銀杏葉提取物對(duì)MPTP誘導(dǎo)帕金森小鼠保護(hù)作用的研究

李金鳳，徐桂梅，張辰子，費(fèi)　帆，楊　林，代路路，孫　俠，鄺少松

(1.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣東 佛山　528248；2.增城市婦幼保健院，廣東 增城　511300)

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銀杏葉提取物對(duì)MPTP誘導(dǎo)帕金森小鼠保護(hù)作用的研究

李金鳳1，徐桂梅2，張辰子1，費(fèi)帆1，楊林1，代路路1，孫俠1，鄺少松1

(1.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣東 佛山528248；2.增城市婦幼保健院，廣東 增城511300)

【摘要】目的觀察銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，GBE)對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)不同年齡段的帕金森(parkinson’s disease，PD)小鼠的防治作用。方法將8周齡及32周齡各60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為陰性組，模型組，GBE給藥高、中、低劑量組及陽(yáng)性組，采用腹腔注射MPTP法制備PD動(dòng)物模型，采用銀杏葉提取物進(jìn)行灌胃治療。運(yùn)用爬桿、懸掛和游泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能，采用分光光度法測(cè)定小鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量，采用免疫組化法觀察小鼠大腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)及紋狀體多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DAT)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的變化。結(jié)果(1)與陰性對(duì)照組比較，8周齡模型組小鼠運(yùn)動(dòng)功能得分、大腦GSH-Px活性、黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞及紋狀體DAT陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值均顯著下降，腦組織MDA含量顯著升高，說(shuō)明PD模型復(fù)制成功。與模型組比較，銀杏葉提取物給藥組8周齡小鼠運(yùn)動(dòng)功能得分、SOD與GSH-Px活性、黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值均顯著提高，MDA含量顯著下降。(2)與陰性對(duì)照組比較，32周齡模型組小鼠運(yùn)動(dòng)功能得分、黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞以及紋狀體DAT陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值均顯著下降，SOD與GSH-Px活性降低，腦組織MDA含量升高，說(shuō)明模型復(fù)制成功。與模型組比較，銀杏葉提取物給藥組32周齡小鼠運(yùn)動(dòng)功能得分、SOD活性、黑質(zhì)TH及紋狀體DAT陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值均顯著提高，腦組織MDA含量顯著下降。結(jié)論銀杏葉提取物對(duì)MPTP誘導(dǎo)的不同年齡段PD小鼠有一定的防治作用。

【關(guān)鍵詞】銀杏葉提取物；帕金森病；MPTP；氧化應(yīng)激；神經(jīng)元

帕金森病(parkinson’s disease，PD)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失為特征，進(jìn)而導(dǎo)致紋狀體多巴胺水平降低，引發(fā)一系列典型癥狀如震顫、肌肉強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)障礙等[1]。銀杏葉提取物 (ginkgo biloba extract，GBE)主要有效成分為黃酮類和萜類內(nèi)酯化合物，藥理研究表明它具有很好的神經(jīng)保護(hù)作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)以MPTP制備不同年齡段的PD小鼠模型，觀察銀杏葉提取物對(duì)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、抗氧化作用、黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元和紋狀體DAT陽(yáng)性神經(jīng)纖維變化的影響，探討銀杏葉提取物對(duì)MPTP誘導(dǎo)的不同年齡段的帕金森模型小鼠神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制，為開發(fā)具有抗PD作用的天然藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，8周齡60只，體重18～22 g，32～36周齡60只，體重27～33g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(粵) 2013-0002】，飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(粵)2013-0002】。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，把8周齡及32周齡各60只小鼠隨機(jī)分為陰性組，模型組，銀杏葉提取物給藥高、中、低劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組6個(gè)組，每個(gè)年齡每組各10只。每日觀察動(dòng)物一般狀態(tài)表現(xiàn)并記錄動(dòng)物行為變化，每周記錄小鼠的體重。

1.2儀器與試劑

生物組織自動(dòng)染色機(jī)(孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；熒光病理圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司);全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermfisher公司);臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf股份有限公司);銀杏葉提取物滴劑(德國(guó)威瑪舒培博士藥廠);美多芭(多巴絲肼片)(上海羅氏制藥有限公司);1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶MPTP(廣州春嵐生物制品有限公司);多聚甲醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程有限公司);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)市售分析純。

