• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究

    2016-08-01 03:45:10鄢榮榜盧巧巧賀海波王心怡張永峰覃慧林汪鋆植
    關(guān)鍵詞:胃粘膜木瓜內(nèi)生

    鄢榮榜 盧巧巧 賀海波 王心怡 張永峰 覃慧林 汪鋆植

    (1. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院, 湖北 宜昌 443002; 2. 湖北航天杜勒制藥有限公司, 湖北 宜昌 443100; 3. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 湖北 宜昌 443002)

    ?

    木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究

    鄢榮榜1,2盧巧巧3賀海波1王心怡3張永峰1覃慧林1汪鋆植1

    (1. 三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院, 湖北 宜昌443002; 2. 湖北航天杜勒制藥有限公司, 湖北 宜昌443100; 3. 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 湖北 宜昌443002)

    摘要:研究了木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保護(hù)作用及可能的機(jī)制.將昆明小鼠完全隨機(jī)分為空白組、模型組、木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)及奧美拉唑(20 mg/kg)組,給藥組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物,每天1次,連續(xù)5 d,末次給藥1 h后,除空白組外,各組小鼠分別安10 ml/kg灌胃給予阿司匹林的乙醇溶液(15 mg阿司匹林溶解于10 ml 80%乙醇中),4 h后取胃,延胃大彎剖開,除去胃內(nèi)容物,觀察胃粘膜外觀形態(tài),并計(jì)算胃潰瘍發(fā)生率、胃潰瘍指數(shù)及胃潰瘍抑制率;刮取胃粘膜,勻漿后,取上清,用試劑盒檢測(cè)胃粘膜中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性;取胃粘膜組織,經(jīng)HE染色后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察.木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位能明顯降低胃粘膜中H+/K+-ATPase、COX-2活性,升高PGE2活性,改善胃粘膜組織形態(tài),促進(jìn)潰瘍愈合(P<0.05或P<0.01).結(jié)果表明木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜損傷有較好的保護(hù)作用,其作用機(jī)制與其抑制胃粘膜COX-2、H+/K+-ATPase活性和增強(qiáng)PGE2活性有關(guān),然而是木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位中的何種有效部位/成分起作用及確切的作用機(jī)制目前正在進(jìn)一步研究中.

    關(guān)鍵詞:木瓜內(nèi)生真菌;胃粘膜保護(hù)作用;H+/K+-ATPase;COX-2;PGE2

    木瓜Chaenomelesspeciosa(sweet)Nakaion為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥,同時(shí)也是民間應(yīng)用廣泛的食材.具有平肝舒筋、和胃化濕之功效,主要用于風(fēng)濕痹痛、消化不良和胃腸炎等治療[1].我們前期研究發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯部位和木瓜三萜均具有較好的胃粘膜保護(hù)作用[2-4].本研究擬在此基礎(chǔ)上,從其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物來(lái)研究其對(duì)胃粘膜的保護(hù)作用.

    1材料與儀器

    1.1木瓜內(nèi)生真菌

    木瓜內(nèi)生真菌分離自資丘木瓜的果皮部分,木瓜樣品采集于湖北省長(zhǎng)陽(yáng)縣榔坪鎮(zhèn).

    1.2培養(yǎng)基

    馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA):200 g去皮馬鈴薯?yè)v碎后,煎煮30 min,過(guò)濾,取濾液分別加入20 g葡萄糖,20 g瓊脂,用蒸餾水定容至1 000 mL,然后在1.25×105Pa壓力下,滅菌20 min,即得.

    1.3動(dòng)物

    75只體重為18~22 g的雄性SPF級(jí)昆明小鼠(購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(鄂)2011-0012.每籠5只,分開飼養(yǎng),小鼠在動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)適應(yīng)環(huán)境3天后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

    1.4試劑

    阿司匹林腸溶片(中國(guó)北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司);無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司),H+/K+-ATPase試劑盒(南京建成生物制品研究所),COX-2 ELISA試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司),PGE2 ELISA試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司),其它試劑均為市售分析純.

