甘露糖結合凝集素水平的調(diào)節(jié)與肺結核易感性關系的研究*

劉　洋,郭艷玲,姜廣路,孫　琦,鄭素華,張宗德△

(北京市結核病胸部腫瘤研究所/首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院：1.流行病學研究室；2.檢驗科；3.參比室；4.分子生物學實驗室　101149)

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·論著·

甘露糖結合凝集素水平的調(diào)節(jié)與肺結核易感性關系的研究*

劉洋1,郭艷玲2#,姜廣路3,孫琦4,鄭素華1,張宗德4△

(北京市結核病胸部腫瘤研究所/首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院：1.流行病學研究室；2.檢驗科；3.參比室；4.分子生物學實驗室101149)

摘要:目的研究甘露糖結合凝集素(MBL)水平的調(diào)節(jié)與肺結核易感性的關系。方法對142例肺結核患者和120例健康對照者血清中MBL水平進行測定。同時采用限制性片段長度多態(tài)性分析方法對MBL2基因多態(tài)性進行測定。結果采用單因素方差分析不同基因型組的MBL水平，YA/YA組，XA/YA組和XA/XA、YA/YB、 XA/YB、YB/YB組，發(fā)現(xiàn)3組之間和任何兩組之間的MBL 水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。肺結核患者MBL水平顯著高于健康對照(P<0.01)。健康對照者中攜帶YA/YA基因的個體中有93.2%(55/59)的MBL水平大于1 000 ng/mL。而攜帶XA/XA或B等位基因的個體100%(26/26) 的MBL水平小于或等于1 000 ng/mL。結論MBL水平可能與肺結核易感性有關，而決定高水平MBL的YA/YA 基因可能是一種保護性基因。

關鍵詞:甘露糖結合凝集素;多態(tài)性；結核；易感性

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種感染性疾病，每年大約有兩百萬人因感染結核而死亡。由于多耐藥及超級耐藥菌的出現(xiàn)導致結核病疫情不斷加劇[1]。在結核病發(fā)生過程中，結核分枝桿菌與環(huán)境、宿主間復雜的相互作用可能起到關鍵的影響。而某種程度上宿主因素可能決定結核易感性[2]。甘露糖結合凝集素(MBL) 是一種Ca2+依賴型凝集素家族中的急性期蛋白，為天然免疫系統(tǒng)中一個關鍵因子。它能通過碳水化合物識別區(qū)識別病原微生物[3-4]。MBL 由MBL2編碼，后者位于第10號染色體上，有7個MBL2 單核苷酸多態(tài)性(SNPs) 可能與MBL水平或功能相關 。在外顯子1區(qū)有3個單核苷酸改變將野生型變?yōu)橥蛔冃?A/B，A/C和A/D)，這些改變打破膠原結構從而形成功能性寡聚物。此外位于啟動子和5′-非翻譯區(qū)的其他等位基因如H/L、X/Y、P/Q,也可被SNPs鑒定，其中等位基因X表現(xiàn)出更低的轉錄活性[5]。

MBL 基因多態(tài)性與結核易感性的關系有過相關報道，但MBL 基因多態(tài)性與MBL水平關系以及MBL水平與結核關系報道較少。一些研究者發(fā)現(xiàn)低水平的血清MBL能抑制結核菌感染[6-7]，而另一些研究則有相反的觀點[8-9]。本文通過MBL2基因多態(tài)性與MBL水平關系及肺結核患者與健康對照者MBL水平比較，探討MBL水平與肺結核易感性關系。

1資料與方法

1.1一般資料選取2010年1月至2012年6月首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院收治入院的肺結核患者142例，患者診斷標準參照中華醫(yī)學會結核病臨床診療指南，除腫瘤、肺炎、糖尿病等疾病。另選取本院同期健康體檢者120例作為健康對照，排除既往有肺結核病史者。本研究經(jīng)北京市胸科醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入研究者均簽署知情同意書。

1.2標本收集與DNA提取抽取患者和健康對照者靜脈血4 mL，3 000×g離心分離血清。同時抽取患者和健康對照者靜脈血2 mL經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用血液DNA抽提試劑盒(MBI公司，美國)進行DNA提取。具體操作按照說明書進行。將提取的DNA儲存在-20 ℃凍存。

