茯磚茶“金花”菌的分離、鑒定及轉(zhuǎn)化葛根產(chǎn)物研究

胡謝馨，易有金*，柏連陽，李高陽，周紅麗，周金偉，夏菠

茯磚茶“金花”菌的分離、鑒定及轉(zhuǎn)化葛根產(chǎn)物研究

胡謝馨1，易有金1*，柏連陽2，李高陽3，周紅麗1，周金偉1，夏菠1

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410128；3. 湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410128

摘要：為研究茯磚茶中“金花”菌是否能在葛根上生長，并進行生物轉(zhuǎn)化，得到活性更高的發(fā)酵產(chǎn)物。從茯磚茶中分離出一株優(yōu)勢菌株 LS1，并進行鑒定；以野葛、粉葛、葛渣為底物進行固體發(fā)酵，以 DPPH自由基清除法比較發(fā)酵前后產(chǎn)物抗氧化活性，并測定了總黃酮含量及采用高效液相色譜法檢測葛根素質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，LS1經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及ITS-5.8S rDNA序列分析，鑒定為冠突散囊菌Eurotium cristatum，GenBank登錄號為 KR812327；野葛、粉葛、葛渣固體發(fā)酵后總黃酮和葛根素含量分別提高了 15.97%、12.33%、20.69%和20.48%、7%、20.29%。

關(guān)鍵詞：“金花”菌；葛根；發(fā)酵；鑒定；抗氧化；葛根素

微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的酶使底物進行有機反應(yīng)［1］，具有安全有效、低成本、低耗能等優(yōu)點［2］。微生物特別是真菌具有非常強大的分解轉(zhuǎn)化能力，并能產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物［3］。近年來已有大量研究證明，微生物轉(zhuǎn)化葛根的可行性，例如米根霉、酵母混合菌發(fā)酵提取的葛根異黃酮含量明顯高于傳統(tǒng)提取方法［4］；添加葛根的靈芝發(fā)酵產(chǎn)物對羥自由基和超氧陰離子的清除效果明顯比單獨靈芝發(fā)酵好［5］；利用紅曲霉轉(zhuǎn)化葛根可使染料木素與葛根素含量得到提高［6］。冠突散囊菌（Eurotium cristatum）又名“金花”菌，是茯磚茶渥堆過程中的優(yōu)勢菌，具有多種醫(yī)療保健功能，如降脂減肥、抗氧化、抗菌、抗癌等，它可利用單寧與淀粉等物質(zhì)作為碳源，分泌多種胞外酶，如多酚氧化酶、果膠酶、纖維素酶、蛋白酶等［7］。葛根中富含大量營養(yǎng)物質(zhì)，可供冠突散囊菌利用，而通過其分泌的胞外酶又能使葛根中的成分發(fā)生改變。因此，本試驗旨在分離能發(fā)酵葛根的“金花”菌，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)研究“金花”菌固體發(fā)酵葛根前后抗氧化活性的變化，測定發(fā)酵前后總黃酮含量及采用 HPLC法檢測發(fā)酵前后葛根素含量，以期為“金花”菌的綜合利用提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茯磚茶：益陽安化茶廠2008年生產(chǎn)，磚茶樣品外形均為方形，黑褐色，緊實，有“發(fā)花現(xiàn)象”，于室溫下黑暗干燥密封保存待用。

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究所），色譜級甲醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），DNA提取試劑（天根生化科技有限公司），PCR MasterMIX（天根生化科技有限公司），Vc、抗氧化劑264（BHT）、蘆?。▏幖瘓F化學(xué)試劑有限公司），其他試劑均為分析純。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）、察氏培養(yǎng)基（CA、CA20、CA70）［8］、固體發(fā)酵培養(yǎng)基（野葛 2.5 g，粉葛、葛渣 10 g，水10 mL），121℃滅菌備用。

葛根：野葛、粉葛購自老百姓大藥房。

1.2 試驗方法

1.2.1 “金花”菌的分離純化

挑取茯磚茶上的金黃色閉囊殼接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)，待菌落生長進入旺盛期時，挑取菌絲作平板劃線，重復(fù)3次純化［9］，并將其命名為LS1。

