改良顱內(nèi)加壓法兔腦死亡模型建立及其狀態(tài)的維持

潘宜鵬，劉　煜，李　明，任秀昀

(1. 武警總醫(yī)院移植科，北京　100039；2. 武警總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，北京　100039；3. 武警總醫(yī)院超聲科，北京　100039)

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改良顱內(nèi)加壓法兔腦死亡模型建立及其狀態(tài)的維持

潘宜鵬1，劉煜1，李明2，任秀昀3

(1. 武警總醫(yī)院移植科，北京100039；2. 武警總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，北京100039；3. 武警總醫(yī)院超聲科，北京100039)

【摘要】目的探尋改良顱內(nèi)加壓法制作兔腦死亡模型及維持腦死亡狀態(tài)的方法。方法新西蘭大白兔15只，隨機(jī)分成2組：假手術(shù)組(B組，n=6)，僅顱內(nèi)插管，行麻醉維持；腦死亡組(A組，n=9)，通過改良的顱內(nèi)加壓法制作腦死亡模型。記錄平均動(dòng)脈壓(MAP)和心率(HR)的變化。通過呼吸機(jī)和血管活性藥物將生命體征維持在某一可控水平。結(jié)果A組9只兔中8只建模成功，在顱內(nèi)加壓過程中隨著顱內(nèi)壓力的增高，MAP和HR呈波浪狀逐漸升高。麻醉狀態(tài)下和腦死亡時(shí)MAP峰值分別為(80.63±8.45) mmHg、(111.63±7.71) mmHg，二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。麻醉狀態(tài)下、腦死亡時(shí)和腦死亡后2 h的HR分別為(153.25±14.35) 次/min、(262.38±16.60) 次/min和(218.50±10.27) 次/min，三者之間兩兩相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05)。結(jié)論與傳統(tǒng)術(shù)式相比，改良后的方法可以穩(wěn)定、可靠地建立兔腦死亡模型；通過及時(shí)有效的呼吸、循環(huán)支持，腦死亡狀態(tài)可以長時(shí)間維持。

【關(guān)鍵詞】腦死亡；模型制作；兔；生命體征

隨著我國器官捐獻(xiàn)工作的法制化，腦死亡器官捐獻(xiàn)(donor after brain death, DBD)和腦-心雙死亡標(biāo)準(zhǔn)器官捐獻(xiàn)(donation after brain death plus cardiac death, DBCD)為我國現(xiàn)階段的主要器官捐獻(xiàn)類型[1]。而DBD和DBCD患者都不可避免地經(jīng)歷低血壓、低氧血癥及長時(shí)間熱缺血損傷[2]，嚴(yán)重影響器官質(zhì)量[3]。因此建立一個(gè)穩(wěn)定的動(dòng)物腦死亡模型及腦死亡狀態(tài)長時(shí)間維持對(duì)于研究腦死亡供者器官的變化至關(guān)重要。我研究所將傳統(tǒng)的制作過程進(jìn)行改良，使其具有很好的可操作性，并可較長時(shí)間的維持腦死亡狀態(tài)，為腦死亡器官捐獻(xiàn)的臨床研究奠定了模型基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPS級(jí)新西蘭雄性兔15只，體重2.2～2.8 kg，12周齡。由中國人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供【SCXK(京)2011-0006】。實(shí)驗(yàn)在中國人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行【SYXK(軍)2012-0062】。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

BL-420生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、HX-100E動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)、JR. 1/2智能恒溫控制儀 (成都泰盟科技有限公司)、便攜超聲儀器(意大利百勝公司，型號(hào)：MyLab 30 Gold)、Foley氣囊導(dǎo)管(美國巴德國際有限公司)等。多巴胺注射液(2 mL∶20 mg，批號(hào)：33140506，上海禾豐制藥有限公司)。