1.3MBL2-221X/Y and 外顯子154A/B基因分型對-221位點和外顯子區(qū)54號位點限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)進行基因分型。引物序列為(1)5′-ACC TGG GTT TCC ACT CAT TCT CAT-3′，(2)5′-CCC CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG-3′,擴增產(chǎn)物為623 bp。反應體系為50 μL，PCR反應條件為：95 ℃ 4 min；之后95 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)柱式純化試劑盒(MBI公司,美國)純化后分別采用BtgⅠ(NEB公司,美國)和BshNⅠ(MBI公司,美國)進行酶切消化，酶切體系為20 μL，37 ℃過夜消化。BtgⅠ針對X/Y基因型(Y 等位基因為540 bp)，BshNⅠ(A等位基因為536 bp)。擴增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。根據(jù)PCR產(chǎn)物條帶數(shù)及位置確定基因型。

1.4血清MBL水平測定采用人MBL ELISA Kit (R&D,美國)對142例肺結核患者和120例健康對照者的血清MBL水平進行測定。具體操作按照說明書進行。同時對MBL2基因多態(tài)性與MBL水平關系及肺結核患者和健康對照者之間血清MBL水平進行分析比較。

1.5驗證MBL2基因多態(tài)性和MBL水平的關系將MBL2二倍體型分為3組，分別為YA/YA組，XA/YA組和XA/XA、YA/YB、XA/YB、YB/YB組，比較組間MBL水平差異。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析，對不同MBL2基因型與MBL水平之間差異進行比較。采用t檢驗對肺結核患者與健康對照者的MBL水平進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1肺結核患者和健康對照者的MBL水平比較肺結核患者MBL水平為(2 291.6±1 575.9)ng/mL，健康對照者為(1 721.1±1 423.3)ng/mL，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，肺結核患者血清中MBL水平更高。肺結核患者MBL基因 YA/YA二倍體型有49例，頻率為34.5%，健康對照者YA/YA二倍體型為59例，頻率為49.2%，二者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016) ，而MBL2基因XA/XA二倍體型則在肺結核患者中相對更多有15例(10.6%)，健康對照者為2例(1.7%)，二者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。見表1。

表1　不同二倍體型在肺結核患者與健康對照者之間的比較[n(%)]

2.2MBL2基因多態(tài)性和MBL水平的關系YA/YA組，XA/YA組和XA/XA、YA/YB、XA/YB、YB/YB組之間MBL 水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，此外任何兩組之間也差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表2。在健康對照者中攜帶YA/YA基因的個體中有93.2% (55/59) 的MBL水平大于1 000 ng/mL。而攜帶XA/XA或B等位基因的個體100% (26/26) 的MBL水平小于或等于1 000 ng/mL。

表2　不同二倍體型在肺結核患者和健康對照者中的MBL水平

3討論

由于MBL基因啟動子區(qū)與外顯子各位點存在連鎖不平衡。到目前為止，僅證實了LYPA、LYPB、HYPA、HYPD、LXPA、LYQA、LYQC共7種單體型[10]。本研究中，針對MBL2 基因-221Y/X和外顯子l 密碼子54 A/B進行分析發(fā)現(xiàn)，研究人群中僅有YA、XA、YB 3種單倍體型。基因型YA/YA在健康對照者中頻率更高。說明YA/YA或許是一種保護性基因型而XA/XA則有可能是一種結核病易感基因型。這一結果與文獻[10-11]研究結果一致。但有研究認為X、Y等位基因與肺結核發(fā)生無關[12]?？紤]到結核分枝桿菌與人類相互作用的進化史,許多基因突變發(fā)生頻率較高，有研究者指出不同生活環(huán)境選擇壓力可能使MBL基因型發(fā)生突變并對結核感染產(chǎn)生強烈的表型影響[12]。所有這些研究表明結核感染的發(fā)生是一個復雜的過程。