1.2.2 孢子懸浮液的制備

將菌種培養(yǎng)8 d后挑取適量孢子放入盛有100 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分震蕩搖勻，并稀釋為濃度 4×106個·mL-1孢子懸浮液待用。

1.2.3 固體發(fā)酵

吸取1 mL孢子懸浮液接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)。7 d后，采用醇提法［10］，用95%乙醇超聲萃取發(fā)酵物，棄其沉淀，上清液于 50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，揮發(fā)至恒重，野葛加蒸餾水稀釋至25 mL，粉葛、葛渣稀釋至100 mL，各提取液質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1。以未發(fā)酵樣為對照，按照同樣方法萃取。野葛、粉葛、葛渣發(fā)酵前后溶液分別命名為Y-1、Y-2，F(xiàn)-1、F-2，Z-1、Z-2。

1.2.4 分離菌株LS1的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

采用點值法［11］，觀察記錄各培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及生長情況。于光學(xué)顯微鏡下觀察記錄菌絲體及孢子形態(tài)特征。

（2）分子生物學(xué)鑒定

①菌株基因組 DNA的提取。參考Weiland［12］方法提取DNA樣品備用。

②ITS-5.8S rDNA引物序列及PCR擴增。選用真菌通用引物 ITS1：5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'，ITS4：5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'進行PCR擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后委托長沙佳和生物技術(shù)公司測序。

③PCR擴增序列分析。將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，通過BLAST進行同源性搜索，并申請NCBI登錄號。

④系統(tǒng)發(fā)育分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。在GenBank中索取與內(nèi)生 LS1菌株同源性高的相似菌株ITS-5.8S rDNA序列，用MEGA 4.0軟件進行序列分析，采用 Neighbor-Joining （N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 DPPH清除自由基能力法測定抗氧化能力

參考陳雪［13］的方法，采用 DPPH清除自由基能力法比較底物發(fā)酵前后抗氧化活性，并以葛根素、BHT、Vc標(biāo)準(zhǔn)品為對照。將反應(yīng)液搖勻，室溫下避光靜置30 min后于517 nm測定Ac、Ai、Aj所表示的樣品吸光度，按下述公式計算清除率。

清除率=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100%

以清除率為縱坐標(biāo)，各供試物濃度為橫坐標(biāo)，建立回歸方程，計算半數(shù)清除濃度IC50。

1.2.6 總黃酮含量測定

參考常飛［14］的方法，采用分光光度計法測定樣品中總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，于510 nm 測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度與吸光度的對應(yīng)關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取待測樣品于相同條件下測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

1.2.7 葛根素HPLC檢測

各提取液經(jīng) 10 000 r·min-1離心后，取上清液100 μL甲醇稀釋至1 mL，混勻，0.45 μm微膜過濾后，即為供試品溶液，HPLC檢測葛根素含量。

（1）色譜條件

色譜柱ODS-C18柱（150 nm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（體積比25∶75），流速1 mL·min-1，檢測波長250 nm，柱溫28℃，進樣量20 μL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品 5 mg，流動相溶解定容至 25 mL，配置成 0.2 mg·mL-1葛根素儲備液。

（3）方法學(xué)考察

參考劉華金［15］的方法，重復(fù)性考察：取各處理組發(fā)酵液分別制備5份供試品溶液，測定峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）；精密度考察：稱取質(zhì)量濃度 40 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進樣5次，測定峰面積，計算RSD；穩(wěn)定性考察：稱取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、10、12、14、16 h內(nèi)進樣測定峰面積，計算 RSD；加樣回收率考察：稱取已知葛根素含量的發(fā)酵液5份，按其含量30%、60%、90%、120%、150%分別加入葛根素標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品方法制備，測定葛根素含量。

1.2.8 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003與SPSS統(tǒng)計軟件完成，以SPSS中的LSD多重比較法進行差異顯著性分析，結(jié)果用大小寫字母標(biāo)注分別表示在P＜0.01與P＜0.05水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株LS1的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株 LS1在 CA培養(yǎng)基中生長較慢，在PDA、CA20培養(yǎng)基中生長速度中等，在CA70培養(yǎng)基中生長最快，并且只在PDA培養(yǎng)基中有黃褐色滲出物。LS1在各培養(yǎng)基中的顏色、生長速度變化較大，見圖1。

