壯腰健腎丸的質(zhì)量標準研究

胡偉杰，符健，湯小燕，王巖

?

壯腰健腎丸的質(zhì)量標準研究

胡偉杰1，符健2，湯小燕2，王巖1

（1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東廣州510006；2.廣東恒誠制藥有限公司，廣東湛江524000）

摘要：目的提高壯腰健腎丸的質(zhì)量標準。方法采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別壯腰健腎丸中的狗脊、雞血藤、桑寄生、金櫻子；采用高效液相色譜（HPLC）法測定槲皮素、咖啡酸的質(zhì)量分數(shù)。結果 TLC圖譜斑點清晰、分離度好且陰性對照無干擾。槲皮素在0.999 9～2.498 0 μg線性關系良好（r=0.999 9），平均回收率為102.15%，RSD為1.77%；咖啡酸在0.024 7～0.628 2 μg線性關系良好（r=0.999 7），平均回收率為100.96%，RSD為1.40%。結論提高后的質(zhì)量標準能更好地控制壯腰健腎丸的質(zhì)量。

關鍵詞：壯腰健腎丸；質(zhì)量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法

壯腰健腎丸為主治腎虧腰痛、祛風除濕的中成藥方，收錄于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》標準中［1］。本方是由狗脊、黑老虎、雞血藤、千斤拔、牛大力、桑寄生、金櫻子、女貞子、菟絲子共9味固腎補腰藥材煉制而成的濃縮水蜜丸，功能溫腎固精、強腰除濕，對于腎虛所致四肢酸痛無力、腰力不繼頗有療效［1］；其中原兒茶酸、咖啡酸、槲皮素分別為狗脊、桑寄生的有效成分，具有抗感染、抗氧化之功效［2-4］。原有標準只對其中數(shù)味藥材的顯微結構及化學鑒別項進行檢查，不夠全面。本文考察壯腰健腎丸中狗脊等4味中藥的薄層鑒別研究，建立主要藥味的專屬性鑒別方法，采用高效液相色譜法測定制劑中主要成分槲皮素、咖啡酸的質(zhì)量分數(shù)，完善壯腰健腎丸的質(zhì)量標準，實現(xiàn)對其質(zhì)量的有效控制。

1 儀器與試藥

BP211D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司），HWS-28型電熱恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司），HN-1006B型超聲波清洗儀（廣州市華南超聲設備有限公司，頻率40 kHz，功率250 W），ZF-90B型暗箱紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠），UltiMate?3000系列高效液相色譜儀（Dionex

網(wǎng)絡出版時間：2016-06-14 15：04 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160614.1504.002.html技術有限公司）、1260系列高效液相色譜儀（Agilent科技有限公司）。

狗脊、雞血藤、桑寄生、金櫻子對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：121071-201405、121173-201103、121075-201003、121047-201204）；槲皮素、咖啡酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-201509、110885-201002）；壯腰健腎片（廣東恒誠制藥有限公司，批號：1502707、1508706、1508707、1508708）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠），甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 狗脊的薄層鑒別［3-4］取本品5 g，研細，置100 mL具塞錐形瓶中，加水10 mL濕潤，加乙酸乙酯50 mL，超聲處理30 min，取乙酸乙酯層，濾過，濾液蒸干，加入甲醇1 mL溶解殘渣，作為供試品溶液；取狗脊對照藥材2 g，同法制備對照藥材溶液；取缺狗脊的樣品5 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》四部“通則0502薄層色譜法”試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一塊薄層硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（體積比10∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液在與對照藥材溶液相應位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖1。

1～3.壯腰健腎丸（批號：1502707）；4.狗脊對照藥材；5.陰性對照。圖1 壯腰健腎丸中狗脊薄層鑒別色譜圖Figure 1 　Thin layer chromatogram of Rhizoma cibotii in Zhuangyao Jianshen pills

2.1.2 雞血藤的薄層鑒別［5-6］取本品5 g，研細，置100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加水20 mL溶解殘渣，用乙酸乙酯30 mL萃取，萃取2次，合并2次乙酸乙酯萃取液，濾過，濾液蒸干，加甲醇1 mL使殘渣溶解，得供試品溶液；取雞血藤對照藥材2 g，同法制備對照藥材溶液；取缺雞血藤的陰性樣品5 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。按照2015年版《中國藥典》四部“通則0502薄層色譜法”試驗，分別吸取上述3種溶液2 μL，分別點于同一塊薄層硅膠G板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（體積比5∶4∶0.8）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以8%香草醛-H2SO4溶液，在105℃加熱2 min后，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材溶液相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

