雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

陳佳園，顧取良，鄶一賀，歐意桃，王麗京，李衛(wèi)東

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雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

陳佳園1，顧取良2，鄶一賀1，歐意桃1，王麗京1，李衛(wèi)東3

（廣東藥科大學(xué)1.血管生物學(xué)研究所；2.基礎(chǔ)學(xué)院；3.健康學(xué)院，廣東 廣州510006）

摘要：目的探究雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7增殖的抑制作用。方法取培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7，用雷公藤甲素按不同濃度處理24 h后提取細(xì)胞蛋白和RNA，用Western blot和RT-PCR來檢測(cè)磷脂酶D1（PLD1）和c-Myc的表達(dá)。結(jié)果雷公藤甲素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖，并且在MDA-MB-231細(xì)胞中下調(diào)PLD1和c-Myc的表達(dá)。結(jié)論雷公藤甲素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MCF-7的增殖。

關(guān)鍵詞：雷公藤甲素；乳腺癌；磷脂酶D1（PLD1）

乳腺癌是全世界女性癌癥患者中最常見的惡性腫瘤之一，因此研究乳腺癌的預(yù)防與臨床治療倍受關(guān)注［1］。雷公藤是衛(wèi)茅科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，具有解毒散結(jié)、活血化淤、扶正祛邪等多種功效。雷公藤甲素，又稱雷公藤內(nèi)酯醇，是雷公藤主要的有效成分［2］。研究表明，不論是在體內(nèi)還是體外雷公藤甲素對(duì)多種癌癥細(xì)胞都有抑制作用，其抗腫瘤作用主要與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干預(yù)細(xì)胞周期和抑制腫瘤新生血管形成等有關(guān)［3］。磷脂酶D（phospholipase D， PLD）在大部分癌癥中都有過表達(dá)的現(xiàn)象，特別是乳腺癌中［4］。本研究用雷公藤甲素處理乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231，研究雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的作用以及對(duì)PLD1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞（上海中科院細(xì)胞庫）；雷公藤甲素（北京金寶在線科技公司）；Anti-

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-30 10：07 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1007.001.htmlACTIN鼠單克隆抗體（武漢博士德公司）；Anti-c-Myc兔單克隆抗體（武漢博士德公司）；Anti-PLD1兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）；RNA提取試劑Trizol（生工生物工程公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）。

1.2 主要儀器

Thermo Scientific Series 8000培養(yǎng)箱（賽默飛世爾公司）；Lifepro Thermal Cycler PCR儀（杭州博日公司）；AIRTECH超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰公司）；美國(guó)BioTek ELx800通用酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器公司）；GE ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀（美國(guó)通用公司）。

1.3 方法

1.3.1 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 分別取乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7 1 000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)皿中，貼壁培養(yǎng)24 h后，換液，加藥，分別加入含0、20、100 nmol/L不同濃度雷公藤甲素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，更換為正常培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)15 d后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3×5 min，加甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色，拍照比較克隆形成率。

1.3.2 半定量RT-PCR 收集培養(yǎng)的上述2種細(xì)胞，用Trizol提取總RNA并測(cè)定濃度，取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和半定量PCR。PCR反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃，1 min；57℃，35 s；72℃，1 min重復(fù)28個(gè)循環(huán)；72℃，10 min；于4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀拍照。引物信息：GAPDH（內(nèi)參照），F(xiàn)orward-5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，Reverse-5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；c-Myc，F(xiàn)orward：5′-CGTCCTCGGATTCTCTGCTC-3′，Reverse：5′-GCTGGTGCATTTTCGGTTGT-3′。

1.3.3 免疫蛋白印跡（Western blot） 將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：0 nmol/L雷公藤甲素、20 nmol/L雷公藤甲素、100 nmol/L雷公藤甲素。作用24 h后，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液50 μL，冰上裂解30 min，然后以4℃，13 000×g離心10 min，收集離心液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

用BCA法測(cè)量蛋白質(zhì)含量后，取等量蛋白質(zhì)加入各電泳通道 （各約50 μg）。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜。5%（φ）脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST（pH=7.6）清洗3×5 min，分別加入Anti-PLD1抗體（1∶1 000）、Anti-c-Myc抗體（1∶1 000）以及內(nèi)參ACTIN（1∶10 000），4℃孵育過夜，TBST清洗3×5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，再用TBST清洗3×5 min后，ECL法顯色。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MCF-7克隆形成有明顯的抑制作用（圖1）。

圖1　雷公藤甲素對(duì)兩種乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用Figure 1 Suppression of triptolide on the growth of breast cancer cells