光學(xué)顯微鏡下菌株 LS1呈現(xiàn)大量菌絲，有隔，且呈不對稱分支；子囊果大量，呈球形，光滑，混生于菌絲中，小型，見圖2。根據(jù)LS1菌落、顯微形態(tài)特征，基于微生物經(jīng)典鑒定法［16-17］，初步判定該菌為子囊菌門散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬真菌。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

實驗測得實驗菌株1ITS-5.8S rDNA序列全長 588 bp，將序列輸入生物技術(shù)信息網(wǎng)頁（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）進行同源性比對，結(jié)果表明與冠突散囊菌 Eurotium cristatum同源性最高，相似性為100%。該結(jié)果與菌落和顯微形態(tài)鑒定相符，進一步確定LS1菌屬于子囊菌門散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬冠突散囊菌Eurotium cristatum，并在NCBI上申請登錄號為KR812327。

圖1 LS1在PDA、CA、CA20、CA70培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig. 1 LS1 morphologic characteristics on PDA， CA， CA20， CA70 medium

圖2 LS1的顯微形態(tài)Fig. 2 Mycelium microstructure of strain LS1

2.2 固體發(fā)酵

接種3 d后，“金花”菌開始生長，大量金黃色菌絲由培養(yǎng)基中心向四周蔓延，中間部分顏色較深，呈黃褐色，周圍呈淺黃色；從第5天起，菌絲迅速布滿了整個培養(yǎng)基，質(zhì)地致密，同時培養(yǎng)基內(nèi)部也布滿了金黃色菌絲，并產(chǎn)生黑色孢子，菌落背面也有黃色菌絲體。LS1在野葛、粉葛、葛渣上生長較好。按1.2.3的方法萃取發(fā)酵產(chǎn)物。

2.3 不同底物發(fā)酵前后樣品抗氧化活性

2.3.1 野葛發(fā)酵前后抗氧化活性

如圖3所示，各處理對DPPH自由基的清除率隨著濃度的升高而增大，表明濃度與DPPH自由基清除率間呈一定的量效關(guān)系。其中，抗氧化能力最強的為Vc，質(zhì)量濃度為0.01 mg·mL-1時，對 DPPH自由基的清除率達到32.69%，而葛根素與抗氧化劑264（BHT）的抗氧化能力較差。當(dāng)處理質(zhì)量濃度為0.04～0.08 mg·mL-1時，野葛發(fā)酵后處理（Y-2）與 Vc間沒有顯著差異（P＞0.05），但隨著濃度的增加，Y-2的清除水平?jīng)]有Vc提高得快。不同濃度下Y-2清除DPPH自由基的能力均大于野葛發(fā)酵前處理（Y-1），僅在質(zhì)量濃度為0.10 mg·mL-1時二者間未達到顯著差異，且在該濃度時Y-1與葛根素、BHT間均達到顯著差異水平（P＜0.05）。結(jié)果表明，5個處理抗氧化能力大小依次為Vc＞Y-2＞Y-1＞BHT＞葛根素。

圖3 野葛發(fā)酵前后對DPPH自由基清除效果比較Fig. 3 Fermentation effect of pueraria lobata in the wild on DPPH scavenging capability

2.3.2 粉葛發(fā)酵前后抗氧化活性

粉葛發(fā)酵前后對DPPH自由基的清除能力見圖4。圖4顯示，粉葛發(fā)酵前（F-1）和發(fā)酵后（F-2）的抗氧化活性差異較大，在各濃度下對 DPPH自由基的清除能力均達到顯著差異（P＜0.05），但隨著濃度的增加差異逐漸減小。F-1、F-2抗氧化能力明顯大于葛根素與抗氧化劑264（BHT），在質(zhì)量濃度大于0.08 mg·mL-1時，與BHT的清除率達到了顯著差異（P＜0.05）；而在6種不同濃度下，F(xiàn)-2與葛根素的清除率均達到了顯著差異（P＜0.05）。綜上所述，粉葛發(fā)酵前后與對照組抗氧化活性由強至弱依次為：Vc＞F-1＞F-2＞BHT＞葛根素。

