首烏方對(duì)左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥模型大鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

劉　洋，焦　玥，孫丹丹，王丹巧，趙小亮，李　濤，張美玉

(中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心, 北京　100700)

?

首烏方對(duì)左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥模型大鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

劉洋，焦玥，孫丹丹，王丹巧，趙小亮，李濤，張美玉

(中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心, 北京100700)

【摘要】目的觀察中藥首烏方(shou wu fang，SWF)對(duì)左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥(levodopa-induced dyskinesias, LID)模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)及其腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討首烏方干預(yù)異動(dòng)癥的作用機(jī)制。方法采用6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)腦內(nèi)立體定位注射造成偏側(cè)帕金森病(parkinson’s disease，PD)大鼠模型，成模動(dòng)物灌胃投予左旋多巴(levodopa, L-DOPA)或L-DOPA+不同劑量SWF，分為L(zhǎng)-DOPA組、L-DOPA+SWF低劑量組、LID+SWF高劑量組，另設(shè)假手術(shù)組。所有動(dòng)物連續(xù)給藥22 d，給藥期間對(duì)大鼠進(jìn)行異常不自主運(yùn)動(dòng)(abnormal involuntary movement, AIM)評(píng)分。第 22天采用微透析技術(shù)對(duì)清醒大鼠紋狀體細(xì)胞外液進(jìn)行取樣，并采用高效液相-熒光法檢測(cè)樣本中谷氨酸(glutamate, Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)水平動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果大鼠給服L-DOPA后，逐漸出現(xiàn)AIM，至給藥結(jié)束，與假手術(shù)組相比，L-DOPA組AIM評(píng)分顯著升高(P < 0.01)；與L-DOPA組相比，L-DOPA+SWF高劑量組AIM評(píng)分顯著降低(P < 0.05)。第22天，與假手術(shù)組相比，各給藥組大鼠紋狀體細(xì)胞外液Glu、GABA水平升高，其中L-DOPA組Glu、GABA水平表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05)；與L-DOPA組相比，L-DOPA+SWF高劑量組Glu水平明顯降低(P < 0.05)。給藥后60 min，L-DOPA+首烏方各劑量組Glu、GABA水平均顯著低于L-DOPA組(P < 0.05, P < 0.01)。結(jié)論SWF能夠減輕L-DOPA引起的副反應(yīng)，改善LID大鼠行為學(xué)癥狀，其作用機(jī)制或與其改善LID大鼠腦內(nèi)異常的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥；首烏方；微透析；谷氨酸；γ-氨基丁酸

帕金森病(parkinson’s disease，PD)是臨床常見的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于老年人。左旋多巴(levodopa，L-DOPA)自20世紀(jì)60年代問世以來(lái)，一直是治療PD最有效的藥物。然而，隨病情的發(fā)展，長(zhǎng)期使用此類藥物會(huì)引起癥狀波動(dòng)和運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥，如左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥(levodopa-induced dyskinesis，LID)等[1]。值得注意的是，藥物的副反應(yīng)比疾病本身更加嚴(yán)重[2-3]，運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥是晚期PD患者致殘的重要原因[4]。這不僅給PD的治療增加困難，也得病人帶來(lái)更為沉重的生理、心理負(fù)擔(dān)。因此，深入了解LID發(fā)病機(jī)制，減少或避免LID的產(chǎn)生，對(duì)于帕金森病的治療具有重要意義。

