雷公藤紅素對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞生長的抑制作用

謝閨娥，杜晶春，徐霞

?

雷公藤紅素對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞生長的抑制作用

謝閨娥1，2，杜晶春1，徐霞1

（1.廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院，廣東廣州510182；2.廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州510623）

摘要：目的研究雷公藤紅素對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞生長的作用及其機制。方法用MTT法檢測雷公藤紅素對紫杉醇耐藥MCF-7/TAX細胞生長的影響；Annexin V-FITC/PI染色檢測雷公藤紅素對MCF-7/ TAX凋亡的誘導作用；Caspase酶活性測定分析雷公藤紅素作用后，MCF-7/TAX細胞中Caspase-8、-9活化程度。結(jié)果MCF-7/TAX對紫杉醇耐藥指數(shù)達19.39；而雷公藤紅素對MCF-7/TAX細胞的生長有高效抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，對其作用48 h的IC50為0.92 μmol/L，MCF-7/TAX對雷公藤紅素的敏感性高于MCF-7，耐藥指數(shù)僅為0.77。雷公藤紅素作用后，Annexin V染色陽性的MCF-7/TAX細胞較對照明顯升高。Caspase酶活性測定結(jié)果顯示，雷公藤紅素作用24 h后，MCF-7/TAX細胞中Caspase-8、-9酶活性均顯著升高。結(jié)論雷公藤紅素能同時激活內(nèi)外源性凋亡途徑，誘導MCF-7/TAX細胞凋亡的發(fā)生，從而高效抑制紫杉醇耐藥MCF-7/TAX乳腺癌細胞的生長。

關(guān)鍵詞：紫杉醇耐藥；雷公藤紅素；MCF-7/TAX；凋亡

網(wǎng)絡出版時間：2016-05-30 15：12 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1512.009.html

惡性腫瘤是當今威脅人類健康的重大疾病，其中女性乳腺癌具有較高的復發(fā)率和死亡率，其發(fā)病率近年來呈上升趨勢，并趨年輕化［1］?；熓侵委熑橄侔┑葠盒阅[瘤最有效的手段之一，但腫瘤的耐藥性卻嚴重影響了抗腫瘤藥物的治療效果［2］。因此耐藥是癌癥化療的一個主要障礙，尋找抵抗耐藥性、尤其是多藥耐藥性的藥物是改善癌癥化學治療的一個重大課題。

紫杉醇自1992年美國FDA批準應用于腫瘤臨床以來，一直是抗腫瘤藥物研究的熱點，廣泛應用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃腸道腫瘤、頭頸部腫瘤等的治療，是目前抗腫瘤化療方案的重要組成部分［3-4］。然而，臨床上使用紫杉醇進行化療時，腫瘤對紫杉醇的化療抵抗使得紫杉醇的藥效降低，腫瘤對紫杉醇的耐藥性已成為限制該藥物臨床應用的一個主要原因［5］。因此，探索新的能抵抗紫杉醇耐藥性的藥物已成為腫瘤治療的當務之急。

雷公藤紅素（celastrol，又名南蛇藤素）是第一個從雷公藤屬植物分離得到的主要活性成分，具有廣譜抗腫瘤活性，能夠抑制乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞的惡性增殖［6-9］，但其對紫杉醇耐藥腫瘤細胞的作用尚未見報道。為此，本研究對雷公藤紅素能否抵抗紫杉醇耐藥性、對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞的生長發(fā)揮高效抑制作用進行了探索，并探討了其可能的作用機制，以期為開發(fā)抵抗紫杉醇耐藥性的高效化療藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人乳腺癌MCF-7細胞系購自ATCC；MCF-7紫杉醇耐藥細胞株（MCF-7/taxol-resistant，MCF-7/ TAX）購自廣州吉尼歐生物科技有限公司；雷公藤紅素、紫杉醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）為美國Hyclone公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青、鏈霉素溶液、Hepes為美國Gibco公司產(chǎn)品；MTT購自美國Genview公司；細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司；Caspase-8、-9酶活性分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%（φ）

FBS、100 IU/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，紫杉醇耐藥乳腺癌細胞MCF-7/TAX培養(yǎng)于含1.0 μmol/L紫杉醇的上述培養(yǎng)基中以維持其耐藥表型；傳代時用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。