    1.5儀器

    電子分析天平(上海天平儀器廠),Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器(美國(guó)奧然科技有限公司),酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司),脫水機(jī)(德國(guó)Leica公司),切片機(jī)(奧地利Leica公司),圖像采集系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司),倒置顯微鏡(日本Olympus公司).

    2方法

    2.1木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位的制備

    將采集的資丘木瓜依次用5%NaClO溶液和75%酒精表面消毒5 min后,取木瓜果皮接種于PDA培養(yǎng)基中,置于28℃恒溫箱中培養(yǎng).待菌絲長(zhǎng)出后,挑取尖端菌絲移至新的PDA培養(yǎng)基上,經(jīng)幾次純化后得到內(nèi)生真菌并轉(zhuǎn)接到試管斜面,進(jìn)行活化,然后選取活化的菌株,接種到含PDA的固體平板上,當(dāng)菌落生長(zhǎng)到Φ大約6 cm,接種至裝量為200 mL/500 mL的液體PDA培養(yǎng)基三角瓶中,置旋轉(zhuǎn)式搖床于28℃,120 rpm條件下,培養(yǎng)2~3 d,即得種子液,然后將PDA液體培養(yǎng)基分裝于500 mL三角瓶中,裝液量為200 mL,發(fā)酵200瓶,于121℃、1.25×105Pa下滅菌30 min,然后將種子液按5%的接種量接入已滅菌好的PDA液體培養(yǎng)基中,在溫度為28℃,轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分的搖床中培養(yǎng)20 d,發(fā)酵液用紗布過(guò)濾后,分為上清液和菌絲體.將菌絲體干燥、粉碎后,用95%乙醇回流提取3次,每次2 h,將提取液和發(fā)酵后的上清液合并,減壓濃縮得總浸膏,然后將其依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,取乙酸乙酯萃取液濃縮成浸膏,得到木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位.使用前用0.5%羧甲基纖維鈉溶液(0.5%CMC-Na)配成相應(yīng)濃度的混懸液,備用.

    2.2實(shí)驗(yàn)分組及胃潰瘍模型的建立

    將實(shí)驗(yàn)小鼠按每組15只完全隨機(jī)分為空白組、胃潰瘍模型組、木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)和奧美拉唑(20 mg/kg)組,給藥組灌胃給予相應(yīng)的藥物,空白組和胃潰瘍模型組則給予0.5%CMC-Na溶液,每天1次,連續(xù)5 d,末次給藥1 h后,除空白組外,各組小鼠分別安10 mL/kg灌胃給予阿司匹林的乙醇溶液(15 mg阿司匹林溶解于10 mL 80%乙醇中),4 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

    2.3檢測(cè)指標(biāo)

    2.3.1潰瘍指數(shù)的測(cè)定

    小鼠均頸椎脫臼處死,取胃,肉眼觀察胃黏膜外觀形態(tài).按照我們已發(fā)表文章的方法[2]進(jìn)行潰瘍發(fā)生率、潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率的分析.

    2.3.2胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性測(cè)定

    完成胃粘膜損傷分析后,用載玻片刮取胃粘膜,稱量后,按1∶49加入0.9%氯化鈉溶液制成勻漿液,離心后,取上清液,按照試劑盒介紹的檢測(cè)方法測(cè)定H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性.

    2.3.3胃粘膜組織形態(tài)學(xué)觀察

    取胃竇部分用多聚甲醛(4%)進(jìn)行固定后,用梯度乙醇脫水后,石蠟包埋,按片后4 μm進(jìn)行連續(xù)切片,然后進(jìn)行HE,在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析.

