牛病毒性腹瀉病毒SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

任亞初 朱彤 楚會(huì)萌 程凱慧 解曉莉 張亮 孫陽陽 楊宏軍

摘要：本研究旨在建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，能快速檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的方法。根據(jù)BVDV的E2基因保守序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，建立了檢測(cè)BVDV的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。將標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品10倍梯度稀釋檢測(cè)靈敏度，用能感染奶牛的其它病毒做對(duì)照檢測(cè)特異性，用臨床樣本檢測(cè)重復(fù)性。結(jié)果表明，該方法與能感染奶牛的其它幾種病毒均無交叉反應(yīng)，檢出敏感度達(dá)4.87 × 101 copies/μL，比常規(guī)PCR檢測(cè)方法高10倍。同時(shí)檢測(cè)了5個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)送檢的67份奶牛腹瀉樣本，其BVDV檢出率為46.27%（31/67）。本研究成功建立了BVDV SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為BVDV的快速診斷和定量分析提供了技術(shù)支撐，具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）;熒光定量PCR;E2基因;檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S858.23?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A?文章編號(hào)：1001-4942（2019）12-0106-05

Abstract?The experiment was conducted to establish a method to rapidly detect bovine viral diarrhea virus with high sensitivity， high specificity and good reproducibility. In the study， a pair of specific primers were designed and synthesized according to the conservative sequence of E2 gene in BVDV， and the SYBR Green Ⅰquantitative real-time PCR detection method was established. The standard positive samples were diluted 10 times gradient to detect sensitivity. The specificity was tested with other viruses that could infect the cow， and the repeatability was tested with clinical samples. The results showed that this method did not have cross-react with other cow viruses， and the detection sensitivity was up to 4.87×101 copies/μL， which was 10 times higher than that of the conventional PCR method. At the same time， 67 diarrhea samples from 5 large-scale dairy farms were tested， and the detection rate of BVDV was 46.27% （31/67）. The study successfully established BVDV SYBR Green Ⅰ quantitative real-time PCR detection method， and provided?technical support for the rapid diagnosis and quantitative analysis of BVDV. It would have a better application prospect.

Keywords?Bovine viral diarrhea virus （BVDV）; Quantitative real-time PCR; E2 gene; Detection

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea， BVD）又稱牛病毒性腹瀉-黏膜病（bovine viral diarrhea-mucosal disease， BVD - MD），是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus， BVDV）引起的一種急性傳染病[1]。感染牛病毒性腹瀉病毒，輕則腹瀉、發(fā)熱、口腔及消化道粘膜發(fā)炎糜爛，重則可導(dǎo)致懷孕母牛流產(chǎn)、死胎、犢牛持續(xù)感染甚至死亡[2]。BVDV除感染牛外，還可感染豬、鹿、羊、駱駝、兔及其他野生動(dòng)物，宿主相當(dāng)廣泛[3]。隨著規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，BVDV的流行規(guī)模也在不斷加大，呈世界性分布，給畜牧業(yè)造成了巨大損失[4]。該病的防控方法中，有效檢出并及時(shí)淘汰是凈化畜群的重要手段[5]。因此，建立高效準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)該病的臨床診斷、檢疫、流行病學(xué)調(diào)查、凈化及防治提供了有效的技術(shù)手段。

目前，牛病毒性腹瀉-粘膜病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有病毒的分離和鑒定[6]、免疫熒光試驗(yàn)[7]、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）[8]、微量血清中和試驗(yàn)[9]、抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[10]和常規(guī)PCR方法[11]等。這些方法都各有其自身的優(yōu)點(diǎn)和適用性，但又存在缺陷。本研究利用BVDV的E2基因保守序列[12]設(shè)計(jì)引物，建立牛病毒性腹瀉病毒SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，以期提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性，為簡便省時(shí)、適于大規(guī)模 BVDV 感染的病原流行病學(xué)調(diào)查和BVDV臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支撐。