1.2.2 MTT比色法 取對數(shù)生長期的細胞，用胰酶消化，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×104/mL；每孔種200 μL細胞懸液于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，將培養(yǎng)板置37℃、5%（φ）CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)；24 h后，取出培養(yǎng)板，吸去舊培養(yǎng)液，加入不同濃度的雷公藤紅素（設7個不同濃度：0.25、0.5、1、2.5、5、10、20 μmol/L）或不同濃度的紫杉醇（設7個不同濃度：0.25、0.5、1、2.5、5、10、20 μmol/L），同時設立對照組，每組均設3個平行孔，置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)；48 h后取出96孔板，在超凈工作臺內(nèi)每孔加MTT（5 mg/mL）20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出培養(yǎng)板，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞內(nèi)MTT與線粒體酶反應后生成的藍紫色結(jié)晶物；用注射器小心吸棄培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定其吸光度（A）值，按下述公式計算生長抑制率：抑制率=（1-A加藥組/ A對照組）×100%，并按本課題組之前報道的方法采用Bliss′s軟件計算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值［10］。耐 藥 指 數(shù)（resistance index，RI）=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI染色 取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞MCF-7/TAX接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)過夜；加入終濃度為2.0 μmol/L的雷公藤紅素，8 h后用不含EDTA的胰蛋白酶將細胞從培養(yǎng)皿消化下來，制成單細胞懸液；用PBS洗滌細胞2次；用1×binding buffer懸浮細胞至1×106個/mL，取100 μL細胞懸液加入5 μL Annexin VFITC和10 μL PI，混勻，室溫避光反應15 min；然后再加入400 μL 1×binding buffer充分混合后在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 Caspase-8、-9酶活性測定 收集經(jīng)過不同劑量雷公藤紅素處理24 h后的MCF-7/TAX細胞，PBS洗滌2次后用冰冷的lysis buffer重懸，置冰上孵育40 min，10 000 r/min離心1 min后收集上清（含裂解的蛋白質(zhì)）至新管中，采用Bradford法測定蛋白濃度；然后每管中取150 μg蛋白用lysis buffer稀釋至50 μL，加入含 0.5 μL DTT的 50 μL 2×reaction buffer，再加入5 μL Caspase-8底物或Caspase-9底物并于37℃避光孵育4 h；用酶標儀測定405 nm的吸光度值，通過計算加藥組A/對照組A的比值來確定雷公藤紅素處理后Caspase活性增加的倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素和紫杉醇對乳腺癌細胞的生長抑制情況

MTT結(jié)果顯示，紫杉醇對MCF-7作用48 h的IC50為1.07 μmol/L，對紫杉醇耐藥細胞株MCF-7/ TAX作用48 h的IC50為20.75 μmol/L，RI達19.39，見表1。雷公藤紅素可高效抑制紫杉醇耐藥細胞MCF-7/TAX的生長，且具有明顯的劑量依賴性（圖1），作用48 h的IC50僅為0.92 μmol/L；雷公藤紅素對MCF-7作用48 h的IC50為1.19 μmol/L，MCF-7/ TAX對雷公藤紅素的敏感性高于MCF-7，RI僅為0.77，見表1。

表1 雷公藤紅素及紫杉醇對MCF-7/TAX細胞及其親本細胞MCF-7作用的IC50值（μmol·L-1）Table 1 IC50values of celastrol and paclitaxel on MCF-7/TAX cells and their parental MCF-7 cells

圖1　雷公藤紅素對MCF-7/TAX細胞生長抑制曲線Figure 1 Effect of celastrol on the growth of MCF-7/TAX cells

2.2 雷公藤紅素對MCF-7/TAX細胞的凋亡誘導作用

Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，MCF-7/ TAX不加雷公藤紅素的對照凋亡細胞比率為0.7%；MCF-7/TAX加2.0 μmol/L雷公藤紅素作用8 h后的凋亡細胞比率達20.8%，較對照明顯升高（圖2）。

圖2　Annexin V-FITC/PI染色檢測雷公藤紅素對MCF-7/ TAX細胞的凋亡誘導作用Figure 2 Annexin V-FITC/PI staining of MCF-7/TAX cells after treated with celastrol

2.3 雷公藤紅素對MCF-7/TAX細胞Caspases酶活性的影響

雷公藤紅素作用24 h后，MCF-7/TAX細胞中Caspase-8、-9酶活性均顯著升高。在2.0 μmol/L雷公藤紅素作用24 h后，MCF-7/TAX細胞Caspase-8、-9活性均升高至對照6倍以上（圖3）。