    2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3結(jié)果

    3.1木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)小鼠胃潰瘍的影響

    由圖1可見,空白對(duì)照組小鼠胃粘膜呈現(xiàn)淡紅色,粘膜皺襞光滑,未見出血點(diǎn);模型組可見彌散性出血點(diǎn),腺胃部粘膜出現(xiàn)充血、水腫及糜爛點(diǎn);木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位組均可抑制潰瘍形成.經(jīng)胃潰瘍指數(shù)分析,木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)均可顯著減少胃潰瘍指數(shù),而且隨著劑量的增加,其作用效果更為顯著;通過(guò)計(jì)算分析,木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)對(duì)胃潰瘍抑制率分別為32.5%、50.3%、62.4%(見表1).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)乙醇和阿司匹林致小鼠胃潰瘍損傷具有較好的保護(hù)作用.

    表1 木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)小鼠胃潰瘍的影響±s)

    與正常組比較#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01.

    3.2木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性的影響

    由表2可見,模型組胃粘膜組織中H+/K+-ATPase和COX-2活性顯著升高,PGE2活性明顯降低,與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01);用木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位和奧美拉唑治療后,上述異常變化均得到了顯著改善(P<0.05,P<0.01).

    表2 木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性的影響

    與正常組比較#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01.

    3.3木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜組織形態(tài)學(xué)的影響

    由圖2可見,胃粘膜組織經(jīng)HE染色后,光鏡下觀察可見,正常組胃粘膜層次清楚,上皮完整,腺體排列整齊,無(wú)充血、糜爛現(xiàn)象.模型組胃粘膜可見充血擴(kuò)張及糜爛性出血,上皮細(xì)胞脫落,腺體排列紊亂,并可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn).而木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位和奧美拉唑組胃粘膜未見明顯損傷,少見充血擴(kuò)張及炎性浸潤(rùn).

    A.正常組;B.模型組;C.木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位50mg/kg組;D.木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位100mg/kg組;E.奧美拉唑組圖2 木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)小鼠胃粘膜組織形態(tài)學(xué)的影響

    4討論

    近20年來(lái),隨著許多非感染性疾病,如心腦血管疾病、機(jī)體衰老等人口的老齡化疾病被相繼證實(shí)與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān).近年來(lái),學(xué)者們發(fā)現(xiàn)阿司匹林等非甾體抗炎藥(NSAIDs)可有效降低胃癌、結(jié)腸癌等消化道腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)防心腦血管疾病,使得NSAIDs成為了世界上應(yīng)用最多的藥品之一,在中國(guó)其用量?jī)H次于抗感染藥物[5].然而隨著其臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,NSAIDs相關(guān)性胃粘膜損傷的病例也越來(lái)越多.盡管臨床有鋁/鉍制劑、H2受體拮抗劑、胃泌素受體及質(zhì)子泵抑制劑可供選用,但往往由于存在療效不持久、停藥后容易復(fù)發(fā)、副反應(yīng)等缺點(diǎn),使其臨床應(yīng)用受到了極大限制[6-8].因此,尋找有效防治胃粘膜損傷的措施越來(lái)越引起人們的關(guān)注.木瓜是常用藥食同源藥材,在民間應(yīng)用極為廣泛.《本草綱目》記載該藥具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕之功,可用于腰酸腿痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療.我們前期計(jì)算分析和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),其三萜類成分及其中的齊墩果酸在抗炎的同時(shí),顯示出了較好的胃粘膜保護(hù)作用[2-4].根據(jù)以上觀點(diǎn),我們進(jìn)行了木瓜中內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位對(duì)胃粘膜損傷的保護(hù)作用研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位可顯著降低胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2活性,升高PGE2活性,降低胃潰瘍發(fā)生率、胃潰瘍指數(shù),升高潰瘍抑制率,改善胃粘膜組織形態(tài)學(xué),表現(xiàn)出對(duì)小鼠胃黏膜損傷良好的保護(hù)作用.

