慢性乙型肝炎前C區(qū)G1896A基因變異對(duì)HBV復(fù)制及疾病嚴(yán)重程度的影響

瞿衛(wèi)東　胡晨波　方敏　朱君效

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慢性乙型肝炎前C區(qū)G1896A基因變異對(duì)HBV復(fù)制及疾病嚴(yán)重程度的影響

瞿衛(wèi)東胡晨波方敏朱君效

201399 上海市浦東新區(qū)南華醫(yī)院肝病科(胡晨波)；浦東新區(qū)書(shū)院社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(瞿衛(wèi)東、方敏)；浦東新區(qū)航頭社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(朱君效)

【摘要】目的研究乙型肝炎病毒(HBV)前C區(qū)G1896A變異對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制及疾病嚴(yán)重程度的影響。方法選取43例慢性乙型肝炎及49例乙型肝炎肝硬化患者為研究對(duì)象。采用PCR技術(shù)檢測(cè)HBV前C區(qū)G1896A位點(diǎn)變異及乙型肝炎基因分型。同時(shí)檢測(cè)HBeAg、HBV DNA定量、肝功能血清生化指標(biāo)。結(jié)果(1)發(fā)生HBV前C區(qū)G1896A變異患者的年齡大于野生株感染者(P<0.01)，發(fā)生肝硬化的可能性更大(P<0.01)。(2)隨著變異株感染率的增加，HBeAg陰性率較野生株組增加(P<0.01)，基因C型較野生株組增加(P<0.05)，HBV DNA水平降低差異意義(P>0.05)。結(jié)論HBV前C區(qū)G1896A變異與HBeAg的狀態(tài)，HBV DNA的復(fù)制及疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】前C區(qū)G1896A；基因變異；乙型肝炎病毒；復(fù)制

HBV感染是全球病毒性肝炎的主要原因之一。HBV是部分雙鏈DNA，全長(zhǎng)3.2 kb。HBV含4個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀碼框(ORF)，即前-S/S區(qū)、前-C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。前-S/S區(qū)編碼大(前-S1、前-S2及S)、中(前-S2及S)、小(S)3種包膜蛋白，前-C/C區(qū)編碼HBeAg及HBcAg，P區(qū)編碼聚合酶，X區(qū)編碼X蛋白。前C(Precore，PC)區(qū)G1896A位點(diǎn)變異和基本核心啟動(dòng)子(BCP)區(qū)A1762T/G1764A變異是HBeAg陰性的慢性乙型肝炎相關(guān)的兩種HBV變異的主要類(lèi)型。G1896A變異可使HBV PC區(qū)第28位密碼子由色氨酸變?yōu)榻K止密碼子，從而阻斷了HBeAg的產(chǎn)生，而HBV復(fù)制和HBcAg表達(dá)并不受此影響[1]。PC區(qū)變異與體內(nèi)病毒間歇性和持續(xù)性復(fù)制相關(guān)[2]。

為此，本研究選取43例慢性乙型肝炎及49例乙型肝炎肝硬化患者進(jìn)行分析，探討HBV PC區(qū)G1896A變異對(duì)慢性乙型肝炎病毒復(fù)制及疾病嚴(yán)重程度的影響。

資料和方法

一、研究對(duì)象

2013年1月至2015年6月上海市浦東新區(qū)南華醫(yī)院肝病科住院的HBsAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者92例，男81例，女11例。慢性乙型肝炎及肝硬化的診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；且所有患者血清HBV DNA>103拷貝/mL。所有患者同時(shí)排除其他病毒感染及重疊其他病毒引起的肝炎，藥物性、酒精性、自身免疫性和代謝性肝病，伴有其他器官損害。清晨空腹抽血，分離血清，-40℃保存?zhèn)溆?，統(tǒng)一進(jìn)行檢測(cè)。

二、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

抽血前1 d禁食8 h后，次日晨空腹抽血。采用日本東芝120全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)肝功能生化指標(biāo)。PCR法檢測(cè)血清HBV DNA，采用美國(guó)Bio Rad公司的CF-X96型熒光定量PCR儀及中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的HBV DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)范圍為102～108拷貝/mL。 HBV PC G1896A變異檢測(cè)采用PCR加膜雜交法檢測(cè)，S1000基因擴(kuò)增儀，深圳亞能生物試劑。以上檢測(cè)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、一般情況

納入的92例患者(43例慢性乙型肝炎及49例乙型肝炎肝硬化)中男81例，女11例，平均年齡(31.27±11.9)歲；ALT (199.40±26.32) U/L；Alb(34.40±0.68) g/L；HA (35.92±40.36) ng/L。