與對照組比較：**P＜0.01。圖3 雷公藤紅素對MCF-7/TAX細胞Caspases酶活性的影響Figure 3 Effect of celastrol on the activity of Caspases in MCF-7/TAX cells

3 討論

腫瘤細胞的耐藥性包括原發(fā)性耐藥（intrinsic resistance）和獲得性耐藥（acquired resistance）［11］。多數(shù)腫瘤細胞的耐藥性屬于獲得性耐藥，是在化學治療過程中逐漸產(chǎn)生的，例如乳腺癌的耐藥性常常是由化療藥物誘導產(chǎn)生的。腫瘤細胞一旦產(chǎn)生耐藥性，化療藥物就無法殺死癌細胞，致使在腫瘤治療后期，療效越來越差，副作用越來越大，這是導致惡性腫瘤最終無藥可用的最重要原因之一。

研究表明，雷公藤紅素能夠抑制多種腫瘤細胞株的惡性增殖并影響細胞凋亡［4-7］，但其對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞的作用尚未明確。本文對雷公藤紅素對紫杉醇耐藥細胞株MCF-7/TAX生長的影響進行了探討。MTT比色結(jié)果顯示，紫杉醇耐藥細胞株MCF-7/TAX對紫杉醇的耐藥指數(shù)達19.39；而雷公藤紅素作用MCF-7/TAX細胞48 h的IC50僅為0.92 μmol/L，紫杉醇耐藥細胞對雷公藤紅素的敏感性高于其親本細胞MCF-7（IC50為1.19 μmol/L），說明雷公藤紅素能抵紫杉醇耐藥乳腺癌細胞的耐藥性，對其生長發(fā)揮高效抑制作用。

細胞凋亡是指生物體內(nèi)細胞在特定的內(nèi)源和外源信號誘導下，其死亡途徑被激活，并在有關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過程。研究表明細胞凋亡與腫瘤細胞耐藥的發(fā)生有著密切關(guān)系。本研究Annexin V-FITC/PI染色顯示，經(jīng)雷公藤紅素作用后，Annexin V-FITC染色陽性的MCF-7/TAX細胞比例顯著升高，表明雷公藤紅素能誘導MCF-7/TAX細胞凋亡的發(fā)生。

經(jīng)典的凋亡途徑分為外源性凋亡途徑和內(nèi)源性途徑［12］。外源性凋亡途徑又稱死亡受體途徑，在此途徑中，死亡配體與相應的位于細胞表面的死亡受體結(jié)合后，死亡受體胞內(nèi)段的死亡結(jié)構(gòu)域吸引銜接蛋白并募集Caspase-8的前體，形成死亡誘導信號復合物，引起Caspase-8活化，活化的Caspase-8再進一步激活下游的Caspase-3、-6、-7等效應 Caspase［13］，從而誘導細胞凋亡。內(nèi)源性途徑凋亡途徑又稱線粒體途徑，當?shù)蛲龃碳ひ蜃右鸺毎貜木€粒體釋放到胞質(zhì)，與胞質(zhì)中的凋亡蛋白激活因子1（Apaf-1）結(jié)合形成多聚復合物，多聚復合物募集胞質(zhì)中的Caspase-9前體，形成凋亡小體（apoptosome），導致Caspase-9前體活化產(chǎn)生有活性的Caspase-9，后者再激活下游的效應Caspase［14］。本研究Caspases酶活性測定實驗顯示，雷公藤紅素作用24 h后，MCF-7/ TAX細胞中Caspase-8、-9酶活性均顯著升高，呈劑量依賴性。在2.0 μmol/L雷公藤紅素作用24 h后，MCF-7/TAX細胞Caspase-8、-9活性均升高至對照6倍以上。Caspase-8、-9的同時激活表明雷公藤紅素誘導MCF-7/TAX的凋亡過程中內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑同時被激活。

總之，本研究結(jié)果證實，雷公藤紅素能抵紫杉醇耐藥乳腺癌細胞的耐藥性，激活MCF-7/TAX細胞內(nèi)源性和外源性凋亡途徑，誘導MCF-7/TAX細胞凋亡，從而對其生長發(fā)揮高效抑制作用，這將為新的抗紫杉醇耐藥化療藥物的研發(fā)提供基礎。

參考文獻：

［1］JEMAL A，BRAY F，CENTER M M，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［2］GILLET J P，GOTTESMAN M M.Mechanisms of multidrug resistance in cancer［J］.Methods Mol Biol，2010，596：47-76.