1.3改良兔腦死亡模型的建立方法

術(shù)前準(zhǔn)備：術(shù)前兔禁食12 h，自由飲水。稱重后進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉(枸櫞酸芬太尼注射液和咪達(dá)唑侖注射液混合制劑肌注)。耳緣靜脈滴注咪達(dá)唑侖注射液和鹽酸賽拉嗪注射液進(jìn)行麻醉維持。備皮，沿頸部做一縱切口，游離氣管行氣管插管后固定，備接呼吸機(jī)，縫合皮膚。于右側(cè)腹股溝區(qū)做一斜行切口游離出股動(dòng)脈及股靜脈。行股動(dòng)脈插管，連接壓力傳感器；留置股靜脈插管，肝素封管以備術(shù)中采血，縫合皮膚。額、頂和枕極顱骨骨膜下埋置腦電圖銀針電極。四肢連接心電圖導(dǎo)聯(lián)。便攜超聲儀監(jiān)測心臟超聲，描記心率。自動(dòng)溫度監(jiān)測儀監(jiān)測兔肛溫，通過加熱設(shè)備維持在37.5℃。

顱內(nèi)球囊導(dǎo)管植入方法：于顱頂正中做矢狀切口，分離皮下組織和骨膜至顱骨面，于雙眼角后緣連線中點(diǎn)后方0.5 cm旁開0.5 cm處，用木刻雕刀刻出直徑約0.5 cm大小孔道(兔顱骨厚度約2 mm，操作時(shí)勿傷及硬腦膜及腦組織)，保持硬腦膜完整，置入6號(hào)Foley 球囊導(dǎo)管。骨蠟封閉，縫合切口。保留6號(hào)Foley 球囊導(dǎo)尿管。腦死亡組經(jīng)導(dǎo)管漸進(jìn)式注入生理鹽水，每次 0.5 mL，緩慢勻速，間隔約5分鐘，總?cè)肓考s2 mL時(shí)每次注入0.2 mL，兔出現(xiàn)躁動(dòng)，瞳孔逐步縮小，球結(jié)膜水腫，自主呼吸停止后停止加壓。自主呼吸停止時(shí)，氣管插管接動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)置呼吸頻率 35 次/min，潮氣量 25 mL/kg，吸呼比 5∶4，氧濃度50%[4]。保留導(dǎo)管內(nèi)生理鹽水至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。腦死亡的確認(rèn)參照衛(wèi)生部腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)起草小組制定的《腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)》及國外文獻(xiàn)，擬定本實(shí)驗(yàn)?zāi)X死亡模型建立標(biāo)準(zhǔn)：①麻醉停止后仍處于深昏迷狀態(tài)；②瞳孔散大，對(duì)光反射消失，角膜反射消失；③自主呼吸停止，自主呼吸誘發(fā)實(shí)驗(yàn)陰性；④腦電圖靜息成直線；⑤阿托品實(shí)驗(yàn)陰性[4-5]。

腦死亡狀態(tài)維持方法：我們認(rèn)為加壓過程中兔自主呼吸停止則腦死亡誘導(dǎo)成功，此后開始進(jìn)行腦死亡狀態(tài)維持，觀察指標(biāo)變化，多巴胺 4 μg/(kg·min)靜脈滴入維持血壓，并隨血壓變化調(diào)整輸液速度，本實(shí)驗(yàn)維持腦死亡狀態(tài)8 h后撤除呼吸機(jī)，處死兔。手術(shù)全程輸注液體300 mL。假手術(shù)組僅行硬膜外插管，不加壓。余操作和腦死亡組相同。

1.4監(jiān)測指標(biāo)

監(jiān)測所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均動(dòng)脈壓、心率等變化。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

2結(jié)果

2.1兔腦死亡模型建立

腦死亡組有8只成功建立腦死亡模型，并且均維持超過8 h；其中1只實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)心衰，經(jīng)搶救無效死亡；另外8只均采用緩慢間斷顱內(nèi)加壓法建立腦死亡模型，球囊內(nèi)緩慢間斷注入生理鹽水(2.4±0.2) mL時(shí)，兔即出現(xiàn)腦死亡表現(xiàn)。兔體溫維持在(37±0.3)℃。尿量(0.52±0.16) mL/min。每只兔的總建模時(shí)間為(100±10) min，其中誘導(dǎo)腦死亡時(shí)間(30±5) min。8只兔均維持腦死亡狀態(tài)480 min以上。假手術(shù)組麻醉狀態(tài)下維持8 h后，撤除麻藥后半小時(shí)內(nèi)6只兔均自然蘇醒，然后空氣栓塞處死。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后焚燒兔。