    現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)胃粘膜有著完善的防御體系,它由粘液-碳酸氫鹽-磷脂屏障、上皮細(xì)胞屏障和胃粘膜的微循環(huán)三級(jí)胃粘膜保護(hù)屏障組成.在該體系中,攻擊因子(H+、胃蛋白酶、H+/K+-ATPase、IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2)和防御因子(COX-1、TGF-β、PG、PGE2)維持著動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)攻擊因子強(qiáng)于防御因子是,胃粘膜表現(xiàn)為胃粘膜損傷[9-10].防治胃粘膜損傷的根本目的是恢復(fù)攻擊因子和防御因子間的動(dòng)態(tài)平衡,恢復(fù)胃粘膜防御屏障正常功能.在實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn),胃潰瘍模型小鼠用木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位治療后,胃粘膜組織中H+/K+- ATPase、COX-2活性明顯降低,PGE2活性顯著降低,且具有明顯劑量依賴性,該結(jié)果也與其改善胃粘膜組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致.

    綜上所述,木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位能降低胃粘膜組織中H+/K+- ATPase、COX-2活性,升高PGE2活性,降低胃潰瘍發(fā)生率、胃潰瘍指數(shù),提高胃潰瘍抑制率及改善胃粘膜組織形態(tài).其保護(hù)作用可能與抑制胃粘膜損傷攻擊因子H+/K+-ATPase、COX-2的活性及增強(qiáng)防御因子PGE2活性有關(guān),然而是木瓜內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取部位中的何種有效部位/成分起作用及確切的作用機(jī)制目前正在進(jìn)一步研究中.

    參考文獻(xiàn):

    [1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上海人民出版社,1997:349-350.

    [2]覃慧林,王愛玲,鄧為,等.木瓜乙酸乙酯部位對(duì)小鼠急性胃潰瘍的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床,2015,31(2):45-49.

    [3]汪鋆植,閆喜明,田華詠,等.以土家醫(yī)三元論為指導(dǎo)的反選法在新藥研究中的應(yīng)用[J].中草藥,2015,46(15):2189-2192.

    [4]Wang J Z, Sun W J, Luo H J, et al. Protective Effect of Eburicoic Acid of the Chicken of the Woods Mushroom, Laetiporus Sulphureus (Higher Basidiomycetes), Against Gastric Ulcers in Mice[J]. Int J Med Mushrooms, 2015, 17 (7):619-626.

    [5]Crofford L J. Use of NSAIDs in Treating Patients with Arthritis[J]. Arthritis Res Ther, 2013, 15(3):S2.

    [6]Griffin M R. Epidemiology of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drug-associated Gastrointestinal Injury[J]. Am J Med, 1998, 104 (3A):23S-29S.

    [7]Takeuchi K. Pathogenesis of NSAID-induced Gastric Damage: Importance of Cyclooxygenase Inhibition and Gastric Hypermotility[J]. World J Gastroenterol, 2012, 18 (18):2147-2160.

    [8]Davies N M, Smith G D, Windmeijer F, et al. COX-2 Selective Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs and Risk of Gastrointestinal Tract Complications and Myocardial Infarction:an Instrumental Variable Analysis[J]. Epidemiology, 2013, 24(3):352-362.

    [9]Tarnawski A S, Ahluwalia A, Jones M K. The Mechanisms of Gastric Mucosal Injury: Focus on Microvascular Endothelium as a Key Target[J]. Curr Med Chem, 2012,19 (1):4-15.

    [10] Tarnawski A S, Ahluwalia A. Molecular Mechanisms of Epithelial Regeneration and Neovascularization During Healing of Gastric and Esophageal Ulcers[J]. Curr Med Chem, 2012,19 (1):16-27.

    [責(zé)任編輯周文凱]

    收稿日期:2016-01-04

    基金項(xiàng)目:湖北省民間藥物工程研究中心(2015ZY007);三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院預(yù)研基金(No. Hy1402)

    通信作者:賀海波(1972-),男,副教授,博士,主要從事土家族藥物的活性評(píng)價(jià)及開發(fā)研究.E-mail:hehaibo252219@163.com.