2.3.3 葛渣發(fā)酵前后抗氧化活性

如圖5所示，葛渣發(fā)酵前（Z-1）、發(fā)酵后（Z-2）均呈現(xiàn)出一定的抗氧化效果，且差異較大，在各濃度下對DPPH自由基的清除率均達到顯著差異水平（P＜0.05），在質(zhì)量濃度為 0.02 mg·mL-1時，二者差異達到最大。但Z-1、Z-2清除能力比Vc、葛根素、BHT差，葛渣發(fā)酵前后與對照組抗氧化活性由強到弱依次為Vc＞BHT＞葛根素＞Z-1＞Z-2。

圖4 粉葛發(fā)酵前后對DPPH自由基清除效果比較Fig. 4 Fermentation effect of pueraria lobata on DPPH scavenging capability

圖5 葛渣發(fā)酵前后對DPPH自由基清除效果比較Fig. 5 Fermentation effect of pueraria lobata residue on DPPH scavenging capability

2.3.4 不同底物發(fā)酵前后樣品清除DPPH自由

基IC50比較

計算不同底物發(fā)酵前后產(chǎn)物清除DPPH自由基的IC50值，6個樣品與對照組對DPPH自由基的清除效果由強到弱依次為 Vc＞Y-2＞ Y-1＞F-1＞F-2＞BHT＞葛根素＞Z-1＞Z-2（表1）。

表1 不同物質(zhì)發(fā)酵前后清除DPPH自由基的IC50值Table 1 IC50 of different fermentation material

2.4 不同底物發(fā)酵前后樣品總黃酮含量比較

3種底物發(fā)酵前后樣品總黃酮含量檢測結(jié)果如表2所示，相較于發(fā)酵前，野葛、粉葛與葛渣發(fā)酵后總黃酮含量分別提高了15.97%、12.33%、20.69%。

2.5 發(fā)酵前后葛根素HPLC檢測

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的葛根素標(biāo)樣HPLC色譜圖見圖6，標(biāo)樣線性回歸方程為：

表2 不同底物發(fā)酵前后產(chǎn)物總黃酮含量Table 2 Total flavone content in different fermentation product

Y=102.7746X-113.7318（R2=0.9996），兩者均在20～100 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖6 葛根素標(biāo)樣HPLC圖Fig.6 HPLC chromatogram of standard puerarin sample

2.5.2 方法學(xué)考察

（1）重復(fù)性：Y-1、Y-2、F-1、F-2、Z-1、Z-2中葛根素的RSD值分別為0.86%、0.72%、0.65%、0.60%、0.84%、0.92%，表明該方法重復(fù)性好。

（2）精密度：葛根素標(biāo)樣的 RSD值為0.88%，表明該方法精密度高。

（3）穩(wěn)定性：Y-1、Y-2、F-1、F-2、Z-1、Z-2中葛根素的RSD值分別為1.12%、1.28%、1.09%、1.56%、1.34%、1.28%，表明供試品在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

（4）加樣回收率：葛根素在各樣品中的加樣回收率分別為 94.2%、98.5%、96.3%、92.8%、92.2%、91.9%，表明該方法回收率高，準(zhǔn)確度高。

2.5.3 葛根素含量測定

取各發(fā)酵液按上述制備方法制備供試品溶液，按上述HPLC色譜條件平行進樣3次，不同底物發(fā)酵前后色譜圖如圖7所示。由圖可知，不同底物經(jīng)“金花”菌 LS1發(fā)酵后，葛根素（保留時間 9.031 min）響應(yīng)值升高，吸收峰面積均明顯增加，產(chǎn)生了新的物質(zhì)峰，說明“金花”菌 LS1具有轉(zhuǎn)化葛根的能力，并提高了其最主要的異黃酮類物質(zhì)葛根素的含量。根據(jù)峰面積及底物質(zhì)量計算葛根素含量，其中野葛中葛根素含量最高，粉葛次之，葛渣最低，發(fā)酵后葛根素含量均有所提高，分別提高了20.48%、7.00%和20.29%。

