癌癥發(fā)病率位居第五，死亡率位居第三[6]。目前胃癌生物標(biāo)志物顯示出臨床診斷敏感性和特異性不足[7]，所以迫切需要更可靠的臨床生物標(biāo)志物，并開發(fā)準(zhǔn)確有效的胃癌診斷方法，尤其是早期篩查方法。有研究發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞和胃癌細(xì)胞之間異常表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白可能用于發(fā)現(xiàn)新的胃癌生物標(biāo)志物。Yang等[8]使用iTRAQ試劑分別對(duì)非癌細(xì)胞HFE145和癌細(xì)胞MKN7進(jìn)行標(biāo)記，共鑒定了873種蛋白質(zhì)，其中175種蛋白質(zhì)在非癌上皮細(xì)胞和胃癌上皮細(xì)胞之間的表達(dá)有大于1.3倍的差異。而在這其中，74種蛋白在胃癌中表達(dá)不足，而與非癌細(xì)胞相比，101種蛋白在胃癌中表達(dá)過(guò)量。而后用蛋白質(zhì)印跡分析驗(yàn)證iTRAQ數(shù)據(jù)，證明SLC3A2和LAMP-2是潛在的新型胃癌相關(guān)蛋白。因此用穩(wěn)定同位素定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，從正常細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中提取富含膜樣品的整體蛋白質(zhì)組，將把生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域引入新的可能。迄今為止包括化療、放療和手術(shù)在內(nèi)的多模式治療策略已經(jīng)顯著限制了胃癌的進(jìn)展，并且全身轉(zhuǎn)移率已經(jīng)顯著降低。然而，腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是胃癌患者死亡的主要原因。Li等[9]采用iTRAQ技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)等方法，證明了CLIC1表達(dá)下調(diào)能有效抑制胃癌在體內(nèi)外的遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并不同程度地改變ITG家族蛋白(包括ITGα1、ITGα3、ITGαv和ITGβ1)的表達(dá)。此外，胃癌作為影響人類的最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其早期癥狀較隱匿，一般確診胃癌時(shí)已是進(jìn)展期胃癌，因此抑制胃癌細(xì)胞的增殖成為目前治療胃癌的方法之一。近年來(lái)大蒜素(Diallyl trisulfide，DATS)對(duì)消化道腫瘤細(xì)胞的抑制作用越來(lái)越受到腫瘤研究領(lǐng)域的關(guān)注和重視，大量研究提示大蒜素可以抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[10]。王浩冉等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞(BGC823)同步化后再次加入DATS處理12 h，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的比例增加，提示DATS處理后引起細(xì)胞中期阻滯和凋亡的增加，可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生有絲分裂危象，但有絲分裂危象最終通過(guò)何種途徑引起細(xì)胞死亡以及DATS在誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生有絲分裂危象時(shí)的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、生物功能及細(xì)胞信號(hào)通路，還有待深入研究。因此在本項(xiàng)目的后續(xù)研究中，要運(yùn)用iTRAQ和IPA相結(jié)合的方法，多重網(wǎng)絡(luò)比較分析DATS同步化調(diào)控與非同步化調(diào)控胃癌細(xì)胞后兩組差異蛋白以及關(guān)鍵信號(hào)通路，并對(duì)有絲分裂危象進(jìn)行深入研究，以期為DATS誘導(dǎo)治療胃癌提供理論依據(jù)。

3 iTRAQ技術(shù)在肝癌領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床最難治療的惡性腫瘤之一，2018年其致死率在全球常見癌癥中位居第四，僅次于肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌[12]。雖然我們對(duì)HCC已經(jīng)有了越來(lái)越深入的了解，然而對(duì)于HCC發(fā)生的分子作用機(jī)制仍然知之甚少。Cheng等[13]在37對(duì)HCC組織及其鄰近的非腫瘤組織中檢測(cè)了miR-449a的表達(dá)，與鄰近的非腫瘤組織相比，在HCC組織中發(fā)現(xiàn)miR-449a的表達(dá)顯著降低。為了闡明受miR-449a表達(dá)降低影響的分子事件，在miR-449a丟失或獲得后，在HCC細(xì)胞系Bel-7402中應(yīng)用iTRAQ技術(shù)和2D液相色譜-質(zhì)譜分析鑒定和定量了3702個(gè)非冗余蛋白質(zhì)，IPA分析在調(diào)節(jié)蛋白中鑒定出幾個(gè)與HCC發(fā)展有關(guān)的重要蛋白質(zhì)，包括HDAC1、CDK6、MET、TPD52、BAG1、RPS27L、TAX1BP3、TAGLN和TFCP2。iTRAQ技術(shù)和IPA分析揭示了miR-449a通過(guò)靶向CDK6和細(xì)胞周期蛋白D1來(lái)阻止G1階段，抑制細(xì)胞增殖、減弱侵襲力，抑制HCC的發(fā)生發(fā)展。此外治療后的高轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率是許多肝癌患者的致命臨床因素，所以若能找到HCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的靶點(diǎn)，則有望提高肝癌患者的生存率。Lin等[14]應(yīng)用iTRAQ蛋白組學(xué)分析和細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究了HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，表明了CD9可能促進(jìn)HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這些研究結(jié)果表明，通過(guò)iTRAQ技術(shù)和IPA分析等方法探索HCC分子之間的內(nèi)在聯(lián)系和相互作用有助于理解HCC腫瘤的發(fā)展機(jī)制，或許可以為HCC的治療開發(fā)更有效的方法；而理解腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制對(duì)于開發(fā)針對(duì)HCC的有效治療靶標(biāo)亦至關(guān)重要，甚至可能為HCC的預(yù)后提供新的可能。

