人瘦素基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建及其蛋白結(jié)構(gòu)分析

周朋君，馬巖巖2，王一飛2，陳宏遠(yuǎn)

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人瘦素基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建及其蛋白結(jié)構(gòu)分析

周朋君1，馬巖巖2，王一飛2，陳宏遠(yuǎn)1

（1.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州510006；2.暨南大學(xué)基因工程藥物國(guó)家工程研究中心；廣東 廣州510632）

摘要：目的克隆人源Leptin的成熟肽編碼序列后基因并構(gòu)建其原核重組表達(dá)菌株，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化鑒定；生物信息學(xué)分析其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并預(yù)測(cè)功能。方法提取人脂肪干細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA序列，PCR擴(kuò)增Leptin基因并將其克隆入表達(dá)載體pET-28a（+）原核質(zhì)粒，構(gòu)建該基因的重組原核表達(dá)載體pET-28a-Leptin。隨后進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。在E.coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，通過WB檢測(cè)Leptin蛋白的表達(dá)；利用在線網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并對(duì)重組蛋白結(jié)構(gòu)及功能等進(jìn)行驗(yàn)證和預(yù)測(cè)。結(jié)果PCR擴(kuò)增得到Leptin目標(biāo)DNA片段；成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Leptin，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，目的蛋白在宿主E.coli BL21（DE3）中高效表達(dá)Leptin融合蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量18 000。生物信息學(xué)檢索該基因編碼蛋白的氨基酸序列與理化參數(shù)顯示，蛋白無(wú)跨膜區(qū)，有6個(gè)Ser、1個(gè)Thr可能為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，第1～21位可能為信號(hào)肽區(qū)域。在Leptin氨基酸序列中：α-螺旋93處，無(wú)規(guī)則卷曲43處，延伸鏈17處，β-轉(zhuǎn)角14處，分別占總二級(jí)結(jié)構(gòu)的55.69%、25.75%、10.18%和8.38%。結(jié)論成功克隆了人的Leptin基因。利用原核載體表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并進(jìn)一步純化的Leptin蛋白具有免疫原性。其生物信息學(xué)分析及結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)結(jié)果可為深入研究Leptin蛋白的活性作用提供有益借鑒。

關(guān)鍵詞：Leptin基因；分子克隆；蛋白結(jié)構(gòu)分析

1994年 Zhang［1］首次成功克隆 Leptin基因。Leptin蛋白是肥胖基因（OB）的表達(dá)產(chǎn)物，人類OB基因于 1995年被發(fā)現(xiàn)，位于人7號(hào)染色體長(zhǎng)臂（q31.3）［2］，其編碼產(chǎn)物為一種分泌性蛋白，即Leptin，編碼這一蛋白的開放閱讀框高度保守［3］。

瘦蛋白受體屬于類細(xì)胞因子受體家族，瘦素與其受體相互作用，進(jìn)而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。其主要生理功能包括：抑制攝食、增加能量消耗［4］，保護(hù)消化系統(tǒng)功能［5］，維持正常的血脂代謝［6］，調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)［7］，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育［8］，促上皮細(xì)胞、血管生長(zhǎng)［9-10］，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、免疫功能［11-12］，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌［13］及控制腫瘤生長(zhǎng)［14］等。

本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)人瘦素基因進(jìn)行克隆、構(gòu)建及重組表達(dá)載體，并結(jié)合生物信息學(xué)分析研究該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，以期獲得產(chǎn)量高、免疫原性好的活性表達(dá)蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為該蛋白質(zhì)的優(yōu)化表達(dá)及其活性研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞 感受態(tài)DH5α購(gòu)自Promega公司，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離提取、鑒定。

1.1.2 主要試劑、材料和儀器 E.coli BL21（DE3）、表達(dá)載體pET-28a（+）購(gòu)于Novagen公司。成人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司。Taq PCR Master Mix購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，Prime START HS高保真酶、RT-PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶QuickCut EcoRⅠ、XhoⅠ、質(zhì)粒提取試劑盒及T4連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自 OMEGA公司；DNAMarker和蛋白Marker購(gòu)自廣州賽哲生物技術(shù)有限公司；WB抗體購(gòu)自CST公司；KTA Purifier層析系統(tǒng)系統(tǒng)，購(gòu)自GE公司；核酸蛋白分析儀購(gòu)自Beckman Coulter；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Leptin基因序列［GeneBank NM_000230.2］以及pET-28a（+）的特性，設(shè)計(jì)合成人Leptin基因CDS序列特異性引物。上游引物序列：5′-GACGAATTC ATGCATTGGGGA ACCCTGTGCG-3′；下游引物序列：5′-ATTCTCGAG TCAGCACCCAGGGCTGAGGT-3′；引物由華大基因公司合成（劃線部分為酶切位點(diǎn)EcoRⅠ、XhoⅠ）。