3 討論與展望

通過LS1在4種不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)觀察和顯微觀察，結(jié)合ITS-5.8S rDNA序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定 LS1菌株為冠突散囊菌Eurotium Cristatum，GenBank登錄號為KR812327，豐富了冠突散囊菌的種質(zhì)資源。

固體發(fā)酵結(jié)果表明，野葛、粉葛、葛渣均可以提供“金花菌”生長所需的全部營養(yǎng)成分，證實除茯磚茶外，“金花”菌也在其他植物上正常生長。目前大多數(shù)學(xué)者對“金花”菌的研究主要集中在鑒定命名及對茯磚茶風(fēng)味品質(zhì)的影響，在茶葉發(fā)酵外的其他植物領(lǐng)域研究甚少，筆者利用“金花菌”對葛根進行固體發(fā)酵，大大提高了該菌的研究潛力和價值。

圖7 不同發(fā)酵底物葛根素檢測HPLC圖Fig. 7 Chromatogram of different fermention product

通過測定發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，表明發(fā)酵后產(chǎn)物均具有一定的抗氧化效果。利用HPLC法檢測發(fā)酵前后供試品溶液中的葛根素含量，結(jié)果表明野葛的葛根素含量遠高于粉葛，更適合用作提取。野葛、粉葛、葛渣通過發(fā)酵，葛根素含量均得到了不同程度的提高，一方面可能是因為菌絲體對葛根細胞壁的穿透作用可以提高其通透性，同時“金花”菌生長過程中產(chǎn)生的酶破壞了葛根細胞壁中的半纖維素和纖維素，二者協(xié)同作用可進一步提高葛根細胞壁的通透性［18］；另一方面由于冠突散囊菌在代謝過程中產(chǎn)生的一系列酶，以葛根中存在的與葛根素結(jié)構(gòu)相似的其他前提物質(zhì)為原料，將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦鸶?，從而提高了活性成分的含量?］。同時，以葛渣為底物進行固體發(fā)酵，不僅可以變廢為寶，而且可以有效防止環(huán)境污染，提高其經(jīng)濟效益與社會效益?！敖鸹ā本l(fā)酵葛根能提高產(chǎn)物中的活性成分含量，其具體轉(zhuǎn)化途徑還需進一步研究，此外，需要優(yōu)化發(fā)酵條件以提高葛根素得率。

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中圖分類號：TS272.5+4；Q949.32

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）03-268-09

收稿日期：2015-08-17

修訂日期：2015-11-24

基金項目：國家科技支撐計劃項目（2015BAD16B00、2015BAD16B01）、國家自然基金項目（31071738、31000827）、湖南省教育廳重點項目（15A082）。

作者簡介：胡謝馨，女，碩士研究生，主要從事食品微生物方面的研究。*通訊作者：yiyoujin@163.com

Research on Separation， Identification and
Transformation Products Transformed Kudzu Root of ′Jinhua′ Fungus

HU Xiexin1， YI Youjin1*， BO Lianyang2， LI Gaoyang3， ZHOU Hongli1， ZHOU Jinwei1， XIA Bo1
1. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology， College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2. Hunan Academy of Agriculture Sciences， Changsha 410128， China； 3. Institute of Agro-product Processing Science and Technology， Hunan Provincial Academy of Agricultural Science， Changsha 410128， China

Abstract:In order to research whether the ′Jinhua′ fungus grow on and biotransformate kudzu root， get higher active fermentation products， one of advantages of strain was isolated from Fuzhuan Tea， named it as LS1. Pueraria lobata， its in the wild as the substrates in solid-state fermentation. DPPH radical scavenging capacities of fermentation products were investigated， making a determination of the contents of total flavone and fermentation products of puerarin were detected by high performance liquid chromatography. The result show that LS1 was identified preliminarily as Eurotium cristatum with GenBank accession number of KR812327 by morphological characteristics and the analysis of ITS-5.8S rDNA region. The contents of total flavone and puerarin were improved 15.97%、12.33%、20.69% and 20.48%、7%、20.29%， respectively.

Keywords:′Jinhua′ fungus， kudzu root， fermentation， identification， antioxidant activity， puerarin