2.2腦死亡前后兔MAP及HR變化

B組兔在誘導(dǎo)腦死亡過程中MAP和HR 隨顱內(nèi)間斷加壓呈現(xiàn)波浪狀升降變化，總體趨勢不斷升高。加壓前MAP和HR分別為(80.63±8.45) mmHg和(153.25±14.35) 次/min，球囊內(nèi)緩慢間斷注入生理鹽水(2.4±0.2) mL時(shí)，MAP和HR開始急劇升高，達(dá)到峰值(111.63±7.71) mmHg和(262.38±16.60) 次/min，峰值維持約(1.5±0.2) min后開始急劇下降，呼吸深慢，瞳孔先縮小后散大，直到自主呼吸停止，腦電圖靜息，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，同時(shí)應(yīng)用血管活性藥物，誘導(dǎo)腦死亡后2 h為(50.13±2.59) mmHg。MAP峰值與加壓前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；腦死亡后2 h與加壓前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。B組峰值及腦死亡后2 h的MAP與A組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)MAP的比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。實(shí)驗(yàn)全程MAP均維持在40 mmHg以上。誘導(dǎo)腦死亡過程中HR呈現(xiàn)升高趨勢。加壓前HR為(153.25±14.35) 次/min，加壓至腦死亡過程中峰值HR為(262.38±16.60) 次/min，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；腦死亡2 h后HR為(218.50±10.27) 次/min,與峰值HR(262.38±16.60) 次/min和加壓前HR比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。B組誘導(dǎo)腦死亡后的HR與A組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)HR的比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。A組行顱內(nèi)插管前后MAP及HR的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組與B組MAP各時(shí)間點(diǎn)對(duì)比見表1；A組與B組HR各時(shí)間點(diǎn)對(duì)比見表2。

2.3撤除搶救

動(dòng)物脫離呼吸機(jī)和停止多巴胺滴注后血壓直線下降，約5 min后血壓壓差為零。

3討論

現(xiàn)階段，腦死亡的定義為枕骨大孔以上水平包括大腦、小腦和腦干等在內(nèi)的全腦功能完全地不可逆性損害[6]。腦死亡狀態(tài)超越昏迷狀態(tài)，即無自主呼吸，需要呼吸機(jī)維持，全身肌肉松弛，各種反射消失，低體溫及尿崩，但是心跳仍存在。概念重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)全腦功能不可逆性損傷。生理學(xué)研究表明，機(jī)體的生命中樞即血壓和呼吸調(diào)節(jié)中樞位于腦干，血壓調(diào)節(jié)中樞通過改變心肌收縮力和心率來調(diào)節(jié)血壓變化，腦死亡研究過程中腦干會(huì)不可避免的遭受打擊，機(jī)體血壓、心率和呼吸會(huì)發(fā)生劇烈改變，所以監(jiān)測血壓和心率變化可直接反應(yīng)腦死亡的發(fā)生過程。

表1　兩組兔實(shí)驗(yàn)期間不同時(shí)間點(diǎn)MAP變化(mmHg)

注：與同組加壓前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，aP< 0.05；與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，bP< 0.05。

Note：Compared to Pre-compression in group A,aP< 0.05; Compared to group B,bP< 0.05.

表2　兩組兔實(shí)驗(yàn)期間不同時(shí)間點(diǎn)HR變化(次/min)

注：與同組加壓前比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，aP< 0.05；與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，bP< 0.05。

Note：Compared to Pre-compression in group A,aP< 0.05; Compared to group B,bP< 0.05.

隨著國內(nèi)腦死亡器官捐獻(xiàn)的發(fā)展，有關(guān)腦死亡動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)運(yùn)而生。腦死亡模型的制作方法包括頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎法、呼吸暫停法[7-8]、膜外加壓法、顱內(nèi)制造血腫法[9]、斷頭法等[10-11]。研究表明，大量原發(fā)性腦死亡病例的實(shí)踐報(bào)告中顯示90以上存在腦疝[6]，提示顱內(nèi)高壓可能是腦死亡重要發(fā)病機(jī)制。國外已有關(guān)于鼠、豬和犬腦死亡模型建立的報(bào)道[12-13]。因此參照相關(guān)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用改良的顱內(nèi)加壓法制作兔腦死亡模型，增加了模型制作過程中的可行性和成功率，并長時(shí)間維持腦死亡狀態(tài)。傳統(tǒng)方法相關(guān)文獻(xiàn)已有闡述，文中不再設(shè)立傳統(tǒng)術(shù)式組，與傳統(tǒng)方法比較，我們將模型制作過程及某些指標(biāo)的監(jiān)測進(jìn)行改進(jìn)：首先我們選用木刻雕刀將顱骨刻出直徑0.5 cm大小孔徑，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道使用顱鉆[4]，實(shí)踐表明顱鉆鉆孔不穩(wěn)定，兔尸體解剖發(fā)現(xiàn)其顱骨較薄，顱骨鉆容易破壞腦組織；其次由于心電圖描記心率時(shí)會(huì)受到較多干擾，所以其值波動(dòng)較大很難反映出心率的真實(shí)變化，我們應(yīng)用術(shù)中便攜超聲機(jī)行兔心臟彩超，最為準(zhǔn)確的反應(yīng)心率變化。