HBV PC區(qū)G1896A變異野生株和部分變異株、完全變異株性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。部分及完全變異株與野生株年齡比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。部分及完全變異株與野生株ALT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。部分及完全變異株與野生株Alb比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。部分及完全變異株與野生株HA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

二、HBV PC區(qū)G1896A變異野生株、部分變異株、完全變異株與HBeAg、HBV DNA、基因型的關(guān)系。

野生株和部分變異株、完全變異株HBeAg陽(yáng)性率(90.90%，37.50%，5.26%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。野生株和部分變異株、完全變異株基因C型比較(54.55%、84.38%、84.21%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。野生株和部分變異株、完全變異株HBV DNA≥6 lg拷貝/mL(68.18%、78.13%、60.53%)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　HBV PC區(qū)G1896A變異與HBeAg、

三、HBV PC區(qū)G1896A變異野生株、部分變異株、完全變異株與肝臟疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系

野生株和部分變異株、完全變異株慢性肝炎率(72.73%，46.88%，31.58%)、肝硬化率(27.27%、53.13%、68.42%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。見(jiàn)表3。

表3　HBV PC區(qū)G1896A變異野生株、部分變異株、完全變異株疾病程度比較[例(%)]

討論

HBV DNA復(fù)制通過(guò)核糖核酸(RNA)中間體逆轉(zhuǎn)錄，由于其逆轉(zhuǎn)錄缺乏校對(duì)功能，因此HBV DNA復(fù)制出現(xiàn)錯(cuò)誤的頻率較其他DNA病毒高得多。HBV發(fā)生自然變異最常見(jiàn)的是PC區(qū)，其高頻率地發(fā)生及穩(wěn)定的表型提示這些變異可能會(huì)提高HBV復(fù)制或逃避宿主免疫反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)G1896A變異是PC區(qū)最常見(jiàn)，也是最重要的變異。

HBV感染的自然史一般可人為劃分為4個(gè)期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動(dòng)或低(非)復(fù)制期及再活動(dòng)期。在HBV感染的中后期，患者針對(duì)HBV感染的免疫一定程度上增強(qiáng)，伴隨著HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，HBV PC和BCP變異株替代野生株成為優(yōu)勢(shì)株[4]。Yan等[5]報(bào)道PC或BCP變異在HBeAg陽(yáng)性患者中為(125/192)65.1%，提示在HBV感染的不同階段，PC/BCP變異的程度不同。本研究顯示，隨著患者年齡增加，PC變異的程度逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

HBV PC區(qū)G1896A變異還可以對(duì)宿主的免疫產(chǎn)生影響。Moradzadeh M等[6]研究顯示，HBV PC區(qū)G1896A發(fā)生突變的患者的Toll樣受體2(TLR2)水平較野生株患者增高，由于TLR2是介導(dǎo)炎癥的重要因子，所以PC區(qū)G1896A發(fā)生突變的慢性乙型肝炎患者的ALT水平較野生株高。本研究顯示，HBV PC區(qū)G1896A變異野生株ALT高于部分變異株、完全變異株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，分析原因肝硬化患者在部分(53.13%)及完全(68.42%)變異株組比野生株組(27.27%)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而肝硬化患者由于存在功能的肝細(xì)胞明顯降低，故ALT升高不明顯。另外，部分及完全變異株組與野生株組Alb比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；部分及完全變異株組與野生株組HA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這均提示隨著HBV PC區(qū)G1896A變異的增加，患者肝臟疾病嚴(yán)重程度逐漸加重，發(fā)生肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加。近期有文獻(xiàn)同樣認(rèn)為，結(jié)合log10PC、log10BCP、PC% 和BCP%的動(dòng)態(tài)變化可以評(píng)估肝臟疾病的進(jìn)展程度[7]。另外，Tong MJ等[8]研究表明，HBV PC、BCP變異可以顯著增加慢性乙型肝炎患者原發(fā)性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。

表1　HBV PC區(qū)G1896A變異不同程度患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)比較(±s)

注：*P<0.05；**P<0.01

目前關(guān)于HBV DNA和疾病進(jìn)展的最大數(shù)據(jù)來(lái)自于REVEAL研究，這是一項(xiàng)評(píng)估慢性乙型肝炎自然史的大樣本、前瞻性隊(duì)列研究。該研究表明血清HBV DNA水平是慢性乙型肝炎發(fā)生肝硬化或肝癌的重要、獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。PC區(qū)終止密碼子變異G1896A導(dǎo)致前C蛋白表達(dá)障礙，減弱前C蛋白對(duì)HBV病毒復(fù)制的抑制，從而加強(qiáng)了pgRNA衣殼化，導(dǎo)致病毒復(fù)制增加[10]。本研究中部分及完全變異株組HBeAg陽(yáng)性率明顯降低(P<0.05)，但HBV DNA較野生株組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