1～3.壯腰健腎丸（批號：1502707）；4.雞血藤對照藥材；5.陰性對照。圖2 壯腰健腎丸中雞血藤薄層鑒別色譜圖Figure 2 Thin layer chromatogram of Caulis Spatholobi in Zhuangyao Jianshen pills

2.1.3 桑寄生的薄層鑒別［7］按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液；取桑寄生對照藥材2 g，同法制備對照藥材溶液；取缺桑寄生樣品5 g，按供試品溶液的制備方法制成制備陰性對照溶液。按照2015年版《中國藥典》四部“通則0502薄層色譜法”試驗，分別吸取供試品、陰性對照溶液2 μL，對照藥材溶液4 μL，分別點于同一塊薄層硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（體積比9∶3∶1.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%H2SO4-乙醇溶液，在105℃加熱3 min后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材溶液相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖3。

1～3.壯腰健腎丸（批號：1502707）；4.桑寄生對照藥材；5.陰性對照。圖3 壯腰健腎丸中桑寄生薄層鑒別色譜圖Figure 3 　Thin layer chromatogram of Taxillus chinensis in Zhuangyao Jianshen pills

2.1.4 金櫻子的薄層鑒別［8-10］按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液；取金櫻子對照藥材2 g，同法制備對照藥材溶液；取缺金櫻子樣品5 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》四部“通則0502薄層色譜法”試驗，分別吸取上述3種溶液4 μL，分別點于同一塊薄層硅膠G板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（體積比10∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以8%香草醛-H2SO4溶液，在105℃加熱3 min后，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材溶液相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖4。

1～3.壯腰健腎丸（批號：1502707）；4.金櫻子對照藥材；5.陰性對照。圖4 壯腰健腎丸中金櫻子薄層鑒別色譜圖Figure 4 　Thin layer chromatogram of Cherokee rose in Zhuangyao Jianshen pills

2.2 槲皮素的含量測定［10-12］

2.2.1 色譜條件 色譜柱為DIONEX Acclaim?120 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1% H3PO4（體積比47∶53），檢測波長為370 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25℃，進樣量為10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品49.96 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇-25% HCl（體積比95∶5）稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品約1.25 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，精密加入甲醇-25%HCl（體積比95∶5）25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，取出，放冷，用甲醇-25%HCl（體積比95∶5）補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取缺桑寄生的陰性對照樣品2 g，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取對照品、供試品、陰性對照溶液10 μL注入液相色譜儀中，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結果顯示理論塔板數(shù)按槲皮素峰計算應不低于5 000；供試品中其他成分對槲皮素的測定無干擾，見圖5。

結合部位高塑性黏土的永久變形示意圖見圖12，其豎直向和順河向的永久變形如圖13所示。由于材料變形參數(shù)較低，地震后高塑性黏土主要表現(xiàn)為向中部的壓縮變形以及向下游的變形，高塑性黏土與廊道上游面處于壓緊的狀態(tài)，與下游面有脫開變形趨勢；與副防滲墻下游面處于壓緊的狀態(tài)，與上游面有脫開變形趨勢。在廊道頂部靠心墻部位，高塑性黏土最大沉降變形26 cm，向上變形最大為6 cm，順河向最大變形為15 cm左右。

1.槲皮素。圖5 槲皮素對照品（A）、供試品（B）、缺桑寄生陰性對照（C）溶液的HPLC色譜圖Figure 5 　HPLC chromatogram of caffeic acid reference substance（A），the sample（B）and negative control without Taxillus（C）

2.2.6 線性關系的考察 分別精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液1 mL至2、5、10、25、50 mL容量瓶中，分別加甲醇-25%HCl（體積比95∶5）至刻度，搖勻。分別精密上述對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下方法測定，記錄峰面積。以槲皮素對照品進樣量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，結果得線性回歸方程Y=77.347X-0.001（r=0.999 9）。結果表明，槲皮素在0.099 9～2.498 0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取槲皮素對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積，其RSD值為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 分別取3批壯腰健腎丸（批號：1508706、1508707、1508708），各6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結果3批次樣品中槲皮素平均質(zhì)量分數(shù)為0.188 mg/g，RSD值為1.82%，表明本方法重復性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：1508708），室溫放置0、2、4、8、12、24 h后分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定并計算槲皮素峰面積的RSD值為1.34%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知質(zhì)量分數(shù)的同一批壯腰健腎丸（批號：1508708），每份約1 g，精密稱定，共6份，分別置50 mL錐形瓶中，每份精密加0.049 6 mg/mL的槲皮素對照品溶液3 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算得平均回收率為 102.15%，RSD為1.77%。見表1。