中藥首烏方(shou wu fang，SWF)是臨床有效的中藥復(fù)方，用于PD治療。與L-DOPA配伍應(yīng)用，可以減少L-DOPA用量，提高治療組的總有效率[5]。課題組前期研究結(jié)果提示[6]，SWF增加6-羥基多巴胺(6-OHDA)灌流后大鼠紋狀體細(xì)胞外液DA遞質(zhì)的濃度，并使外源性L-DOPA引起的DA波動(dòng)平緩，這在一定程度上提示了SWF或?qū)ID始動(dòng)環(huán)節(jié)具有干預(yù)作用。進(jìn)一步研究表明SWF能夠改善LID大鼠行為學(xué)癥狀，改善LID大鼠腦內(nèi)糖類物質(zhì)代謝障礙[7]、減輕LID大鼠紋狀體內(nèi)過氧化損傷[8]，這在一定程度上提示了SWF干預(yù)LID發(fā)病的作用機(jī)制，然而，其深入的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)中采用L-DOPA誘發(fā)6-OHDA損毀致PD模型大鼠產(chǎn)生異動(dòng)癥，同時(shí)配伍SWF，大鼠紋狀體細(xì)胞外液谷氨酸(glutamate)和γ-氨基丁酸(GABA)水平變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，從SWF調(diào)節(jié)腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平的角度，進(jìn)一步對(duì)首烏方干預(yù)LID的作用機(jī)制進(jìn)行探索，為臨床中西藥合用治療帕金森病、防治西藥引起的副反應(yīng)提供思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，7周齡，體重200～250 g。購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2010-0001】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(京)2010-0021】，溫度控制在24℃，自由飲食飲水，每日12 h光照。

1.1.2試劑與藥品

6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine，6 OHDA)、抗壞血酸(antiscorbic acid)、谷氨酸(glutamate，Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)為Sigma公司產(chǎn)品；阿撲嗎啡為中國(guó)食品藥品檢定研究所提供；美多芭(0.25 g/片，每片含L-DOPA 200 mg+芐絲肼50 mg)為上海羅氏公司產(chǎn)品(批號(hào)：SH1556)；復(fù)方氯化鈉注射液為北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，首烏方水煎液由課題組自行制備。

1.1.3儀器設(shè)備

腦內(nèi)微透析系統(tǒng)為瑞典CMA公司產(chǎn)品，包括：CMA/12探針(透析膜長(zhǎng)4 mm)及探針套管、CMA/120清醒動(dòng)物裝置、CMA/102微量泵、CMA/W70低溫樣品自動(dòng)收集器；其他：微量進(jìn)樣針為上海高鴿工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；大鼠腦立體定位儀STRONG8003、動(dòng)物體溫維持儀-69001、顱鉆/90-102購(gòu)自深圳瑞沃德公司。

1.2方法

1.2.1造模與分組

參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[9]，SD大鼠腦內(nèi)右側(cè)黑質(zhì)致密部(substantia nigra compacta，SNc)、中腦腹側(cè)被蓋部(ventral tegmental area，VTA)注射6-OHDA建立PD模型；假手術(shù)組在相同位點(diǎn)注射含0.05% antiscorbic acid的生理鹽水，其余操作均與模型組相同。注射后3周，大鼠皮下注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)，待出現(xiàn)穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)癥狀后，記錄1 h內(nèi)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)總?cè)?shù)，大于100 圈/h即視為PD模型制作成功[10]。成模動(dòng)物隨機(jī)分為L(zhǎng)-DOPA組、L-DOPA+SWF低劑量組、L-DOPA+SWF高劑量組。另設(shè)假手術(shù)組。1.2.2L-DOPA誘發(fā)LID及給藥

L-DOPA組大鼠給投予美多芭(30 mg/kg/d，相當(dāng)于L-DOPA 24 mg+ 芐絲肼 6 mg，以下相同，灌胃給藥(intragastric administration，i.g.)，L-DOPA+SWF低劑量組組投予美多芭(30 mg/kg/d)及低劑量首烏方水煎液(生藥量18 g/kg/d，i.g.)，L-DOPA+SWF高劑量組組投予美多芭(30 mg/kg/d)及高劑量首烏方水煎液(生藥量36 g/kg/d，i.g.)，假手術(shù)組投予等體積純水(i.g.)。給藥1次/d，連續(xù)給藥22 d。1.2.3異常不自主運(yùn)動(dòng)(abnormal involuntary movement, AIM)評(píng)分