研究顯示，腦死亡誘導(dǎo)過程中MAP隨間斷顱內(nèi)加壓呈波浪狀升降，總體上升，當(dāng)腦死亡誘導(dǎo)成功后驟然下降，具有特征性改變。與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符[14]。通過呼吸機(jī)和多巴胺將MAP維持在45 mmHg；加壓過程中HR在加壓過程中升高明顯，迅速達(dá)到峰值。腦死亡誘導(dǎo)后心率有下降趨勢但仍高于加壓前，且維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。我們推測出現(xiàn)此結(jié)果可能有兩種原因：第一，機(jī)體控制心率的神經(jīng)中樞在延髓，靜息狀態(tài)下心率被迷走神經(jīng)抑制，當(dāng)機(jī)體腦死亡后這種抑制關(guān)系解除，心率加快；第二，腦死亡誘導(dǎo)成功后兔血壓急驟下降，需要大量大巴按維持，而大劑量多巴胺可作用于β受體，因此心率加快[15]。但有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔剿饕粋€(gè)具有可行性且成功率高的腦死亡模型制作以及腦死亡狀態(tài)維持的方法，為今后腦死亡供體器官質(zhì)量的評(píng)估研究提供穩(wěn)定的模型基礎(chǔ)。對(duì)于腦死亡狀態(tài)下器官功能、器官血流動(dòng)力學(xué)及病理學(xué)方面的改變亟待進(jìn)一步研究。

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〔修回日期〕2015-10-21

[基金項(xiàng)目]武警總部課題(WZ2014002)。

[作者簡介]潘宜鵬(1988-)，男，碩士，研究方向：肝臟移植方向。 [通訊作者]任秀昀(1970-)，女，博士，研究方向：超聲造影，E-mail: rrcloud@sina.com。

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 01-0025-04

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.005

Establishment of brain death model for rabbits in a modified way by increasing intracranial pressure and maintaining the state of brain death

PAN Yi-peng1，LIU Yu1，LI Ming2，REN Xiu-yun3

(1. Department of Transplantation, the General Hospital of the Chinese People's Armed Police, Beijing 100039, China; 2.Medical department, the General Hospital of the Chinese People’s Armed Police, Beijing 100039, China; 3.Department of Ultrasound, the General Hospital of the Chinese People’s Armed Police, Beijing 100039, China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the modified increasing intracranial pressure method to set up the brain death model for rabbits and sustain the state of brain death. Methods15 healthy New Zealand rabbits were divided into brain death group (Group A，n=9) and sham operation group(Group B，n=6) randomly. The 9 brain death rabbits were set up by increasing intracranial pressure in a modified way. The sham operation rabbits were only sustained with anesthesia．Recorded the mean artery pressure (MAP) and heart rate (HR). ResultsIn group A, the 8 brain death rabbits were successfully set up. Only 1 died of heart failure. Compared to Group B, the MAP and HR of Group A rise up greatly during increasing intracranial pressure and presented an increasing trend. The peak MAP and HR were (111.63±7.71) mmHg and (262.38±16.60)beats/min which were much higher than the MAP(80.63±8.45) mmHg and HR(153.25±14.35) beats/min before increasing intracranial pressure(P < 0.05). After brain death, MAP decreased sharply to 45mmHg. 2 hours after brain death, HR (218.50±10.27) beats/min presented an decreasing trend too, which showed a significantly statistic difference to peak HR(262.38±16.60) and HR(153.25±14.35) beats/min before brain death(P < 0.05). Conclusions Compared to traditional method, the brain death model could be established stably and securely in the modified way and maintained for long time with the respiration and circulation supports.

【Key words】Brain death；Model establishing；Rabbits；Vital signs