1.2.2 Leptin基因的擴(kuò)增 Trizol裂解法提取脂肪干細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA純度和濃度。根據(jù)RTPCR試劑盒使用說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：Primer STAR HS 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃，4 min；94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，80 s；30個(gè)循環(huán)；72℃，10 min；4℃待機(jī)。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析鑒定，切膠回收，純化PCR產(chǎn)物，檢測(cè)其純度和濃度。

1.2.3 pET-28a（+）-Leptin重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 按照質(zhì)粒提取試劑盒說明提取pET-28a（+）質(zhì)粒。按照限制酶說明對(duì)PCR產(chǎn)物和pET-28a（+）載體用EcoRⅠ、XhoⅠ酶分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠回收。連接體系：Leptin基因產(chǎn)物9 μL，pET-28a（+）載體1 μL，T4 Ligation Mix 10 μL。16℃連接過夜。熱休克法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑單克隆菌液態(tài)擴(kuò)增培養(yǎng)12 h后進(jìn)行菌落PCR、質(zhì)粒PCR鑒定和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，選擇陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 重組質(zhì)粒 pET-28a-Leptin在 E.coli BL21 （DE3）中的表達(dá) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coli BL21 （DE3）。挑取單菌落接種于K+的LB培養(yǎng)基中，180 r/min，37℃搖床培養(yǎng)10～12 h。擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。選取的溫度分別為：20、30、37℃。IPTG終濃度分別為：0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L。20℃時(shí)不同濃度IPTG誘導(dǎo)6、8、12 h；30℃時(shí)不同濃度IPTG誘導(dǎo)4、6、8、10 h；37℃時(shí)不同濃度IPTG誘導(dǎo)2、4、6、8 h。4℃、9 000 r/min、10 min離心收集菌體。稱量菌體濕質(zhì)量，以1∶10的比例加入1× PBS緩沖液，使用振蕩器重懸菌體。低溫超聲破碎30 min。4℃、17 000 g、30 min離心，分別取沉淀、上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)?？捡R斯亮藍(lán)染色后分析。

1.2.5 原核重組質(zhì)粒pET-28a-Leptin表達(dá)后的純化純化瘦素的程序?yàn)椋撼暺扑榫w-尿素溶解包涵體-蛋白復(fù)性-柱層析純化。菌體破碎后離心收集的沉淀，用含 2 mol/L尿素的 PBS洗滌沉淀，4℃、17 000 g，30 min離心收集沉淀。用含0.4%脫氧膽酸鈉的PBS洗滌，4℃、17 000 g，30 min離心收集沉淀。PBS洗滌2～3次，4℃、17 000 g，30 min離心收集沉淀。將沉淀溶于 PBS中，加終濃度為1 mmol/L的DTT，4℃攪拌過夜。4℃、9 000 r/min，20 min離心收集上清。NI-NTA填料裝柱，用純水洗2～3個(gè)柱體積之后，用pH8.0的PBS平衡柱子。將經(jīng)過平衡的填料于待測(cè)樣品冰浴攪拌3 h，2 h沉淀后裝柱。PBS洗至基線。用含30 mmol/L咪唑PBS洗脫雜蛋白，后用含400 mmol/L咪唑的PBS洗脫目的蛋白。脫咪唑后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取樣純化各個(gè)步驟的洗脫峰進(jìn)行12%SDSPAGE電泳檢測(cè)。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)重組 Leptin蛋白 采用Western blotting法，將純化的目的蛋白經(jīng)12%SDSPAGE分離后，轉(zhuǎn)膜，封閉，1×TBST洗滌3次，每次8 min，4℃孵育一抗過夜，用1×TBST洗滌3次，每次8 min，室溫孵育二抗（1∶8 000）1 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min，1×TBS洗滌1次，8 min，發(fā)光，顯影，定影，晾干，掃描記錄。