1?材料與方法

1.1?毒株和樣品來源

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛腸道病毒（bovine enterovirus，BEV）、牛副流感3型病毒（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）、牛流行熱病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）等相關(guān)病毒核酸，均為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心疾病研究室保存。臨床檢測(cè)樣品來自2019年山東省、江蘇省、天津市的5個(gè)規(guī)?；翀?chǎng)送檢樣品。

1.2?主要試劑與儀器

SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒和病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司;Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀，羅氏公司;2×Easy Taq PCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pClone 007 Blunt Vector Kit，購自北京擎科生物技術(shù)有限公司。

1.3?引物的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中牛病毒性腹瀉病毒的全基因組核酸序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增BVDV的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR引物，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.4?病毒RNA提取和cDNA合成

取200 μL BVDV病毒原液，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取BVDV病毒基因組RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5?陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以提取的BVDV病毒基因組cDNA為模板，BVDV-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，回收目的片段，連接至pClone 007載體，鑒定正確的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，命名為pClone 007-E2。測(cè)定質(zhì)粒濃度，按照以下公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)： 拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度×10-9×6.02×1023/（660×質(zhì)粒長度），將pClone 007-E2質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，放于-20℃冰箱備用。

1.6?建立SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法

以pClone 007-E2質(zhì)粒為模板，采用方陣法對(duì)引物濃度（5～20 pmol/L）、退火溫度（55～62℃）進(jìn)行摸索，最終選取Ct最小值、熒光最高值、熔解曲線特異性明顯的PCR反應(yīng)條件。

采用優(yōu)化完成的反應(yīng)條件，以10倍梯度稀釋后的陽性標(biāo)準(zhǔn)品pClone 007-E2為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7?敏感性試驗(yàn)

以稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，陰性對(duì)照以ddH2O為模板，進(jìn)行BVDV的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品做3個(gè)樣本檢測(cè)。同時(shí)相同濃度下進(jìn)行常規(guī)PCR試驗(yàn)，分析對(duì)比兩種方法的敏感性。

1.8?特異性試驗(yàn)

用已建立的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，分別以BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV的基因組作為模板，并以ddH2O為陰性對(duì)照，分析該方法的特異性。

1.9?重復(fù)性試驗(yàn)

分別取等量的4份不同拷貝（4.87×103 copies/μL，4.87×104 copies/μL，4.87×105 copies/μL，4.87×106 copies/μL）的pClone 007-E2重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)（同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照），每份拷貝樣品做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，通過計(jì)算 Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差（S）和變異系數(shù)（CV）驗(yàn)證熒光定量 PCR的批內(nèi)重復(fù)性。另外，取以上4份樣品，在同一反應(yīng)條件下間隔7 d重復(fù)一次獨(dú)立的熒光定量PCR檢測(cè)，共重復(fù)3次，然后計(jì)算 Ct值的變異系數(shù)（CV），驗(yàn)證此方法的批間重復(fù)性。

1.10?臨床樣品的檢測(cè)

采用本試驗(yàn)建立的 IBRV SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)5個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)送檢的67份奶牛腹瀉樣品，同時(shí)利用普通PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較二者的檢出率，并計(jì)算二者的符合率。

2?結(jié)果與分析

2.1?質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定

以BVDV基因組cDNA為模板，利用特異性引物BVDV-F和BVDV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約185 bp左右的目的片段，與預(yù)期片段大小相同，無其他非特異性條帶，陰性對(duì)照無條帶（圖1）。將目的基因進(jìn)行回收，然后連接至pClone 007載體上。提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI登錄的標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比，片段插入位置正確，同源性為100%，表明標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pClone 007-E2構(gòu)建成功。pClone 007-E2的質(zhì)粒濃度為112 ng/μL，總長度為2 096 bp，經(jīng)計(jì)算拷貝數(shù)為4.87×1010 copies/μL。