1.3預(yù)處理及治療給藥方法

銀杏葉給藥組給予GBE灌胃治療，給藥濃度分別為高劑量組60 mg/kg、中劑量組40 mg/kg、低劑量組20 mg/kg[3-4]。陽(yáng)性藥物對(duì)照組小鼠灌胃給予美多芭，給藥濃度為75 mg/kg[5]，模型組與陰性對(duì)照組小鼠灌胃生理鹽水。各組均按照0.1 mL/10g體重給藥，1次/d，連續(xù)12 d。從灌胃治療第8天起進(jìn)行造模給藥，各組均于MPTP造模給藥后30 min內(nèi)完成灌胃治療。

1.4造模給藥方法

采用腹腔注射MPTP的方法制備動(dòng)物模型。GBE給藥組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組及模型組給予MPTP(30 mg/kg)[6]腹腔注射，注射量為0.1 mL/10g，1次/d連續(xù)7 d，制備PD小鼠模型，陰性組給予生理鹽水腹腔注射。

1.5行為學(xué)檢查

1.5.1爬桿試驗(yàn)

將一直徑為25 cm的軟木小球固定于一根長(zhǎng)50 cm粗1 cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布以防打滑，然后將被測(cè)小鼠放到小球上，并記錄小鼠從小球上下來(lái)、小鼠爬完桿子上半部分、小鼠爬完桿子下半部分各段所用時(shí)間，然后按以下標(biāo)準(zhǔn)記分：3 s內(nèi)完成上述某一動(dòng)作的記3分；6 s內(nèi)完成的記2分；超過(guò)6 s的記1分。每只小鼠測(cè)5次，每次檢測(cè)間隔3 min，記錄每只小鼠總得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.2懸掛實(shí)驗(yàn)

將小鼠懸掛于一水平電線上，如小鼠用兩后爪抓住電線則記3分，如用一后爪抓住電線則記2分，如果小鼠兩后爪均抓不住電線則記1分，每只小鼠測(cè)5次，每次檢測(cè)間隔3 min，最后記錄每只小鼠總得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.3游泳試驗(yàn)

將受試小鼠放入一個(gè)20×30×20 cm規(guī)格的水箱中，水溫為32～35℃，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：在受試時(shí)間2 min內(nèi)能連續(xù)不斷游泳者記3分，大部分時(shí)間游泳僅偶爾漂浮者記2.5分，漂浮時(shí)間占整個(gè)受試時(shí)間50%以上者記2分，偶爾游泳者記1.5分，偶爾用后肢游動(dòng)并漂浮在一邊者記1分。每只小鼠測(cè)3次，每次檢驗(yàn)間隔3 min，最后計(jì)算總得分情況，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

行為檢測(cè)后，采用脫頸法迅速斷頭取腦，玻璃勻漿器制成10%腦組織勻漿，-80℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用Bradford法定量蛋白，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)腦組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.7免疫組織化學(xué)檢測(cè)

行為學(xué)檢測(cè)后各組小鼠斷頭處死，迅速取出大腦，一半迅速放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)制備石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色；一半仔細(xì)分離皮層和海馬，-80℃保存，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元和紋狀體DAT陽(yáng)性神經(jīng)纖維的變化。用低倍和高倍鏡觀察切片，陽(yáng)性細(xì)胞為鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞內(nèi)有棕黃色沉著、染色明顯高于背景的細(xì)胞，用OLYMPUS BX41顯微鏡拍照。用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)分析TH、DAT的平均光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2結(jié)果

2.1小鼠行為學(xué)表現(xiàn)

小鼠注射MPTP后立刻出現(xiàn)全身震顫、豎毛、尾僵直、步態(tài)不穩(wěn)、活動(dòng)能力減弱等癥狀，8周齡小鼠持續(xù)20～30 min后逐漸減輕，32周齡小鼠持續(xù)50～60 min后逐漸減輕，兩組年齡段的小鼠24 h后基本恢復(fù)正常。隨著給藥次數(shù)的增加，上述各種急性反應(yīng)表現(xiàn)基本無(wú)太大變化，但24 h后32周齡小鼠活動(dòng)能力減弱、四肢僵硬、反應(yīng)遲緩的表現(xiàn)越來(lái)越明顯。