參照文獻(xiàn)方法[11-12]，于給藥第 1、7、14、21天對(duì)各組大鼠進(jìn)行AIM評(píng)分，每30 min評(píng)分1次，評(píng)價(jià)持續(xù)120 min(共評(píng)分4次)。AIM包括刻板動(dòng)作和對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，其中刻板動(dòng)作又包括上肢AIM、軸性AIM和口面部AIM。根據(jù)其癥狀有或無(wú)以及嚴(yán)重程度劃分為五個(gè)等級(jí)(0～4分)，其中0分：無(wú)；1分：偶爾出現(xiàn)；2分：經(jīng)常出現(xiàn)；3分：持續(xù)存在，刺激使之停止；4分：持續(xù)存在，刺激也不能使之停止(理論上每只動(dòng)物最高評(píng)分為64分)。

1.2.4大鼠清醒狀態(tài)下紋狀體微透析取樣

給藥第21天，末次行為學(xué)評(píng)價(jià)后，大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，于大鼠腦右側(cè)紋狀體內(nèi)(A：+0.2 mm，R：+3.0 mm，V：-3.5 mm)埋入探針套管。次日，大鼠在清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下插入微透析探針。用復(fù)方氯化鈉溶液以2.5 μL/min的速度灌流，平衡60 min后，開始收集透析液，每30 min收集1管，灌流至90 min時(shí)動(dòng)物灌胃給藥1次，繼續(xù)灌流至240 min。取前3管收集液測(cè)定目標(biāo)檢測(cè)物，計(jì)算均值作為基礎(chǔ)水平(0 min)，透析液收集方案見圖1。

圖1　透析液收集方案Fig.1　Dialysate collection protocol

1.2.5紋狀體透析液中Glu、GABA含量測(cè)定

衍生液配制：將5 mg OPA溶于120 μL甲醇中，加入10 μL β-巰基乙醇和1 mL 0.2 mol·L-1硼酸緩沖液(pH 9.2)，混勻，放于暗處。流動(dòng)相：A液為緩沖液：甲醇：四氫呋喃(V∶V∶V=400∶95∶5)；B液為緩沖液：甲醇(V∶V)=120∶380(緩沖液為20 mmol·L-1乙酸鈉溶液，pH 7.2)。流速：0.8 mL/min；PMT：12；柱溫：40 ℃。梯度洗脫：0～10 min為0%～63%，B液；10～12 min為63%B液；12～17 min為100%B液；17～18 min為100%～0%B液；18～21 min為0%B液。OPA柱前自動(dòng)衍生，激發(fā)波長(zhǎng)：340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：455 nm。

1.3數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

2結(jié)果

2.1SWF對(duì)LID大鼠行為學(xué)的影響

個(gè)別大鼠首次給藥后即出現(xiàn)輕微異動(dòng)癥癥狀，隨給藥時(shí)間增加，各組大鼠均逐漸表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的異動(dòng)癥癥狀，表現(xiàn)為吐舌、首尾相接狀像健側(cè)發(fā)生旋轉(zhuǎn)、健側(cè)前肢呈拍打樣動(dòng)作、頸部向健側(cè)扭轉(zhuǎn)，身體失去平衡、跌倒等(見圖2)。給藥至第21天，與假手術(shù)組相比，各給藥組AIM評(píng)分均明顯升高，其中L-DOPA組AIM評(píng)分差異顯著(P< 0.01)；與L-DOPA組相比，L-DOPA+SWF高劑量組AIM評(píng)分較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。數(shù)據(jù)見表1。

注： A：軀干肌肉張力障礙，左前肢拍打樣動(dòng)作；B：向健側(cè)發(fā)生旋轉(zhuǎn)；C：重復(fù)性咀嚼樣動(dòng)作，伴有偶爾吐舌；D：軸性張力障礙,軀干向健側(cè)扭轉(zhuǎn)。圖2　LID大鼠行為學(xué)癥狀Note: A：Muscular dystonia with repetitive movements of the left forelimb；B：Contraversive rotation, contralateral to the dopamine-denervated striatum；C：Repetitive chew-like movements associated with protrusion of the tongue；D：Axial dystonia manifested as contraversive rotation, contralateral to the dopamine-denervated striatum.Fig.2　Behaviors of LID model rats