2.2 雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞PLD1蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MCF-7細(xì)胞PLD1蛋白表達(dá)相比MDA-MB-231細(xì)胞較低（圖2A）；經(jīng)雷公藤甲素處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的PLD1蛋白表達(dá)隨著給藥濃度的增加逐漸降低（圖2B）。

圖2　雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7中PLD1蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of triptolide on PLD1 protein expression in MDA-MB-231 and MCF-7 cells

2.3 雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞c-Myc表達(dá)的影響

同時(shí)采用Western blot和RT-PCR檢測(cè)雷公藤甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞中c-Myc表達(dá)的影響。MCF-7細(xì)胞c-Myc在mRNA水平（圖3A）或蛋白水平（圖4A）

都沒有隨給藥濃度的增加而發(fā)生明顯變化；MDA-MB-231細(xì)胞的c-Myc在mRNA水平（圖3B）和蛋白水平（圖4B）的表達(dá)隨著給藥濃度的增加均下調(diào)。

圖3　雷公藤甲素對(duì)MCF-7細(xì)胞c-Myc mRNA表達(dá)的影響Figure 3 Effect of triptolide on c-Myc mRNA expression in MCF-7 cells

圖4　雷公藤甲素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of triptolide on c-Myc protein expression in MDA-MB-231 cells

3 討論

PLD包括PLD1和PLD2兩個(gè)亞型，能夠催化磷脂酰膽堿水解成磷脂酸和膽堿，其水解產(chǎn)物可繼而激活多條信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成過程［4］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在 MDA-MB-231細(xì)胞中PLD1高表達(dá)，MCF-7細(xì)胞中PLD1低表達(dá)，結(jié)果與KANG等［5］報(bào)道的一致；并且，在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞系TMX2-28中，PLD1蛋白表達(dá)水平比雌激素受體陰性的MCF-7細(xì)胞系高10倍以上［6］，提示PLD1的表達(dá)水平與雌激素受體相關(guān)。有研究報(bào)道雷公藤甲素通過雌激素受體而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖［7］。同時(shí)亦有研究報(bào)道，在乳腺癌細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)和PLD水平正相關(guān)［8］，在高表達(dá)PLD 的MDA-MB-231細(xì)胞中c-Myc表達(dá)水平也相對(duì)較高［9］。

c-Myc基因作為一種原癌基因，在正常細(xì)胞中的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，但在大部分癌細(xì)胞中處于活化狀態(tài)，一些惡性、低分化腫瘤常伴隨有c-Myc表達(dá)失控［10］。在檢測(cè)的MDA-MB-231細(xì)胞中，PLD1表達(dá)水平較高，c-Myc表達(dá)水平也較高，隨雷公藤甲素給藥濃度增加，該細(xì)胞內(nèi)PLD1和c-Myc表達(dá)均降低。而在MCF-7細(xì)胞中檢測(cè)到PLD1表達(dá)量很低，同時(shí)c-Myc表達(dá)水平也較高，雷公藤甲素處理后，c-Myc表達(dá)量并沒有明顯改變。因此推測(cè)，雷公藤甲素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過降低PLD1的表達(dá)而降低了c-Myc的表達(dá)，而對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用則可能是通過不同機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。由于本研究?jī)H檢測(cè)了PLD1這一亞型的表達(dá)變化情況，對(duì)于PLD2在雷公藤甲素抑制這兩個(gè)細(xì)胞系的增殖中作用及其與c-Myc表達(dá)之間的相關(guān)性等仍有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

中圖分類號(hào)：R737.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-8783（2016）03-0352-03

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110502

收稿日期：2015-11-05

作者簡(jiǎn)介：陳佳園，男，2013級(jí)碩士研究生，Email：chenjiayuan2015@163.com；通信作者：李衛(wèi)東（1962—），男，博士，教授，主要從事胃腸動(dòng)力學(xué)的中西醫(yī)結(jié)合研究，Email：gylwd26@163.com。

Suppression of triptolide on the proliferation of human breast cancer cells

CHEN Jiayuan1，GU Quliang2，KUAI Yihe1，OU Yitao1，WANG Lijing1，LI Weidong3
（1.Vascular Biology Research Institute；2.School of Basic Sciences；3.School of Health Sciences，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

AbstractObjective To explore the suppression of traditional Chinese medicine triptolide on breast cancer cells.Methods Human breast cancer MDA-MB-231and MCF-7 cells were treated with different concentrations of triptolide for 24 h.Phospholipase D1 PLD1 and c-Myc proteins were examined by western blot.c-Myc mRNA was examined by RT-PCR.Results Triptolide inhibited the proliferation of both breast cancer cells and down-regulated the expression of PLD1 and c-Myc in MDA-MB-231 cells. Conclusion Triptolide can suppress the proliferation of MDA-MB-231 and MCF-7 cells.

Key wordstriptolide breast cancer cells PLD1