2.2小鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能測(cè)定結(jié)果

如表2所示，與陰性對(duì)照組比較，兩個(gè)年齡段的模型組小鼠爬桿、懸掛和游泳實(shí)驗(yàn)得分均顯著降低(P<0.05)，提示造模成功。在爬桿實(shí)驗(yàn)中，8周齡GBE給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組、32周齡GBE低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的肢體協(xié)調(diào)能力均明顯提高(P<0.05，P<0.01)；在懸掛實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)年齡段的GBE高劑組小鼠的懸掛能力均明顯增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)；在游泳實(shí)驗(yàn)中，8周齡GBE低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠游泳得分顯著提高(P<0.01)，32周齡GBE低劑量組、GBE中劑量組及陽(yáng)性對(duì)照小鼠游泳得分顯著提高(P<0.05)。

2.3小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量測(cè)定結(jié)果

如表3所示，與陰性對(duì)照組比較，8周齡模型組小鼠的GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，8周齡GBE低劑量組小鼠GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；8周齡GBE中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠SOD、GSH-Px活性均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，而MDA含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。32周齡GBE中劑量組小鼠SOD、GPSH-Px活性有不同程度的提升，MDA含量明顯降低(P<0.01)；32周齡GBE高劑量組小鼠SOD活性顯著提高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.01)。

2.4小鼠大腦黑質(zhì)TH、紋狀體DAT的表達(dá),

2.4.1黑質(zhì)TH的表達(dá)結(jié)果

如表4所示，與陰性對(duì)照組比較，兩個(gè)年齡段模型組小鼠大腦黑質(zhì)TH平均光密度值均顯著降低(P<0.01)，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(圖1B、圖1H)。與模型組比較，8周齡GBE給藥組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠大腦黑質(zhì)TH平均光密度值均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增加(圖1C-1F)；32周齡GBE高劑量組小鼠大腦黑質(zhì)TH平均光密度值顯著升高(P<0.01)，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖1L)，32周齡GBE低劑量組、GBE中劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組TH光密度值有所增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組多(圖1I-1K)。

±s)

組別groupn爬桿實(shí)驗(yàn)得分pole-climbingtestscore懸掛實(shí)驗(yàn)得分hangingtestscore游泳實(shí)驗(yàn)得分swimmingtestscore8周齡陰性對(duì)照組8weeksnegativegroup1027.20±6.887.20±6.377.95±0.808周齡模型組8weeksmodelgroup1021.30±4.95▲1.70±1.89▲7.10±1.58▲8周齡GBE低劑量組8weekslowdoseGBEgroup1026.60±6.15#4.44±4.338.17±0.75##8周齡GBE中劑量組8weeksmediumdoseGBEgroup1030.30±7.92##5.11±6.977.72±1.238周齡GBE高劑量組8weekshighdoseGBEgroup929.33±8.60##9.00±8.93##7.85±0.588周齡陽(yáng)性對(duì)照組8weekspositivegroup835.63±8.42##5.33±3.678.39±0.49##32周齡陰性對(duì)照組32weeksnegativegroup1030.10±6.796.50±3.818.10±0.7032周齡模型組32weeksmodelgroup923.56±2.19▲1.44±1.01▲7.39±0.82▲32周齡GBE低劑量組32weekslowdoseGBEgroup534.80±5.31##3.20±1.648.40±0.42#32周齡GBE中劑量組32weeksmediumdoseGBEgroup827.88±6.984.38±2.628.38±0.52#32周齡GBE高劑量組32weekshighdoseGBEgroup627.67±2.256.43±2.51#8.21±0.4932周齡陽(yáng)性對(duì)照組32weekspositivegroup631.83±5.64#5.57±2.648.50±0.50#

注：模型對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，▲P<0.05；GBE給藥組或陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note： MPTP group vs the control group,▲P<0.05; GBE group or positive control group vs MPTP group,#P<0.05，##P<0.01.