分組Group異常不自主運(yùn)動(dòng)評(píng)分AIMscore第1天1days第7天7days第14天14days第21天21days假手術(shù)Sham0.0±0.00.0±0.0*0.0±0.0*0.0±0.0*左旋多巴L-DOPA2±327±17#30±15##36±16##左旋多巴+首烏方(低劑量)L-DOPA+SWF(L)2±212±9 17±19 20±20 左旋多巴+首烏方(高劑量)L-DOPA+SWF(H)1±28±125±5*9±9*

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05,**##P<0.01；與L-DOPA組比較，*P<0.05,**P<0.01。

Note： v.s. Sham,#P<0.05,**##P<0.01; v.s. LID,*P<0.05,**P<0.01.

注：與假手術(shù)組比較，# P<0.05, ## P<0.01；與L-DOPA組比較，*P<0.05, **P<0.01。圖4　首烏方對(duì)異動(dòng)癥模型大鼠紋狀體Glu水平的影響 ±s, n=6)Note: v.s. Sham, # P<0.05, **## P<0.01; v.s. LID, *P<0.05, **P<0.01.Fig.

注：與假手術(shù)組比較，# P<0.05, ##P<0.01。與L-DOPA組比較，*P<0.05, **P<0.01。圖5　首烏方對(duì)異動(dòng)癥模型大鼠紋狀體GABA水平的影響 ±s, n=6)Note: v.s. Sham, # P<0.05, ##P<0.01, v.s. LID, *P<0.05, **P<0.01.Fig.

0 min，與假手術(shù)組相比，給藥組大鼠紋狀體內(nèi)Glu含量增加，其中L-DOPA組顯著升高(P<0.05)；與L-DOPA組相比，L-DOPA+SWF組大鼠紋狀體內(nèi)Glu水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。末次給藥后60 min，L-DOPA組Glu水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；與L-DOPA組相比，L-DOPA+首烏方各劑量組Glu水平均降低(P<0.05)。60 min后，各組間Glu水平雖未見顯著差異，但透析0～240 min內(nèi)，L-DOPA組Glu水平始終高于其他各組，數(shù)據(jù)見圖4。

與假手術(shù)組相比，給藥組大鼠紋狀體內(nèi)GABA含量增加，L-DOPA組顯著升高(P<0.05)；與L-DOPA組相比，L-DOPA+SWF各劑量組大鼠紋狀體內(nèi)GABA水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。末次給藥后60 min，與假手術(shù)組相比，L-DOPA組GABA水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；與L-DOPA組相比，L-DOPA+首烏方各劑量組GABA水平均降低(P<0.01)。60 min后，L-DOPA組GABA水平始終高于給藥組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)見圖5。

3討論

左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥(levodopa-induced dyskinesis，LID)發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，紋狀體多巴胺(DA)耗竭被公認(rèn)為是LID發(fā)生的重要病理學(xué)因素[13]，然而一些嚴(yán)重PD模型動(dòng)物始終未出現(xiàn)LID[14-15]，這表明，LID的發(fā)生、發(fā)展還涉及到其他一些重要因素。近年來(lái)，非多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)在LID發(fā)生中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，如氨基酸類、神經(jīng)肽類、膽堿類等。其中，Glu和GABA作為體內(nèi)重要的興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[16]，均與PD、LID的發(fā)生有著密切關(guān)系。有學(xué)者[17]提出，LID發(fā)生是由于紋狀體多巴胺D1受體和D2受體分別介導(dǎo)的直接通路和間接通路活動(dòng)失衡，最終導(dǎo)致基底節(jié)-丘腦-皮質(zhì)環(huán)路活動(dòng)異常。直接通路的活化引起大腦皮層釋放傳遞至紋狀體區(qū)的Glu增加，而GABA釋放的增加同樣可以反映直接通路的過度激活在LID發(fā)生中的作用[18]。因此，以上研究結(jié)果提示Glu、GABA參與LID過程，但目前研究成果尚不能完全揭示Glu、GABA等氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)參與LID發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