1.2.7 Leptin蛋白的生物信息學(xué)分析 利用在線工具對(duì)Leptin蛋白進(jìn)行生物學(xué)分析。將測(cè)序得到的cDNA序列在 NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)；采用ORFFinder分析確定Leptin基因的讀碼框；Leptin蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析：根據(jù)測(cè)序所得的cDNA序列，分析其相應(yīng)的氨基酸組成，采用ProtParam在線軟件檢索Leptin蛋白理化參數(shù)；采用ProtScal程序分析Leptin蛋白疏水性；采用TMHMM Serve，V2.0預(yù)測(cè)Leptin蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；采用NetPhos2.0 Server程序分析 Leptin蛋白磷酸化位點(diǎn)；采用 SignalP 4.1Server分析Leptin蛋白信號(hào)肽位點(diǎn)；采用SOPMA預(yù)測(cè) Leptin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用 Swiss-Model workspace預(yù)測(cè)Leptin蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 Leptin基因的PCR擴(kuò)增

以cDNA為模板，進(jìn)行PCR，得到504 bp的目的片段。構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)并培養(yǎng)后取菌液進(jìn)行菌落PCR鑒定；提取陽(yáng)性菌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳得到載體條帶5 335 bp和目的基因條帶504 bp，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，見圖1。

M.DNA分子標(biāo)記 DL15000/2000；1.雙酶切產(chǎn)物；2.pET-28a（+）空載體；3.Leptin基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 Leptin基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及重組pET-28a-Leptin質(zhì)粒限制性酶切分析Figure 1 　Recombinant plasmid pET-28a-Leptin identified by PCR and restriction enzyme digestion

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-Leptin的酶切鑒定及測(cè)序分析

測(cè)序結(jié)果與GeneBank中CDS序列進(jìn)行對(duì)比，匹配度為100%，見圖2。

圖2　pET-28a-Leptin部分測(cè)序結(jié)果圖Figure 2 　Partial sequencing results of pET-28a-Leptin

2.3 重組質(zhì)粒pET-28a-Leptin在E.coli BL21（DE3）中的表達(dá)

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，相對(duì)分子質(zhì)量18 000處有一明顯外源蛋白條帶（圖3A-E）。通過不同溫度、不同IPTG誘導(dǎo)濃度以及不同誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)目的蛋白最優(yōu)表達(dá)條件為20℃、1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物以及包涵體純化蛋白進(jìn)行Western blotting分析，得到特異性條帶（圖3F）。2.4 生物信息學(xué)分析結(jié)果2.4.1 Leptin蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析 提交上述所得DNA測(cè)序結(jié)果，在線ProtParam軟件進(jìn)行氨基酸序列組成分析，得到167個(gè)氨基酸，組成方式如下：

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVAL SRLQGSLQDMLWQLDLSPGC，與GenBank上列出的序列用Blast進(jìn)行比對(duì)，匹配度為100%。運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)該氨基酸序列分析。用ProtParam軟件檢索蛋白質(zhì)的理化參數(shù)，結(jié)果表明：目標(biāo)蛋白的分子式C842H1333N217O245S7，原子組成2 644，理論分子量為18 640.5，理論等電點(diǎn)為5.88；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為47.52，證明該蛋白不穩(wěn)定?？偲骄H水性（GRAVY）為0.131，其中負(fù)電荷殘基總數(shù)（Glu+ Asp）14，正電荷殘基（Lys+Arg）11。脂溶性指數(shù)為110.84，消光系數(shù)33585/33460，該氨基酸序列分子的氨基端帶有由21個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽序列，但不具有跨膜結(jié)構(gòu)，具有分泌蛋白的特性。CDD程序分析表明，該蛋白有一個(gè)典型的瘦素超家族保守結(jié)構(gòu)域，該保守結(jié)構(gòu)分布在第22～167位氨基酸之間。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明Leptin有6個(gè)

Ser，1個(gè)Thr，可能為蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)。信號(hào)肽區(qū)域第5位的信息肽評(píng)分（signal peptide score，S值）為0.971，在剪切位點(diǎn)第22位氨基酸殘基處裂解位點(diǎn)的評(píng)分（cleavage site score，C值）為0.862。聯(lián)合切割位點(diǎn)評(píng)分（combined cleavage site score，Y值）最大在第22位為0.897。D值（S-mean和Y-max的平均值）最大為0.916。第1～21位氨基酸可能為信號(hào)肽區(qū)域，平均S值為0.932，剪切位點(diǎn)在第21和22位氨基酸之間（圖4A-F）。