    DOI:10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.02.021

    中圖分類號(hào):R282.71

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1672-948X(2016)02-0092-05

    Experimental Study of Protective Effect of Gastric Mucosa of Ethyl Acetate Part of Endophytic Fungi fromChaenomelesSpeciosa(sweet) Nakaion

    Yan Rongbang1,2Lu Qiaoqiao3He Haibo1Wang Xinyi3Zhang Yongfeng1Qin Huilin1Wang Junzhi1

    (1. College of Biology & Pharmacy, China Three Gorges Univ., Yichang 443000, China; 2. Hubei Aerospace Du Le Pharmaceutical Co., Ltd., Yichang 443100, China; 3. Medical College, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

    AbstractTo investigate the protective effect of gastric mucosa of ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion on gastric ulcer injury in mice, and to explore its possible mechanism, the experimental mice were randomly divided into control, model, ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion (50 and 100) and omeprazole groups (20mg/kg), 15 mice each group. The gastric ulcers injury were generated by administration of the mixture of ethanol and aspirin which was made up of 10ml 80% ethanol and 15mg aspirin at the 4 hour after drugs on 5th day. The ulcer index, ulcer inhibition rate, histopathological changes, the H+/K+-ATPase, COX-2 and PGE2 activities in gastric mucosa were assessed. The ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion (50,100mg/kg) might remarkably decrease H+/K+-ATPase, COX-2 activities, and increase PGE2 in gastric mucosa, ameliorate ulcer index, ulcer inhibition rate, histomorphology (P<0.05 and P<0.01). The ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion possess a good protective effect on gastric mucosa injury in mice, inhibiting the activities of H+/K+-ATPase, COX-2, and enhancing PGE2 activity might be one of its molecular mechanisms; but its chemical composition and detailed active mechanisms of toxicity are under studying.

    KeywordsEndophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion;protective effect of gastric mucosa;H+/K+-ATPase;COX-2;PGE2