對(duì)于LID的治療，目前主要包括應(yīng)用長(zhǎng)效DA制劑、氨基酸受體拮抗劑、神經(jīng)保護(hù)劑、立體定向蒼白球損毀術(shù)等，但效果并不令人滿意。值得肯定的是，中醫(yī)中藥對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的治療體現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首烏方是根據(jù)古方記載、參考現(xiàn)代研究、結(jié)合課題組人員的臨床經(jīng)驗(yàn)優(yōu)選出的中藥復(fù)方，由首烏、鹿茸、天麻、鉤藤、等中藥組成。現(xiàn)代藥理研究表明，方中藥物的提取物及相關(guān)制劑對(duì)神經(jīng)元損傷模型動(dòng)物具有神經(jīng)保護(hù)作用[19-21]，這為首烏方治療神經(jīng)退行性疾病提供了藥理學(xué)基礎(chǔ)。臨床上，首烏方與L-DOPA配伍應(yīng)用，可以減少L-DOPA用量，提高治療組的總有效率[22]。課題組前期研究中采用清醒自由活動(dòng)大鼠血-腦雙位點(diǎn)微透析采樣的方法，同步觀察首烏方對(duì)L-DOPA在帕金森病(PD)大鼠血液和紋狀體細(xì)胞外液藥動(dòng)學(xué)的影響。結(jié)果表明，首烏方能夠減慢L-DOPA消除，增加血液L-DOPA的吸收，減少紋狀體L-DOPA藥物濃度波動(dòng)[23]。而臨床上認(rèn)為L(zhǎng)-DOPA小劑量、多次給藥，減少L-DOPA血藥濃度的波動(dòng)，可能延緩LID的發(fā)生[24]。以上均提示首烏方可能對(duì)LID具有干預(yù)作用。

研究表明，對(duì)于6-OHDA損傷的大鼠慢性注射L-DOPA后，紋狀體細(xì)胞變化與PD病人長(zhǎng)程注射L-DOPA所展示的運(yùn)動(dòng)障礙相似[25]，給6-OHDA損傷的大鼠長(zhǎng)期注射L-DOPA，可復(fù)制出用為研究L-DOPA誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)障礙神經(jīng)機(jī)制的動(dòng)物模型[26]。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果較為穩(wěn)定，可用于進(jìn)行疾病相關(guān)的機(jī)制研究，評(píng)價(jià)藥物對(duì)疾病的干預(yù)作用和藥物機(jī)制研究等，是目前研究LID采用的常用動(dòng)物模型之一。本研究中首先建立6-OHDA立體定向損毀PD大鼠模型，模型動(dòng)物采用高劑量L-DOPA灌胃3周，誘發(fā)PD大鼠產(chǎn)生LID。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，高劑量L-DOPA誘發(fā)PD大鼠產(chǎn)生LID的幾率增加，同時(shí)也能夠較早地誘發(fā)嚴(yán)重LID[27]。本研究中，PD模型大鼠給服L-DOPA后1～3周時(shí)間即出現(xiàn)LID，隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)，動(dòng)物AIM癥狀逐漸加重，這與文獻(xiàn)報(bào)道[28]結(jié)果基本一致。在行為學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，本研究動(dòng)態(tài)觀察了LID大鼠紋狀體內(nèi)Glu和GABA含量的變化，結(jié)果與課題組前期研究結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道一致[29-30]。這可能與PD/LID狀態(tài)下，皮質(zhì)-紋狀體谷氨酸投射系統(tǒng)活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)。LID模型大鼠基底節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT1水平上升，Glu受體表達(dá)異常，Glu水平病理性升高[31-34]，GABAA受體表達(dá)增加[35-36]，GABA能神經(jīng)元活性普遍提高[37]。同時(shí)，由于Glu經(jīng)谷氨酸脫羧酶 67(GAD67)激活催化，生成GABA。與非LID狀態(tài)的6-OHDA損傷大鼠模型相比，出現(xiàn)LID大鼠腦內(nèi)紋狀體、蒼白球內(nèi)GAD67活性增加，這可能也是LID大鼠紋狀體內(nèi)GABA含量顯著增加的原因。經(jīng)配伍首烏方，病理狀態(tài)下異常升高的Glu和GABA水平下降，與假手術(shù)組水平趨于接近。