4 iTRAQ技術(shù)在膽道腫瘤領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

膽管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)是一種起源于膽管上皮的異質(zhì)性惡性腫瘤，是膽道最常見的原發(fā)性惡性腫瘤[15]，不可切除CCA患者的中位生存期不到1年[16]。對(duì)于接受根治性切除手術(shù)的患者，預(yù)后要好得多，5年生存率約20%～40%[17]。然而即使結(jié)合非特異性生物標(biāo)志物，以及使用先進(jìn)的成像技術(shù)也難以在早期檢測(cè)CCA，晚期膽管惡性腫瘤施行外科手術(shù)以及化療的療效也均差強(qiáng)人意[18]。Ren等[19]使用iTRAQ和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定富含鉻化砷酸銅細(xì)胞的分泌蛋白，并與正常膽管上皮細(xì)胞系進(jìn)行比較，共有778種蛋白質(zhì)被鑒定為差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并使用生物信息學(xué)分析進(jìn)行分類。最后，他們確認(rèn)腫瘤蛋白D52(TPD52)和DnaJ熱休克蛋白家族(Hsp40)成員B1(DNAJB1)為生物標(biāo)志物，其在CCA細(xì)胞中上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)TPD52和DNAJB1的過(guò)表達(dá)可能預(yù)示著CCA患者的不良預(yù)后，這項(xiàng)研究的結(jié)果可能為CCA的診斷和治療提供新的見解。此外，Tang等[20]使用iTRAQ技術(shù)結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)技術(shù)在6對(duì)原發(fā)癌和癌周組織中，共鑒定出了2 886個(gè)蛋白質(zhì)(≥95%的置信度)。其中，233種蛋白在癌旁組織和癌組織中差異表達(dá)(99種上調(diào)，134種下調(diào))。然后選擇了差異表達(dá)蛋白質(zhì)中具有特異性的PRDX2、BGN、LUM和PP3CA作為潛在的生物標(biāo)志物用于進(jìn)一步的檢測(cè)，最后發(fā)現(xiàn)PP3CA是CCA患者獨(dú)立的不良預(yù)后因素，也是預(yù)測(cè)手術(shù)切除CCA患者預(yù)后的具有重要作用的標(biāo)記?？梢姡叩鞍踪|(zhì)組覆蓋率和高標(biāo)記效率的iTRAQ技術(shù)已經(jīng)成為預(yù)測(cè)CCA患者診斷和預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物的一種有前途的技術(shù)。