    猜你喜歡
    胃粘膜木瓜內(nèi)生
    同叫“木瓜”,功效不同
    植物內(nèi)生菌在植物病害中的生物防治
    內(nèi)生微生物和其在作物管理中的潛在應(yīng)用
    “黨建+”激活鄉(xiāng)村發(fā)展內(nèi)生動(dòng)力
    胃粘膜下腫物的臨床特征和內(nèi)鏡治療效果評(píng)價(jià)
    木瓜老奶奶的云
    木瓜老奶奶的云
    授人以漁 激活脫貧內(nèi)生動(dòng)力
    植物幫之木瓜
    胃粘膜pH值測(cè)定對(duì)小兒重癥肺炎合并胃粘膜損傷的診斷價(jià)值
    夜夜爽天天搞| 国产在视频线在精品| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲精品成人久久久久久| 麻豆国产97在线/欧美| 日韩欧美精品免费久久 | 中文字幕久久专区| 午夜两性在线视频| 国产91精品成人一区二区三区| av视频在线观看入口| 美女高潮的动态| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 1000部很黄的大片| 国产av不卡久久| 国产成人影院久久av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一本综合久久免费| 亚洲成人精品中文字幕电影| 综合色av麻豆| 狠狠狠狠99中文字幕| 一进一出抽搐动态| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美最黄视频在线播放免费| 不卡一级毛片| 亚洲,欧美精品.| 午夜福利在线观看吧| 99热这里只有精品一区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 99国产综合亚洲精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 全区人妻精品视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| av女优亚洲男人天堂| 国产高清三级在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99热只有精品国产| 久久久国产成人免费| 精品久久久久久久久久免费视频| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲美女视频黄频| 男人的好看免费观看在线视频| 国产高清videossex| 国产黄片美女视频| 黄色女人牲交| 男人和女人高潮做爰伦理| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 操出白浆在线播放| 中文字幕av在线有码专区| 国产一区二区三区视频了| 国产欧美日韩一区二区三| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品日产1卡2卡| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费看a级黄色片| 99国产综合亚洲精品| 国产日本99.免费观看| 成人精品一区二区免费| 又紧又爽又黄一区二区| 男人舔奶头视频| 一进一出好大好爽视频| 91在线精品国自产拍蜜月 | 欧美午夜高清在线| 国产成人影院久久av| 九色国产91popny在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲欧美精品综合久久99| 伊人久久精品亚洲午夜| 一进一出好大好爽视频| 日韩有码中文字幕| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 色在线成人网| 我要搜黄色片| 特大巨黑吊av在线直播| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 精品无人区乱码1区二区| 欧美最黄视频在线播放免费| 一个人看的www免费观看视频| 97碰自拍视频| 国产一区二区激情短视频| 操出白浆在线播放| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产在视频线在精品| 精品国产亚洲在线| 欧美性猛交黑人性爽| 午夜激情欧美在线| 国产毛片a区久久久久| 久久亚洲精品不卡| 高清毛片免费观看视频网站| 18+在线观看网站| 日本五十路高清| 国产伦人伦偷精品视频| www.熟女人妻精品国产| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品三级大全| 老司机福利观看| 成年版毛片免费区| 久久中文看片网| 一本一本综合久久| 搡老熟女国产l中国老女人| 日本与韩国留学比较| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲久久久久久中文字幕| 成人精品一区二区免费| 精品久久久久久久久久久久久| 夜夜爽天天搞| 亚洲av免费高清在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人18禁在线播放| 99精品在免费线老司机午夜| 在线免费观看的www视频| 超碰av人人做人人爽久久 | 国产亚洲欧美98| 老司机福利观看| 免费看十八禁软件| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲人成网站在线播| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久精品国产清高在天天线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费在线观看日本一区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 啦啦啦免费观看视频1| 18禁国产床啪视频网站| 深爱激情五月婷婷| 一区二区三区免费毛片| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 午夜福利免费观看在线| 欧美在线一区亚洲| 一本一本综合久久| 精品午夜福利视频在线观看一区| 午夜精品一区二区三区免费看| 成人国产综合亚洲| 日本与韩国留学比较| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲欧美日韩高清专用| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品 国内视频| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 淫秽高清视频在线观看| 日本三级黄在线观看| 久久精品91蜜桃| 有码 亚洲区| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲色图av天堂| 十八禁网站免费在线| 国产日本99.免费观看| 白带黄色成豆腐渣| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 内地一区二区视频在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 免费人成视频x8x8入口观看| 可以在线观看毛片的网站| 午夜免费成人在线视频| 日韩av在线大香蕉| 窝窝影院91人妻| 少妇人妻一区二区三区视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久这里只有精品中国| 99热6这里只有精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久久色成人| 内射极品少妇av片p| 宅男免费午夜| 性欧美人与动物交配| 亚洲av二区三区四区| 天堂√8在线中文| 日本黄色片子视频| 1000部很黄的大片| 天美传媒精品一区二区| 99热这里只有是精品50| 国产三级在线视频| 十八禁人妻一区二区| 波多野结衣巨乳人妻| 最新中文字幕久久久久| 美女 人体艺术 gogo| 国产毛片a区久久久久| 岛国视频午夜一区免费看| 一级黄片播放器| 国产乱人伦免费视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 久久伊人香网站| 国产高清视频在线播放一区| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲一区二区三区不卡视频| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人啪精品午夜网站| 