綜上所述，首烏方配伍L(zhǎng)-DOPA能夠減輕LID模型大鼠的行為學(xué)異常癥狀，提示臨床應(yīng)用首烏方或能夠達(dá)到對(duì)多巴胺替代療法“增效減毒”的作用，其作用機(jī)制可能與其對(duì)紋狀體內(nèi)Glu、GABA水平的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，本研究結(jié)果為進(jìn)一步展開中藥干預(yù)LID早期發(fā)病和減輕LID癥狀提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Ahlskog JE, Muenter MD. Frequency of levodopa-related dyskinesias and motor fluctuations as estimated from the cumulative literature [J]. Mov Disord, 2001, 16 (3): 448-458.

[2]Zesiewicz TA, Sallivan KL, and Hauser RA. Levodopa induced dyskinesia in Parkinson′s disease: epidemiology, etiology, and treatment[J]. Curr Neurol Neurosci Rep, 2007, 7 (4): 302-310.

[3]Tse W. Optimizing pharmacotherapy: strategies to manage the wearing-off phenomenon [J]. J Am Med Dir Assoc, 2006, 7 (Suppl 2): 12-17.

[4]van Laar T. Levodopa-induced response fluctuations in patients with Parkinson' s disease: strategies for management [J]. CNS Drugs, 2003, 17 (7): 475-489.

[5]李永梅, 李霞, 周兆麗. 何首烏提取物對(duì)百草枯引起的小鼠多巴胺神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用 [J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2007, 23 (5): 395-396.

[6]王丹巧, 王巍, 趙德忠. 建立腦內(nèi)灌流6-OHDA所致大鼠紋狀體細(xì)胞外液羥自由基升高的模型 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22 (6): 765-768.

[7]劉洋, 焦玥, 孫丹丹, 等. 首烏方對(duì)美多芭誘發(fā)異動(dòng)癥模型大鼠行為學(xué)及腦內(nèi)糖代謝的影響 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2015, 30 (1): 73-77.

[8]焦玥, 劉洋, 孫丹丹, 等. 首烏方對(duì)左旋多巴致異動(dòng)癥大鼠的干預(yù)作用及其機(jī)制 [J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2015, 35 (02): 1-4, 9.

[9]管強(qiáng), 曹學(xué)兵, 孫圣剛, 等. 左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥大鼠紋狀體神經(jīng)元電生理活動(dòng)的變化 [J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 5 (9): 875-879.

[10]Justin D Oh, Christina L Vaughan, Thomas N Chase. Effect of dopamine denervation and dopamine agonist administration on serine phosphorylation of striatal nmda receptor subunits [J]. Brain Res, 1999, 821 (2): 433-442.

[11]Lee CS, Cenci MA, Schulzer M,etal. Embryonic ventral mesencephalic grafts improve levodopa- induced dyskinesia in a rat model of Parkinson disease [J]. Brain, 2000, 123 (Pt 7): 1365-1379.

[12]徐巖, 孫圣剛, 曹學(xué)兵. 左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥大鼠模型的制作及其行為學(xué)評(píng)估 [J]. 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志, 2005, 27 (11): 649-652.

[13]Boyce S, Rupniak NM, Steventon MJ,etal. Nigrostriatal damage is required for induction of dyskinesias by L-DOPA in squirrel monkeys [J]. Clin Neuropharmacol, 1990, 13 (5): 448-58.

[14]Guigoni C, Dovero S, Aubert I, Li Q,etal. Levodopa-induced dyskinesia in MPTP-treated macaques is not dependent on the extent and pattern of nigrostrial lesioning [J]. Eur J Neurosci, 2005, 22 (1): 283-287.

[15]Cenci MA, Lee CS, and Bj?rklund A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase rnRNA [J]. Eur J Neurosci, 1998, 10 (8): 2694-2706.