［3］BARBUTI A M，CHEN Z S.Paclitaxel through the ages of anticancer therapy：exploring its role in chemoresistance and radiation therapy［J］.Cancers（Basel），2015，7（4）：2360-2371.

［4］RIVKIN I，COHEN K，KOFFLER J，et al.Paclitaxelclusters coated with hyaluronan as selective tumor-targeted nanovectors［J］.Biomaterials，2010，31（27）：7106-7114.

［5］FOJO T，MENEFEE M.Mechanisms of multidrug resistance：thepotentialroleofmicrotubule-stabilizing agents［J］.Ann Oncol，2007，18（Suppl 5）：3-8.

［6］LEE H W，JANG K S，CHOI H J，et al.Celastrol inhibits gastric cancergrowthbyinductionofapoptosisand autophagy［J］.BMB Rep，2014，47（12）：697-702.

［7］PANG X，YI Z，ZHANG J，et al.Celastrol suppresses angiogenesis-mediated tumor growth through inhibition of AKT/mammalian target of rapamycin pathway［J］.Cancer Res，2010，70（5）：1951-1959.

［8］ZHAO X，GAO S，REN H，et al.Inhibition of autophagy strengthens celastrol-induced apoptosis in human pancreatic cancer in vitro and in vivo models［J］.Curr Mol Med，2014，14（4）：555-563.

［9］MI C，SHI H，MA J，et al.Celastrol induces the apoptosis of breastcancercellsandinhibitstheirinvasionvia downregulation of MMP-9［J］.Oncol Rep，2014，32（6）：2527-2532.

［10］XIE G，LI J，CHEN J，et al.Knockdown of flotillin-2impairs the proliferation of breast cancer cells through modulation of Akt/FOXO signaling［J］.Oncol Rep，2015，33（5）：2285-2290.

［11］DINIC J，PODOLSKI-RENIC A，STANKOVIC T，et al.New approaches with natural product drugs for overcoming multidrug resistance in cancer［J］.Curr Pharm Des，2015，21（38）：5589-5604.

［12］FULDA S，DEBATIN K M.Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy［J］. Oncogene，2006，25（34）：4798-4811.

［13］STENNICKE H R，JüRGENSMEIER J M，SHIN H，et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of Caspase-8 ［J］.J Biol Chem，1998，273：27084-27090.

［14］SRINIVASA M S，MANZOOR A，TERESA F A，et al. Autoactivationofprocaspase-9byApaf-1-mediated oligomerization［J］.Mol Cell，1998，1（7）：949-957.

（責任編輯：幸建華）

中圖分類號：R737.9

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0335-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016011801

收稿日期：2016-01-18

基金項目：國家自然科學基金項目（81101682）；廣東省公益研究與能力建設專項資金項目（2014A020212015）

作者簡介：謝閨娥（1981—），女，博士，講師，主要從事分子診斷和分子腫瘤學研究；通信作者：徐霞（1962—），女，教授，主要從事分子診斷和分子腫瘤學研究，Email：xux2014@126.com。

Inhibitory effect of celastrol on the growth of taxol-resistant breast cancer cells

XIE Gui′e1，2，DU Jingchun1，XU Xia1
（1.KingMed School of Laboratory Medicine，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China；2.Guangzhou Women and Children′s Medical Center，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510623，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of celastrol on the growth of taxol-resistant breast cancer cells and explore its underlying mechanism.Methods After treatment with celastrol，the growth of taxol-resistant MCF-7/TAX cells was analyzed by MTT assay，the cell apoptosis was evaluated by Annexin V-FITC/PI staining，and the activity of Caspase-8 and-9 was quantified by enzymatic activity assay.Results Treatment with celastrol markedly inhibited MCF-7/TAX cell growth in a dose-dependent manner，and its IC50was 0.92 μmol/L.Celastrol decreased the resistance index of MCF-7/TAX cells from 19.39 to 0.77.Celastrol treatment facilitated the cell apoptosis and increased the activities of Caspase-9 and-8 in MCF-7/TAX cells.Conclusion Celastrol may suppress the growth of taxol-resistant MCF-7/TAX cells by up-regulation of both intrinsic and extrinsic apoptotic pathways.

Key words：taxol resistance；celastrol；MCF-7/TAX cells；apoptosis