根據(jù)乙型肝炎病毒基因組測(cè)序，以乙型肝炎病毒基因組至少有8%的差異，將HBV分為10個(gè)基因型(A～J)[11]。我國(guó)以B、C型為主。HBV 基因C型比基因B型與嚴(yán)重肝病、肝硬化和原發(fā)性肝癌更相關(guān)，而基因D型發(fā)生相關(guān)的嚴(yán)重肝病或原發(fā)性肝癌比基因A型更相關(guān)[12]。這可能是因?yàn)镻C區(qū)G1896A變異在HBV基因D型變異頻率最高，在基因B，C和E型較高，但在基因A，F(xiàn)和H型幾乎不發(fā)生[13]。這種特定HBV基因型的限制與需要保持前基因組干-袢結(jié)構(gòu)中的衣殼信號(hào)相關(guān)。本研究表明，PC區(qū)G1896A發(fā)生突變的患者中基因C型較野生株組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

總之，HBV的PC區(qū)基因變異可能具有重要的臨床意義。這些變異株可能會(huì)增加肝硬化、肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，影響HBV DNA復(fù)制的能力，并可能會(huì)導(dǎo)致在HBeAg消失后HBV DNA仍能持久復(fù)制。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ]Choi JW, Ahn SH, Park JY, et al. Hepatitis B e antigen-negative mutations in the precore and core promoter regions in Korean patients. J Med Virol，2009, 81:594-601．

[ 2 ]Biswas A, Banerjee A, Chandra PK, et al. Variations in the functional domain of basal core promoter of hepatitis B virus among Eastern Indian patients with prevalence of genotypes A, C, and D among the same ethnic population. J Med Virol, 2011, 83:253-260.

[ 3 ]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)．中國(guó)病毒病雜志，2011，9-23．

[ 4 ]Tong S, Kim KH, Chante C, et al. Hepatitis B Virus e AntigenVariants. Int J Med Sci, 2005, 2:2-7.

[ 5 ]Yan CH, Zhao CY, Ding H, et al. Hepatitis B virus basal core promoter mutations A1762T/G1764A are associated with genotype C and a low serum HBsAg level in chronically-infected HBeAg-positive Chinese patients. Antiviral Res, 2012, 96:108-114.

[ 6 ]Moradzadeh M, Tayebi S, Poustchi H, et al. The Possible Role of TLR2 in Chronic Hepatitis B Patients with Precore Mutation. Adv Virol, 2013, 2013:780319.

[ 7 ]Tu WH, Lv Y, Zhang YM, et al. Precore/basal core promoter mutants quantification throughout phases of hepatitis B virus infection by Simpleprobe. World J Gastroenterol, 2015, 21: 6639-6648.

[ 8 ]Tong MJ, Blatt LM, Kao JH, et al. Basal core promoter T1762/A1764 and precore A1896 gene mutations in hepatitis B surface antigen-positive hepatocellular carcinoma: a comparison with chronic carriers. Liver Int, 2007, 27:1356-1363.

[ 9 ]Chen CJ, Yang HI, lloeje UH; REVEAL-HBV Study Group. Hepatitis B virus DNA levels and outcomes in chronic hepatitis B. Hepatology, 2009, 49(5 Suppl): S72-84.

[10]Scaglioni PP, Melegari M, Wands JR, et al. Biologic properities of hepatitis B viral genomes with mutations in the precore promoter and precore open reading frame. Virology, 1997, 233:374-381.

[11]Liu CJ, Kao JH. Global perspective on the natural history of chronic hepatitis B: role of hepatitis B virus genotypes A to J. Semin Liver Dis, 2013, 33:97-102.

[12]El-Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 2012, 142:1264-1273.

[13]Kramvis A, Arakawa K, Yu MC, et al. Relationship of serological subtype, basic core promoter and precore mutations to genotypes/subgenotypes of hepatitis B virus. J Med Virol, 2008, 80:27-46.

(本文編輯：賴榮陶)

基金項(xiàng)目：浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)(PWRq2012-05)；浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)全科團(tuán)隊(duì)建設(shè)資助(PWZq2013-03)

通信作者：朱君效，Email： judymama@foxmail.com

(收稿日期：2015-12-03)

·臨床與基礎(chǔ)研究·

共同第一作者：胡晨波