[16]Watanabe M, Maemura K, Kanbara K,etal. GABA and GABA receptors in the central nervous system and other organs [J]. Int Rev Cytol, 2002, 213: 1-47.

[17]Obeso JA, Rodriguez-Oroz MC, Rodriguez M,etal. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson’s disease: problems with the current model [J]. Ann Neurol, 2000, 47 (4 Suppl 1): S22-32.

[18]Flora Mela, Matteo Marti, Simone Bido,etal. In vivo evidence for a differential contribution of striatal and nigral D1 and D2 receptors to l-DOPA induced dyskinesia and the accompanying surge of nigral amino acid levels [J]. Neurobiol Dis, 2012, 45 (1): 573-582.

[19]李永梅, 李霞, 周兆麗. 何首烏提取物對(duì)百草枯引起的小鼠多巴胺神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用 [J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2007, 23 (5): 395-396.

[20]周琳, 袁夢(mèng)石, 夏健, 等. 何首烏制劑在Aβ致海馬神經(jīng)元凋亡中的Bax表達(dá) [J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志, 2006, 23 (2): 143-145.

[21]楊建宇, 楊揚(yáng), 張小超, 等. 天麻醒腦膠囊對(duì)血管性癡呆動(dòng)物認(rèn)知功能障礙的影響 [J]. 中藥藥理與臨床, 2009, 25 (1): 56-59.

[22]崔玲, 于向東, 崔軍. 自擬補(bǔ)腎平顫方配合美多巴片治療帕金森病的臨床療效觀察 [J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2003, 23 (7): 504-507.

[23]孫曉芳, 王丹巧, 吳兆恩, 等. 首烏方對(duì)帕金森病模型大鼠血液和紋狀體細(xì)胞外液左旋多巴藥代動(dòng)力學(xué)影響的研究 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17 (11): 111-115.

[24]Rodriguez-Oroz MC, Marin C, de Fabregues O. Continuous dopaminegic stimulation: clinical aspects and experimental bases [J]. Neurologist, 2011, 17 (6 Suppl): 30-37.

[25]范凱, 馬堅(jiān)妹, 馬曉凱. 6-羥多巴胺腦內(nèi)注射制備帕金森病大鼠模型的研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2005, 13 (1): 20-22.[26]Henry B, Crossman AR, Brot chie JM,etal. Characterization of enhanced behavioral responses to L-DOPA following repeated administration in the 6-hydroxydopamine- lesioned rat model of Parkinson’s disease [J]. Exp Neurol, 1998, 151 (2): 334- 342.[27]Lindgren HS, Rylander D, Ohlin KE,etal. The “motor complication syndrome” in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with L-DOPA: relation to dose and route of administration [J]. Behav Brain Res, 2007, 177 (1): 150-159.[28]徐巖, 孫圣剛, 曹學(xué)兵. 左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥大鼠模型的制作及其行為學(xué)評(píng)估 [J]. 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志, 2005, 27 (11): 649-652.

[29]吳兆恩, 王丹巧, 李鵬, 等. 帕金森病6-OHDA模型大鼠左旋多巴血藥濃度與紋狀體細(xì)胞外液氨基酸類遞質(zhì)結(jié)合研究的方法 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2010, 26 (10): 1395-1399.

[30]浦政, 戚辰, 干靜, 等. 左旋多巴給藥頻度與異動(dòng)癥大鼠紋狀體神經(jīng)遞質(zhì) [J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 23 (11): 31-35. [31]Mela F, Marti M, Bido S,etal. In vivo evidence for a differential contribution of striatal and nigral D1 and D2 receptors to L-DOPA induced dyskinesia and the accompanying surge of nigral amino acid levels [J]. Neurobiol Dis 2012; 45 (1): 573-582.[32]Jonkers N, Sarre S, Ebinger G,etal. MK801 suppresses the L-DOPA- induced increase of glutamate in striatum of hemi-Parkinson rats [J]. Brain Res, 2002, 926 (1-2): 149-155.