組別groupn1%腦勻漿SOD含量SODcontentof1%brainhomogenate(U/mL)10%腦勻漿GSH-Px含量GSH-Pxcontentof10%brainhomogenate(U/mgprot)1%腦勻漿MDA含量MDAcontentof1%brainhomogenate(nmol/mgprot)8周齡陰性對(duì)照組8weeksnegativegroup9124.07±8.2561.42±6.171.58±0.108周齡模型組8weeksmodelgroup10113.49±15.0451.23±7.22▲▲1.86±0.38▲8周齡GBE低劑量組8weekslowdoseGBEgroup9118.69±12.0759.79±7.65#1.74±0.418周齡GBE中劑量組8weeksmediumdoseGBEgroup8126.67±10.44#59.15±11.99#1.37±0.14##8周齡GBE高劑量組8weekshighdoseGBEgroup10125.07±11.2458.34±6.921.74±0.358周齡陽(yáng)性對(duì)照組8weekspositivegroup8127.13±20.65#63.34±10.74##1.53±0.33#32周齡陰性對(duì)照組32weeksnegativegroup10125.03±13.5356.77±5.972.03±0.3932周齡模型組32weeksmodelgroup9116.60±18.9953.60±10.081.78±0.2632周齡GBE低劑量組32weekslowdoseGBEgroup5108.24±13.5758.57±6.071.49±0.1332周齡GBE中劑量組32weeksmediumdoseGBEgroup8127.07±10.2959.56±4.381.32±0.12##32周齡GBE高劑量組32weekshighdoseGBEgroup8130.89±17.27#59.05±11.271.33±0.17##32周齡陽(yáng)性對(duì)照組32weekspositivegroup5120.32±3.7053.03±6.031.86±0.36

注：模型對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；GBE給藥組或陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note： MPTP group vs the control group,▲P<0.05，▲▲P<0.01;GBE group or positive control group vs MPTP group,#P<0.05，##P<0.01.

2.4.2紋狀體DAT的表達(dá)結(jié)果

如表4所示，與陰性對(duì)照組比較，兩個(gè)年齡段模型組小鼠大腦紋狀體尾殼核DAT平均光密度值均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，DAT陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少(圖2B、圖2H)。與模型組比較，8周齡GBE給要組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠大腦紋狀體尾殼核DAT平均光密度值沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加不明顯(圖2C-2F)；32周齡GBE高劑量組小鼠大腦紋狀體尾殼核DAT平均光密度值顯著升高(P<0.05)，DAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖2L)，DAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加不明顯(圖2I-2K)。

3討論

PD是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)的好發(fā)于中老年人第二大神經(jīng)退行性疾病，臨床常見(jiàn)癥狀有運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)障礙。 MPTP是人工合成毒品的副產(chǎn)物，MPP+是其活性代謝產(chǎn)物，其可以選擇性抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。MPTP誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠是目前學(xué)術(shù)界廣泛運(yùn)用并得到公認(rèn)的研究PD的經(jīng)典模型[8]。由于不同周齡的C57BL/6小鼠對(duì)于MPTP的敏感程度有明顯的差異[9]，為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具參考價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)選用了不同年齡段的小鼠作為研究對(duì)象。通過(guò)爬桿、懸掛和游泳實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)8周齡和32周齡PD小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能，研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物(GBE)能夠顯著增強(qiáng)不同年齡段PD小鼠的肢體協(xié)調(diào)能力，推測(cè)其對(duì)PD的癥狀具有改善作用。

組別groupn黑質(zhì)TH平均光密度值THmeanopticaldensityinsubstantialnigraparscompacta紋狀體尾殼核DAT平均光密度值DATmeanopticaldensityinstriatum8周齡陰性對(duì)照組8weeksnegativegroup100.588±0.0540.199±0.0688周齡模型組8weeksmodelgroup100.372±0.024▲▲0.081±0.007▲8周齡GBE低劑量組8weekslowdoseGBEgroup90.517±0.056##0.081±0.0048周齡GBE中劑量組8weeksmediumdoseGBEgroup80.527±0.068#0.084±0.0168周齡GBE高劑量組8weekshighdoseGBEgroup90.528±0.069##0.087±0.0178周齡陽(yáng)性對(duì)照組8weekspositivegroup90.526±0.066##0.086±0.01932周齡陰性對(duì)照組32weeksnegativegroup100.559±0.0430.195±0.04232周齡模型組32weeksmodelgroup90.379±0.026▲▲0.082±0.015▲▲32周齡GBE低劑量組32weekslowdoseGBEgroup50.493±0.0390.081±0.01932周齡GBE中劑量組32weeksmediumdoseGBEgroup80.495±0.0640.113±0.03032周齡GBE高劑量組32weekshighdoseGBEgroup80.535±0.053##0.158±0.037#32周齡陽(yáng)性對(duì)照組32weekspositivegroup60.468±0.0870.109±0.033

注：模型對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；GBE給藥組或陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note： MPTP group vs the control group,▲P<0.05，▲▲P<0.01; GBE group or positive control group vs MPTP group,#P<0.05，##P<0.01.