2.4.2 Leptin蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 SOPMA分析結(jié)果顯示，在Leptin氨基酸序列中：α-螺旋93處，無(wú)規(guī)則卷曲43處，延伸鏈17處，β-轉(zhuǎn)角14處，分別占總二級(jí)結(jié)構(gòu)的55.69%、25.75%、10.18%和8.38%。Swiss-Model workspace同源建模預(yù)測(cè)：對(duì)構(gòu)建好的模型用全局法和局部法進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。全局法中用QMEANscore4計(jì)分值估算（圖5A）。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢驗(yàn)：PDBsumGenerate提交數(shù)據(jù)后顯示Ramachandran圖（圖5B）和G-factor參數(shù)根據(jù)構(gòu)象的穩(wěn)定性，蛋白結(jié)構(gòu)G-factor計(jì)分總平均值為-0.06。

2.4.3 Leptin蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型模擬 采用Swiss-PdbViewer 4.1對(duì)上述目標(biāo)蛋白質(zhì)分子建模，三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化顯示、分析和疊加Swiss-Model預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)圖（圖6A），立體化學(xué)質(zhì)量參數(shù)（圖6B）。

M.蛋白分子標(biāo)記；A.pET-28a（+）vector及pET-28a-Leptin轉(zhuǎn)染的E.coli BL21（DE3）的表達(dá)情況：1、2.空載體轉(zhuǎn)染菌液上清，3、4.空載體轉(zhuǎn)染破碎菌體，5.重組載體轉(zhuǎn)染菌液上清，6、7.重組載體轉(zhuǎn)染后未誘導(dǎo)破碎菌體，8.重組載體轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)后破碎菌體；B.20℃，1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間表達(dá)情況：1.未誘導(dǎo)組，2～5.誘導(dǎo)2 h、6 h、8 h、12 h；C.37℃，1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間表達(dá)情況：1～3.誘導(dǎo)6 h、8 h、12 h，4.未誘導(dǎo)組；D.表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析：1.全菌樣品，2～4.菌體破碎后離心上清，5～7.菌體破碎后沉淀；E.SDS-PAGE分析目的蛋白Leptin的純化：1.純化蛋白；F.目的蛋白Leptin的Western blotting分析：1.全菌樣品，2.菌體破碎后離心沉淀，3.菌體破碎后離心上清，4.包涵體溶解后離心上清。圖3 Leptin重組蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表達(dá)Figure 3 Expression of recombinant protein Leptin in E.coli BL21（DE3）

A.ProtScale預(yù)測(cè)Leptin的疏水性；B.TMHMM Server V2.0預(yù)測(cè)Leptin的跨膜區(qū)；C.NetPhos2.0 Server預(yù)測(cè)Leptin的磷酸化位點(diǎn)；D.Signal P 4.1 Server預(yù)測(cè)Leptin信號(hào)肽；E～F.SOPMA對(duì)Leptin的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。圖4 Leptin蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析Figure 4 Analysis of the primary structure of Leptin

A.Leptin的Swiss-Model workspace模型評(píng)估結(jié)果；B.PROCHECK預(yù)測(cè)蛋白R(shí)amachandran圖；C.PDBsum Generate預(yù)測(cè)模型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。圖5 Leptin蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析及結(jié)構(gòu)檢驗(yàn)Figure 5 Analysis and verification of the secondary and tertiary structure of Leptin

A.Swiss-Model預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)模型圖；B.Swiss-Model的Ramachandran圖。圖6 Leptin蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型模擬Figure 6 Three dimensional model simulations of Leptinstructure

3 討論

本研究根據(jù)GenBank公布的人源Leptin mRNA序列，以編碼區(qū)為模板設(shè)計(jì)特異性引物，從人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中克隆該基因，經(jīng)酶切及DNA測(cè)序驗(yàn)證Leptin基因克隆成功。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物特異性好，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增可獲得明顯的Leptin基因條帶。構(gòu)建的 pET-28a-Leptin原核重組質(zhì)粒在 E.coli BL21 （DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)良好。本實(shí)驗(yàn)采用低溫條件誘導(dǎo)表達(dá)，最優(yōu)表達(dá)條件為20℃、1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，與之前報(bào)道相比對(duì)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化［15］。pET表達(dá)體系是目前在原核細(xì)胞中克隆和表達(dá)目的蛋白的最佳體系之一。本實(shí)驗(yàn)選用E.coli BL21（DE3）作為表達(dá)體系，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，操作簡(jiǎn)便、成本低、周期短、表達(dá)蛋白可大量生產(chǎn)且易于純化［16］。通過WB檢測(cè)Leptin蛋白的表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化分離，探索了一種簡(jiǎn)便、快速、高產(chǎn)的體外高效表達(dá)Leptin的方法。