2.2?SYBR Green Ⅰ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

用優(yōu)化后的反應(yīng)條件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其斜率為-3.1389，截距為30.19，相關(guān)系數(shù)為0.9931（圖2），說明Ct值與10倍梯度稀釋后的陽性標(biāo)準(zhǔn)品之間有良好的線性關(guān)系。

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè) BVDV的熔解曲線顯示，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)了單一波峰，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)熔點(diǎn)峰（圖3），表明試驗(yàn)過程中沒有出現(xiàn)引物二聚體及污染現(xiàn)象，且該引物為特異性擴(kuò)增。

2.3?特異性試驗(yàn)

用建立的 SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法對(duì)BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有BVDV檢測(cè)為陽性（圖4），說明該方法有很強(qiáng)的特異性。

2.4?敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pClone 007-E2作10倍梯度稀釋，用該方法對(duì) 4.87×107 copies/μL至 4.87×100 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。由圖 5可知，該方法檢出核酸的最低模板拷貝數(shù)為4.87×101 copies/μL。常規(guī) PCR能檢出的核酸最低陽性質(zhì)粒拷貝數(shù)為4.87×102 copies/μL（圖 6）。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性高于普通 PCR檢測(cè)方法。

2.5?重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，批內(nèi)變異系數(shù)為0.07%～0.33%，批間變異系數(shù)為0.54%～0.71%，表明該方法具有良好的批內(nèi)、批間重復(fù)性。

2.6?臨床樣本檢測(cè)

采用建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了5個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)送檢的67份奶牛腹瀉樣品，BVDV陽性31份，陽性檢出率為46.27%（31/67），而普通PCR 陽性檢出率為43.28%（29/67），符合率為106.90%。

3?討論與結(jié)論

牛病毒性腹瀉病毒可引起患病牛呈現(xiàn)發(fā)熱、流涎、下痢、結(jié)膜炎、口腔黏膜糜爛潰瘍，孕牛出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎和胎兒畸形，還會(huì)引起牛的免疫抑制以及持續(xù)性感染等問題[13]。牛病毒性腹瀉病毒在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是影響?zhàn)B牛業(yè)健康發(fā)展的最重要疫病之一[14]。由于持續(xù)感染，?？梢蚤L期帶毒排毒，是非常危險(xiǎn)的傳染源[15]。因此，關(guān)于牛群的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)與淘汰對(duì)于牛病毒性腹瀉的控制非常重要。

本研究建立的牛病毒性腹瀉病毒SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法不僅兼具特異性好、敏感性高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，而且操作簡單，易于進(jìn)行大規(guī)模樣品檢測(cè)。此外，利用本方法檢測(cè)的樣品采樣方便，可直接檢測(cè)病原，為BVDV感染的早期診斷及病原流行病學(xué)調(diào)查提供了有效可靠的技術(shù)手段。

本研究通過對(duì)NCBI上收錄的多個(gè)BVDV序列進(jìn)行比對(duì)，針對(duì)E2基因上的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，建立了SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。用該方法檢測(cè)BVDV，最低檢測(cè)限為4.87×101 copies/μL，敏感性比常規(guī)PCR高10倍;檢測(cè)IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O等均為陰性，只有檢測(cè)BVDV的結(jié)果為陽性，說明該方法的特異性強(qiáng);批內(nèi)變異系數(shù)為0.07%～0.33%，批間變異系數(shù)為0.54%～0.71%，表明該方法重復(fù)性高。用建立的熒光定量PCR方法對(duì)山東、江蘇和天津3個(gè)地區(qū)5個(gè)不同牛場(chǎng)的67份牛腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，建立的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法陽性樣本檢出準(zhǔn)確率高于常規(guī)PCR方法。

本試驗(yàn)建立的牛病毒性腹瀉病毒E2基因的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可以高效、準(zhǔn)確地確定牛群中是否存在BVDV感染，為今后BVDV的防控和凈化提供了有效的技術(shù)手段，也為BVDV的實(shí)驗(yàn)室研究提供了參考和理論支撐。

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