5 iTRAQ技術(shù)在胰腺癌領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

胰腺癌是目前最嚴(yán)重的消化道惡性腫瘤之一，具有癥狀不典型疾病進(jìn)展迅速的特點(diǎn)，臨床上沒(méi)有敏感的早期診斷指標(biāo)[21]。因此迫切需要在胰腺癌上進(jìn)行更加深入的研究，應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)來(lái)增加對(duì)這種疾病的了解，提高對(duì)無(wú)癥狀胰腺癌患者的診斷能力。鑒于胰腺癌無(wú)癥狀的性質(zhì)，微創(chuàng)的血液化驗(yàn)依然是首選[22]。Li等[23]收集了健康個(gè)體、良性疾病患者和胰腺癌患者的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，采用iTRAQ-2D-MS/MS和SWATH方法對(duì)PBMCs進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果共鑒定出3 357個(gè)蛋白質(zhì)，其中胰腺癌組發(fā)現(xiàn)差異蛋白114個(gè)(上調(diào)蛋白35個(gè)，下調(diào)蛋白79個(gè))。根據(jù)生物信息學(xué)分析，AOPA1和CCS具有顯著的上下調(diào)節(jié)，于是選擇了APOA1和CCS進(jìn)行蛋白免疫印跡驗(yàn)證，結(jié)果證明這兩種蛋白可以顯著區(qū)分胰腺癌組與對(duì)照組，可能是血中胰腺癌的臨床相關(guān)生物標(biāo)志物，提示它們可能作為PBMCs中的生物標(biāo)志物來(lái)診斷胰腺癌。顯然，高效的iTRAQ技術(shù)在血液生物標(biāo)志物的大規(guī)模樣本分析中展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。其次，雖然胰腺癌手術(shù)方式和放化療方案有了長(zhǎng)足發(fā)展，但胰腺癌仍然是致死率最高的惡性腫瘤，5年總生存率僅約為4%[24]。Lei等[25]采用原位雜交和快速定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法，證明lincRNA00976在胰腺癌組織和細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá)，并與胰腺癌患者的較差生存率呈正相關(guān)。功能研究顯示lincRNA00976敲除在體內(nèi)和體外顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而其過(guò)度表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)，而后使用iTRAQ分析發(fā)現(xiàn)OTUD7B是介導(dǎo)胰腺癌發(fā)生的lincRNA00976的功能宿主基因，并促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。因此，iTRAQ技術(shù)對(duì)于進(jìn)一步研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分重要，特別是尋找有效的治療靶點(diǎn)，并且對(duì)于提高胰腺癌的療效和預(yù)后具有重要意義。

6 iTRAQ技術(shù)在結(jié)直腸惡性腫瘤領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，在全球癌癥發(fā)病率中，結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率在人群中排名第三，死亡率排名第二[26]。盡管早期診斷使結(jié)直腸癌的5年相對(duì)生存率有所提高，但結(jié)直腸癌仍然是最致命的惡性腫瘤之一。大約60%的患者確診時(shí)已處于晚期，其5年生存率在13%左右[27]。因此了解結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制將有助于改善早期檢測(cè)和預(yù)后，并提供新的治療靶點(diǎn)。Peng等[28]用iTRAQ技術(shù)聯(lián)合2D液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析鑒定人結(jié)腸上皮細(xì)胞致癌過(guò)程中有326種蛋白質(zhì)為差異表達(dá)蛋白。免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證了4個(gè)在致癌過(guò)程中發(fā)生進(jìn)展性改變的差異表達(dá)蛋白質(zhì)(DMBT1、S100A9、半乳糖凝集素-10、S100A8)，結(jié)果表明差異表達(dá)蛋白質(zhì)參與多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附、翻譯、基因加工和蛋白質(zhì)合成。這些發(fā)現(xiàn)為我們理解結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制提供了基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步研究癌變和鑒定生物標(biāo)志物提供了線索。此外，基于結(jié)直腸癌早期癥狀隱匿，晚期化療藥物的不良反應(yīng)大，耐受性差等原因，尋找結(jié)直腸癌最佳藥物治療就具有了重要意義。Chen等[29]研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷可以引起線粒體損傷和G2/M細(xì)胞周期阻滯，并顯著抑制人HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。進(jìn)一步應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)方法，有288種明顯不同的蛋白質(zhì)在薯蕷皂苷的反應(yīng)中表達(dá)，它們相互關(guān)聯(lián)并參與不同基因組途徑。然后將一些參與氧化磷酸化、Wnt、p53和鈣信號(hào)通路的差異表達(dá)蛋白通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，表明這些蛋白可能是未來(lái)結(jié)直腸癌治療的有用靶點(diǎn)。

7 小結(jié)與展望

iTRAQ技術(shù)定量蛋白質(zhì)組學(xué)作為蛋白質(zhì)研究的前沿學(xué)科，不僅有助于揭示生命活動(dòng)規(guī)律，還能為眾多疾病發(fā)病機(jī)理的闡明提供理論依據(jù)，它所具有的大規(guī)模、高通量等優(yōu)勢(shì)為消化道惡性腫瘤的機(jī)制研究提供了新的可能。大量研究也均已證實(shí)，通過(guò)利用iTRAQ技術(shù)可以對(duì)消化道腫瘤進(jìn)行全面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究并具有良好的重復(fù)性、可信性及敏感性。但是該技術(shù)仍存在其缺陷，如iTRAQ試劑比較昂貴、iTRAQ標(biāo)記的樣本因先經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化造成了樣本處理過(guò)程中可能產(chǎn)生誤差等。很顯然，重大挑戰(zhàn)仍然存在于蛋白組學(xué)研究中，因此如何將iTRAQ技術(shù)更好的應(yīng)用在消化道腫瘤蛋白組學(xué)中可謂任重而道遠(yuǎn)。