注：A：8周齡陰性對(duì)照組；B：8周齡模型組；C：8周齡陽(yáng)性對(duì)照組；D：8周齡GBE低劑量組；E：8周齡GBE中劑量組；F：8周齡GBE高劑量組； G：32周齡陰性對(duì)照組；H：32周齡模型組；I：32周齡陽(yáng)性對(duì)照組；J：32周齡GBE低劑量組；K：32周齡GBE中劑量組；L：32周齡GBE高劑量組。 圖1　PD小鼠大腦黑質(zhì)TH表達(dá)水平(標(biāo)尺=50 μm)Note:A：8 weeks negative group；B：8 weeks model group；C：8 weeks positive group；D：8 weeks low dose GBE group；E：8 weeks medium dose GBE group；F：8 weeks high dose GBE group； G：32 weeks negative group；H：32 weeks model group；I：32 weeks positive group；J：32 weeks low dose GBE group；K：32 weeks medium dose GBE group；L：32 weeks high dose GBE group.Fig.1　TH expression in substantial nigra pars compacta of PD mice(Bar=50 μm)

注：A：8周齡陰性對(duì)照組；B：8周齡模型組；C：8周齡陽(yáng)性對(duì)照組；D：8周齡GBE低劑量組；E：8周齡GBE中劑量組；F：8周齡GBE高劑量組； G：32周齡陰性對(duì)照組；H：32周齡模型組；I：32周齡陽(yáng)性對(duì)照組；J：32周齡GBE低劑量組；K：32周齡GBE中劑量組；L：32周齡GBE高劑量組。 圖2　PD小鼠大腦紋狀體DAT表達(dá)水平(標(biāo)尺=50 μm)Note:A：8 weeks negative group；B：8 weeks model group；C：8 weeks positive group；D：8 weeks low dose GBE group；E：8 weeks medium dose GBE group；F：8 weeks high dose GBE group； G：32 weeks negative group；H：32 weeks model group；I：32 weeks positive group；J：32 weeks low dose GBE group；K：32 weeks medium dose GBE group；L：32 weeks high dose GBE group.Fig.2　DAT expression in striatum of PD mice(Bar=50 μm)

已有研究表明，氧自由基與PD發(fā)病密切相關(guān)[10]，SOD及GSH-Px在清除自由基方面具有重要作用，其活性的降低會(huì)加劇自由基對(duì)神經(jīng)的毒性作用[11]。MDA含量是反應(yīng)氧自由基水平的重要指標(biāo)，可間接反映細(xì)胞損傷的程度。本研究中顯示，銀杏葉提取物(GBE)給藥組小鼠的SOD、GSH-Px活性較模型組小鼠有不同程度的提高，MDA水平下降，提示GBE可能通過(guò)增加腦組織抗氧化酶的含量來(lái)提高機(jī)體的抗氧化能力，保護(hù)脂質(zhì)免受病理性過(guò)氧化損傷，顯著改善MPTP誘導(dǎo)的帕金森病的氧化應(yīng)激狀態(tài)。MDA測(cè)定結(jié)果顯示，相對(duì)于8周齡小鼠，GBE對(duì)32周齡小鼠的抗氧化能力改善更為顯著。

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)及多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素生物合成過(guò)程所需的限速酶。大腦多巴胺能神經(jīng)元可以從細(xì)胞外攝取酪氨酸，在胞漿內(nèi)經(jīng)TH催化形成左旋多巴，再經(jīng)芳香族氨基酸脫羧酶催化形成多巴胺(dopamine，DA)。DA是一種兒茶酚胺類神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，是用來(lái)幫助細(xì)胞傳送脈沖的化學(xué)物質(zhì)，主要負(fù)責(zé)大腦的愉悅和獎(jiǎng)賞，將興奮及開心的信息傳遞，在處理身體的學(xué)習(xí)、記憶、注意力、運(yùn)動(dòng)、新陳代謝中發(fā)揮重要作用。TH是DA能神經(jīng)元的特有酶，染色陽(yáng)性標(biāo)志細(xì)胞存活，其TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)可直觀反映腦內(nèi)DA含量[12]。本實(shí)驗(yàn)兩個(gè)年齡段PD小鼠的TH免疫陽(yáng)性染色結(jié)果均顯示，陰性對(duì)照組小鼠TH陽(yáng)性細(xì)胞豐富，細(xì)胞胞體著色均勻，突起豐富，PD模型組小鼠TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量呈明顯的丟失，銀杏葉提取物給藥組多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞沒(méi)有明顯的丟失，隨著給藥濃度的升高，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈遞增趨勢(shì)，提示銀杏葉提取物減輕了MPTP對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用，TH陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值結(jié)果顯示，銀杏葉提取物對(duì)8周齡小鼠的治療效果更明顯。