為了提高瘦素蛋白的表達(dá)量及其蛋白活性作用，目前瘦素的研究大多以探討其表達(dá)條件優(yōu)化及相關(guān)作用為主，而缺少對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)分析方面的分析。本實(shí)驗(yàn)利用在線網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，并對(duì)重組蛋白結(jié)構(gòu)及功能等進(jìn)行驗(yàn)證和預(yù)測(cè)。利用在線工具對(duì)Leptin蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)顯示：成熟的Leptin前體為分泌性蛋白，帶有信號(hào)肽，N末端有21個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，該前體的信號(hào)肽在外周血中被剪切掉而成為146氨基酸，形成Leptin［17］。瘦素的初級(jí)結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)在哺乳動(dòng)物中高度保守［18］。Leptin有6個(gè)Ser、1個(gè)Thr可能作為蛋白激酶磷酸化潛在作用位點(diǎn)而參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)蛋白質(zhì)的親疏水區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果能為二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)域與功能域的劃分提供參考。

利用在線工具進(jìn)行Leptin蛋白的2、3級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，所得數(shù)據(jù)將為L(zhǎng)eptin蛋白的表達(dá)設(shè)計(jì)、定向遺傳改造、受體拮抗劑的開發(fā)及構(gòu)效關(guān)系的研究等提供科學(xué)依據(jù)。

最近研究顯示，體內(nèi)瘦素濃度與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)［19］，還參與下丘腦-垂體-性腺發(fā)育過程等［20］。目前，人類重組瘦素蛋白應(yīng)用于肥胖患者的治療已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)階段［21］。因此，采用本方法優(yōu)化表達(dá)的高產(chǎn)量瘦素蛋白將為其活性作用研究奠定良好基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-8783（2016）03-0355-07

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041205

收稿日期：2016-04-12

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015A020211036）

作者簡(jiǎn)介：周朋君（1989—），男，2013級(jí)碩士研究生；通信作者：陳宏遠(yuǎn)（1973—），男，教授，博士，主要從事抗腫瘤免疫及其分子機(jī)制研究，Email：hychen@gdpu.edu.cn。

Construction of Leptin gene expression vector and analysis of its protein structure

ZHOU Pengjun1，MA Yanyan2，WANG Yifei2，CHEN Hongyuan1
（1.Department of Pathogen Biology and Immunology，School of Basic Course，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.National Engineering Research Center of Genetic Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

AbstractObjective To clone and express human Leptin gene and protein and then analyze and predict its protein structure and function by bioinformatics.Methods Leptin mRNA sequence was amplified by RTPCR from human adipose-derived mesenchymal stem cells.The product was cloned into pET-28a + prokaryotic plasmid to construct the recombinant expression vector pET-28a-Leptin.After determined by restriction enzyme digestion and sequencing pET-28a-Leptin was transformed in E.coli BL21 DE3 for protein expression.The purified Leptin protein was identified by western blotting.Leptin protein was further analyzed for prediction of its structure and function by bioinformatics-associated databases and software. Results Leptin fragment was successfully amplified by PCR and cloned into pET-28a + plasmid.The

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-30 10：44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1044.005.htmlrecombinant protein Leptin was highly expressed in E.coli BL21 DE3 when induced by IPTG and its molecular weight was about 18 000.Bioinformatics analysis of Leptin displayed that this protein had not transmembrane region six Ser and one Thr might be the potential sites of protein kinase phosphorylation and bits 1-21 might be a signal peptide region.The secondary structure analysis of Leptin showed that this protein was consisted of α-helix 93 random coil 43 extended chain 17 and β-angle 14 which accounted for 55.69% 25.75% 10.18%and 8.38% respectively.Conclusion Human Leptin gene and protein has been successfully cloned and expressed.Bioinformatics analysis and structure prediction of Leptin provide an evidence for further study of its bioactivity.

Key wordsLeptin gene molecular cloning protein structure analysis