MBL由肝臟分泌，是一種鈣依賴因子，同時具有膠原區(qū)及凝集素域為特征的膠凝集素家族的成員，可與廣泛表達于病原菌的糖類結合(特別是甘露糖和N-乙烯葡萄糖殘基)。MBL在宿主防御病原微生物中起到重要作用。這些病原微生物包括細菌、真菌、寄生蟲和病毒[13-16]。通過與結核分枝桿菌結合，MBL起到調(diào)理素作用,增強吞噬作用，并促進炎性反應以釋放細胞因子。因此，有研究者認為高水平血清MBL可能通過促進對結核分枝桿菌調(diào)理作用導致結核感染概率增加。此外，MBL 可能增強對其他分枝桿菌吞噬活性，并引起MBL缺乏從而對諸如麻風分枝桿菌感染起到保護性防御作用[17]。這與本研究結果一致。同時為證實MBL 基因與與血清MBL水平關系，本研究對肺結核患者和健康對照者中不同基因型的MBL水平進行比較，發(fā)現(xiàn)MBL在不同二倍體型之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，不同組中兩兩比較仍有顯著性差異。雖然還不能定義MBL缺乏的標準，但有研究通過對大樣本(n=1 037)進行分析后將MBL水平≤1 000 ng/mL 作為部分和嚴重的MBL缺乏[18]。本研究結果幾乎與這一研究一致。在健康人群中攜帶YA/YA 基因的個體中有55/59 (93.2%)的MBL水平大于1 000 ng/mL，在XA/XA或B-攜帶個體中達到100%(26/26)。

有研究者對涉及MBL2 基因型和/或MBL 水平與結核病關系的17 個實驗進行meta分析后發(fā)現(xiàn)，血清MBL水平在結核感染時均升高。這或許表明高水平MBL與結核病易感性顯著相關。本研究結果與這些研究一致。近年來，有研究對結核病患者中非吸煙人群進行研究發(fā)現(xiàn)，被動吸煙，烹調(diào)采用固體燃料，以及MBL基因多態(tài)性均與結核易感性有關。說明結核病發(fā)生涉及環(huán)境、遺傳、宿主內(nèi)環(huán)境等多因素，還需要對相關機制進行進一步的探討。

總之,本研究表明高水平MBL或許與結核病易感性顯著相關。啟動子-221 (Y/X) 和外顯子l密碼子54 (A/B) MBL 基因突變與肺結核易感性有關。而YA/YA可能對肺結核病發(fā)生起到保護作用。盡管環(huán)境、遺傳、宿主內(nèi)環(huán)境等多種因素涉及結核病產(chǎn)生，通過結核病MBL水平測定以及MBL基因多態(tài)性與MBL水平相互關系與結核易感性的研究，將有助于了解結核病的發(fā)生機制，為結核病的控制提供思路。

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*基金項目:北京市科技新星基金項目(2008A040);北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)項目(2012D003034000006)。

作者簡介：劉洋，男，副研究員，主要從事結核分子生物學和流行病學研究。 △通訊作者，E-mail:zzd417@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.008

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1767-03

(收稿日期：2016-02-12修回日期：2016-04-24)

Study on relation between regulation of MBL level and pulmonary tuberculosis susceptibility*

LIUYang1,GUOYanling2,JIANGGuanglu3,SUNQi4,ZHENGSuhua1,ZHANGZongde4△

(1.BeijingMunicipalInstituteofTuberculosisandChestTumor/ResearchRoomofEpidemiology;2.DepartmentofClinicalLaboratory;3.ReferenceRoom;4.ExperimentRoomofMolecularBiology,AffiliatedBeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China)

Abstract:ObjectiveTo study the relation between the regulation of mannose-binding lectin (MBL) level and pulmonary tuberculosis(TB) susceptibility.MethodsA total of 142 inpatients with pulmonary TB and 120 healthy controls were recruited to participate in this case-control study.Serum MBL level was detected,meanwhile the restriction fragment length polymorphism(RFLP) was adopted to detect MBL2 gene polymorphism.ResultsThe one-way analysis of variance was adopted to analyze the MBL level in different genotype groups,including the group YA/YA,XA/YA,XA/XA,YA/YB,XA/YB and YB/YB,it was found that the MBL level had statistical differences among 3 groups and between any two groups(P<0.01).The MBL level in the pulmonary TB group was significantly higher than that in the healthy control group(P<0.01).Among the healthy controls,the MBL level in 93.2% individuals(55/59) carrying YA/YA genotype was>1 000 ng/mL,while which in 100% individuals(26/26) carrying genotype XA/XA or allele B was≤1 000 ng/mL.ConclusionThe MBL level may be associated with the susceptibility to pulmonary TB.The YA/YA gene for determining high MBL level may be a protected gene.

Key words:mannose binding lectin;polymorphism;tuberculosis;susceptibility

#共同第一作者：郭艷玲，女，副研究員，主要從事臨床微生物鑒定和分子生物學研究。