DAT 是位于 DA 能神經(jīng)元突觸前膜的一種膜蛋白分子，屬于 Na+/Cl-依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，PD 患者腦內(nèi) DAT 水平的降低與 DA 能神經(jīng)元減少呈正相關(guān)[13]。DAT能夠通過(guò)重?cái)z取機(jī)制把DA重吸收進(jìn)細(xì)胞，以確保DA不會(huì)不受限制的過(guò)多產(chǎn)生，DAT 的水平是DA能神經(jīng)元最為特異的標(biāo)記物，已成為診斷早期 PD的敏感指標(biāo)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織紋狀體內(nèi)DAT平均光密度值顯著降低，DAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，而給予不同濃度的銀杏葉提取物治療后，其減少得到不同程度的抑制，并呈劑量依賴性，說(shuō)明銀杏葉提取物能在一定程度上減輕MPTP對(duì)小鼠腦組織的病理?yè)p傷，DAT陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值結(jié)果顯示，銀杏葉提取物對(duì)32周齡小鼠的治療效果更明顯。

本實(shí)驗(yàn)中，銀杏葉提取物(GBE)顯著改善了 PD 小鼠的行為協(xié)調(diào)能力，顯著增強(qiáng)了PD小鼠抗氧化應(yīng)激能力，明顯抑制了 MPTP 誘導(dǎo)的 TH 陽(yáng)性細(xì)胞和 DAT 陽(yáng)性細(xì)胞的減少，對(duì) PD 有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

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〔修回日期〕2015-10-21

[基金項(xiàng)目]廣東省中醫(yī)藥局課題項(xiàng)目(20122199);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B060300033)。

[作者簡(jiǎn)介]李金鳳(1986-)女，碩士，實(shí)習(xí)研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?[通訊作者]鄺少松(1973-)女，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥理、毒理學(xué)研究。E-mail: kuangss@126.com。

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 01-0046-07

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.009

Protective effect of ginkgo biloba extract on mouse with parkinson’s disease induced by MPTP

LI Jin-feng1, XU Gui-mei2,ZHANG Chen-zi1, FEI Fan1, YANG Lin1, DAI Lu-lu1, SUN Xia1, KUANG Shao-song1

(1.Guangdong Medical Laboratory Animal Center, Guangdong Foshan 528248,China；2. Zengcheng maternal and Child Health Hospital，Guangdong Zengcheng 511300,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutical effect of Ginkgo Biloba extract (GBE) on different ages of parkinsono Biloba e (PD) mice that induced by MPTP. MethodsSixty adult mice (8 weeks) and sixty older mice (32 weeks) were randomly divided into 6 groups: negative group, model group, positive group, high, medium and low dose GBE group. PD animal model were built through injecting with MPTP and then treated with different drugs accordingly. The limb motor function of mice were tested by using pole-climbing, hanging and swimming test. The activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and the content of malondial dehyde (MDA) in the brain tissue were measure using spectro photography. The number of positive neurons expressing tyrosine hydroxylase (TH) in substantial nigra pars compacta and dopamine transporters (DAT) in striatum were detected by using the method of immunohistochemistry. Results1. The motor function score, the activity of GSH-Px, and the mean optical density of TH and DAT in brain tissues of model group of 8 weeks significantly decreased compared with negative group, while the content of MDA was significantly raised, showing the model of PD was successfully established. The function score, the activities of SOD and GSH-Px, the mean optical density of TH and DAT in brain tissues of the GBE treatment group significantly raised compared with the model group, while the content of MDA was significantly decreased. 2. The motor function score, the activity of GSH-Px, and the mean optical density of TH and DAT in brain tissues of model group of 32 weeks significantly decreased compared with negative group, while the content of MDA was significantly raised, showing the model of PD was successfully established. The function score, the activities of SOD and GSH-Px, the mean optical density of TH and DAT in brain tissues of the GBE treatment group significantly raised compared with the model group, while the content of MDA was significantly decreased. ConclusionsThe preventive medication of GBE shows a protective effect on mice of different ages with PD induced by MPTP.

【Key words】Ginkgo biloba extract; Parkinson's disease; MPTP; Oxidative stress; Neuron