一区二区三区高清视频在线| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美日本视频| 波多野结衣高清作品| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 日本一二三区视频观看| 成人国产综合亚洲| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 99热这里只有精品一区| 亚洲美女黄片视频| 国产真实乱freesex| 免费看光身美女| 一二三四社区在线视频社区8| 99久久综合精品五月天人人| 午夜福利在线在线| 十八禁人妻一区二区| 国产亚洲精品一区二区www| 色综合亚洲欧美另类图片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 成年版毛片免费区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 内地一区二区视频在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 热99re8久久精品国产| av天堂中文字幕网| 18禁美女被吸乳视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久久久久久大av| 国产亚洲欧美98| 国产极品精品免费视频能看的| 男女之事视频高清在线观看| 在线国产一区二区在线| 国产高清视频在线观看网站| 国产精品永久免费网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日韩亚洲欧美综合| 熟女电影av网| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产伦精品一区二区三区四那| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲成人久久性| 欧美在线一区亚洲| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产在视频线在精品| 午夜福利18| 一本一本综合久久| 小说图片视频综合网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美高清成人免费视频www| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 午夜免费成人在线视频| 国产成人aa在线观看| 小说图片视频综合网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲av成人精品一区久久| 美女免费视频网站| 两人在一起打扑克的视频| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲在线自拍视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 性欧美人与动物交配| 国产高潮美女av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品电影一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日本三级黄在线观看| 男女午夜视频在线观看| 很黄的视频免费| 999久久久精品免费观看国产| 欧美激情在线99| 午夜日韩欧美国产| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美av亚洲av综合av国产av| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美在线一区亚洲| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 成人特级av手机在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 美女大奶头视频| 一级黄片播放器| 国产免费一级a男人的天堂| 天天躁日日操中文字幕| 免费无遮挡裸体视频| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产成人av激情在线播放| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产成人欧美在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 国产淫片久久久久久久久 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 青草久久国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 在线观看午夜福利视频| 免费av不卡在线播放| 国产伦人伦偷精品视频| 国产免费男女视频| 中文字幕熟女人妻在线| 成人欧美大片| 国产成人福利小说| 国产成人av激情在线播放| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美在线黄色| 国产精品久久久久久久久免 | 久久99热这里只有精品18| 欧美成人免费av一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 午夜激情欧美在线| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 午夜激情欧美在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 三级毛片av免费| 身体一侧抽搐| tocl精华| 三级国产精品欧美在线观看| 成年人黄色毛片网站| 精品不卡国产一区二区三区| a在线观看视频网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 香蕉丝袜av| 免费av观看视频| 国产黄a三级三级三级人| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产成年人精品一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 搡老岳熟女国产| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 91久久精品电影网| 三级毛片av免费| 91字幕亚洲| 久99久视频精品免费| 手机成人av网站| 少妇丰满av| av天堂在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 午夜久久久久精精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美日韩精品网址| 国产亚洲欧美在线一区二区| 高清在线国产一区| 国产三级在线视频| 好男人在线观看高清免费视频| 网址你懂的国产日韩在线| 免费观看人在逋| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久这里只有精品中国| 国产中年淑女户外野战色| 日韩精品中文字幕看吧| 少妇的逼好多水| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品影院久久| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲av五月六月丁香网| 深爱激情五月婷婷| 日韩欧美国产在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 欧美zozozo另类| 级片在线观看| 亚洲电影在线观看av| 国产精品三级大全| 亚洲成人久久爱视频| 一区二区三区国产精品乱码| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久精品国产自在天天线| 偷拍熟女少妇极品色| 国产成人欧美在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 床上黄色一级片| 最新美女视频免费是黄的| 国产真实伦视频高清在线观看 | 日韩欧美 国产精品| 91在线精品国自产拍蜜月 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 内地一区二区视频在线| 国产99白浆流出| 欧美激情在线99| 亚洲成av人片在线播放无| 男女床上黄色一级片免费看| 校园春色视频在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 嫁个100分男人电影在线观看| 一本综合久久免费| 