[33]Robelet S, Melon C, Guillet B,etal. Chronic LDOPA treatment increases extracellular glutamate levels and GLT1 expression in the basal ganglia in a rat model of Parkinson’s disease [J]. Eur J Neurosci, 2004, 20 (5): 1255-1266.

[34]Dupre KB, Ostock CY, Eskow Jaunarajs KL,etal. Local modulation of striatal glutamate efflux by serotonin 1A receptor stimulation in dyskinetic, hemiparkinsonian rats [J]. Exp Neurol, 2011, 229 (2): 288-299.

[35]Calon F, Goulet M, Blanchet PJ,etal. Levodopa or D2 agonist induced dyskinesia in MPTP monkeys: correlation with changes in dopamine and GABAA receptors in the striatopallidal complex [J]. Brain Res, 1995, 680 (1-2): 43-52.

[36]Calon F, Morissette M, Rajput AH,etal. Changes of GABA receptors and dopamine turnover in the postmortem brains of parkinsonians with levodopa-induced motor complications [J]. Mov Disord, 2003, 18 (3): 241-253.

[37]Levy R, Herrero MT, Ruberg M,etal. Effects of nigrostriatal denervation and L-dope therapy on the GABAergic neurons in the striatum in MPTP - treated monkeys and Parkinson' s disease: an in situ hybridization study of GAD67 mRNA [J]. Eur j Neurosci, 1995, 7 (6): 1199-1209.

〔修回日期〕2015-10-21

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274121)；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)自主選題項(xiàng)目(ZZ2012010)。

[作者簡(jiǎn)介]劉洋(1984-)，女，助理研究員，研究方向：中藥防治神經(jīng)退行性疾病研究。Email: echoinapril@163.com。 [通訊作者]王丹巧(1959-)，女，研究員，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治老年病相關(guān)研究。Email: dq_wang96@sohu.com。

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 01-0007-07

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.002

Effect of shou wu fang on amino acids neurotransmitters in levodopa-induced dyskinesia model rats

LIU Yang, JIAO Yue, SUN Dan-dan, WANG Dan-qiao, ZHAO Xiao-liang, LI Tao, ZHANG Mei-yu

(Beijing Key Laboratory of TCM Basic Research on Prevention and Treatment of Major Disease, Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

【Abstract】Objective To investigate the effect of SWF on the behaviors and striatal levels of amino acids neurotransmitters of LID model rats,and to explore the effect of SWF on the mechanism of dyskinesias. Methods SD rats were injected with 6-hydroxydopamine (6-OHDA) to produce hemi-lateral nitro-striatum lesion. 6-OHDA lesioned rats were daily given L-DOPA, or L-DOPA plus SWF at different doses. Sham group was also established. All rats were treated for 22 days, once per day. During the treatment, abnormal involuntary movements (AIMs) were evaluated. On 22nd day, in vivo microdialysis was used to collect striatal extracellular fluid as the rats were in sober and free-moving condition. All dialysates were analyzed by high performance liquid-fluorescence (HPLC-FLD) detection. ResultsAfter treatment of L-DOPA, 6-OHDA lesioned rats developed AIM. AIM scores of L-DOPA-treated rats were higher than the sham-operated rats (P<0.01). L-DOPA plus high dose of SWF-treated rats had lower AIM scores than L-DOPA-treated rats (P<0.05). On 22nd day, in L-DOPA-treated rats, striatal levels of glutamate and GABA increased (P<0.05) than sham group. 60 min after last treatment, levels of glutamate and GABA in L-DOPA-plus SWF-treated rats were significantly lower than the sham-operated and L-DOPA plus SWF-treated rats (P<0.05, P<0.01). ConclusionsThe findings in this study suggested that as SWF was combined, side effects of L-DOPA mitigated as AIMs scale rating were reduced in LID rats. SWF protected 6-OHDA lesioned rats from LID by regulating abnormal striatal concentrations of glutamate and GABA.

【Key words】Parkinson’s disease (PD)； Levodopa-induced dyskinesia (LID)；Shou wu fang (SWF)；Microdialysis；Glutamate；GABA