亚洲av电影在线进入| 国产成人a区在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国内精品久久久久久久电影| 国产老妇女一区| a级毛片a级免费在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 日本五十路高清| 久久久国产成人免费| 亚洲专区国产一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 又爽又黄无遮挡网站| 一区二区三区高清视频在线| 性色avwww在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲激情在线av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 一a级毛片在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美在线黄色| 无人区码免费观看不卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美在线一区亚洲| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美大码av| 一区福利在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美成人a在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久久久性生活片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一级黄片播放器| 美女免费视频网站| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 99热只有精品国产| 久久久精品大字幕| 听说在线观看完整版免费高清| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美日韩黄片免| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 在线观看舔阴道视频| 69av精品久久久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲国产精品999在线| 在线播放国产精品三级| 哪里可以看免费的av片| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲国产精品成人综合色| 熟女电影av网| 一级黄片播放器| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品国产高清国产av| 免费观看的影片在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 免费看日本二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩欧美免费精品| 国产视频一区二区在线看| 成人av在线播放网站| 精品久久久久久,| 99久久成人亚洲精品观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 身体一侧抽搐| 国产69精品久久久久777片| 午夜a级毛片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 极品教师在线免费播放| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 成人av在线播放网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品精品国产色婷婷| 国产黄片美女视频| 操出白浆在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产成人av激情在线播放| 深爱激情五月婷婷| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜a级毛片| 一级毛片女人18水好多| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲欧美激情综合另类| 免费av毛片视频| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲七黄色美女视频| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av电影在线进入| 亚洲av二区三区四区| 熟女人妻精品中文字幕| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲在线观看片| 国产精品女同一区二区软件 | 757午夜福利合集在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产高清三级在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 男女午夜视频在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美黄色片欧美黄色片| 特级一级黄色大片| 久久午夜亚洲精品久久| 丁香欧美五月| 国产探花在线观看一区二区| 欧美激情在线99| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产三级黄色录像| 激情在线观看视频在线高清| 男人和女人高潮做爰伦理| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产成人av激情在线播放| 国产伦人伦偷精品视频| 三级国产精品欧美在线观看| 色av中文字幕| 久久久久久国产a免费观看| 国产黄片美女视频| 一级黄片播放器| 欧美午夜高清在线| 国产午夜精品论理片| 免费观看的影片在线观看| 亚洲国产精品999在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美zozozo另类| 精品电影一区二区在线| 国产精品永久免费网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲国产高清在线一区二区三| 成人鲁丝片一二三区免费| 五月玫瑰六月丁香| 岛国在线观看网站| 99精品久久久久人妻精品| 在线观看一区二区三区| 看黄色毛片网站| 一区二区三区免费毛片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产色爽女视频免费观看| 观看美女的网站| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲男人的天堂狠狠| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费高清视频大片| 国产乱人伦免费视频| 国内精品久久久久久久电影| 黄片小视频在线播放| 伊人久久精品亚洲午夜| 操出白浆在线播放| 精华霜和精华液先用哪个| www.熟女人妻精品国产| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 一级毛片高清免费大全| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品亚洲美女久久久| 69人妻影院| 波野结衣二区三区在线 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 床上黄色一级片| 国产伦一二天堂av在线观看| 两个人视频免费观看高清| 在线a可以看的网站| 久9热在线精品视频| 午夜福利在线在线| 精品日产1卡2卡| 在线免费观看的www视频| 一区二区三区国产精品乱码| 国产伦人伦偷精品视频| 麻豆成人av在线观看| 精品一区二区三区视频在线 | 欧美黄色淫秽网站| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 欧美高清成人免费视频www| 男插女下体视频免费在线播放| www日本黄色视频网| 国产伦精品一区二区三区四那| 99riav亚洲国产免费| 国产真人三级小视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| a在线观看视频网站| 国产一区在线观看成人免费| 人人妻人人看人人澡| 日本一二三区视频观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜免费激情av| 最新中文字幕久久久久| 国产午夜精品论理片|