表1 壯腰健腎丸中槲皮素的加樣回收率試驗結果Table 1 The recovery results of quercetin in Zhuangyao Jianshen pills（n=6）

2.2.11 樣品的測定 分別取3批（批號：1508706、1508707、1508708）壯腰健腎丸各1 g，每批平行操作2份，共6份，精密稱定。分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結果顯示3批樣品中槲皮素的質(zhì)量分數(shù)平均值分別為0.187 6、0.211 6、0.208 1 mg/g。

2.3 咖啡酸質(zhì)量分數(shù)的測定［13-14］

2.3.1 色譜條件［13-14］色譜柱為DIONEX Acclaim?120 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-1%H3PO4（體積比20∶80），檢測波長為323 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25℃，進樣量為10 μL。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品約5 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸（體積比70∶30）25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，取出，放冷，用甲醇-1%冰醋酸（體積比70∶30）補足此前減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 取缺狗脊的陰性對照樣品2 g，按“2.3.3”項下方法制備，即得。

2.3.5 專屬性試驗 分別精密吸取對照品、供試品、陰性對照溶液10 μL，按上述條件測定，結果顯示理論塔板數(shù)按咖啡酸峰計算應不低于4 900；供試品中其他成分對咖啡酸的測定無干擾，見圖6。

2.3.6 線性關系的考察 分別精密吸取“2.3.2”項下對照品溶液1 mL至2、5、10、25、50 mL容量瓶中，分別加甲醇-1%冰醋酸（體積比70∶30）至刻度，搖勻。分別精密吸取上述對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下方法測定，以咖啡酸對照品進樣量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，結果得線性回歸方程Y=90.491X+0.004（r=0.999 9）。結果表明，咖啡酸在0.024 7～0.628 2 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

1.咖啡酸。圖6 咖啡酸對照品（A）、供試品（B）、缺狗脊陰性對照（C）溶液的HPLC色譜圖Figure 6 HPLC chromatogram of caffeic acid（A），the sample （B）and negative sample without Rhizoma cibotii（C）

2.3.7 精密度試驗 精密吸取咖啡酸對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件重復進樣6次，測定峰面積，其RSD值為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復性試驗 分別取3批壯腰健腎丸（批號：1508706、1508707、1508708），各 6份，分別按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定并計算質(zhì)量分數(shù)，結果3批樣品中咖啡酸平均質(zhì)量分數(shù)為0.044 mg/g，RSD值為1.50%，表明本方法重復性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：1508708），室溫放置0、2、4、8、12、24 h后分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按“2.3.1”項下色譜條件測定并計算咖啡酸峰面積的RSD值為0.64%，表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.10 加樣回收率試驗 取已知質(zhì)量分數(shù)的同一批壯腰健腎丸（批號：1508707）約2 g，精密稱定，共6份，分別置25 mL錐形瓶中，每份精密加入質(zhì)量濃度為0.049 6 mg/mL的咖啡酸對照品溶液2 mL，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算得咖啡酸平均回收率為100.96%，RSD為1.40%。見表3。

表3 壯腰健腎丸中咖啡酸的加樣回收率試驗結果Table 3 　The recovery results of caffeic acid in Zhuangyao Jianshen pills（n=6）

2.3.11 樣品的測定 分別取3批壯腰健腎丸（批號：1508706、1508707、1508708），各0.1 g，精密稱定，每批平行操作2份，共6份，精密稱定。分別按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，結果3批樣品中咖啡酸的質(zhì)量分數(shù)平均值分別為0.047 2、0.037 0、0.048 4 mg/g。

3 討論

在TLC鑒別試液預處理篩選條件時，曾考察不同提取方式（加熱回流、超聲、萃取）及提取時間（15、30、60 min）對薄層效果的影響。結果表明，加熱回流與超聲處理兩者提取效率相當，考慮到設備及場地的便利，4個鑒別項皆選用超聲處理；在提取時間的選擇上，斑點顏色隨著提取時間的延長略有加深，考慮到試驗效率，提取30 min基本上能達到薄層鑒別所需的質(zhì)量濃度。

在TLC鑒別耐用性考察中，考察了不同溫濕度對分離效果的影響。使用顯色劑輔助鑒別，將雞血藤、金櫻子的鑒別條件調(diào)整為日光下檢視，斑點直觀清晰、圓整，在設備限制的情況下確保標準可用；在桑寄生的鑒別中，噴灑顯色劑后加熱必須控制好時間，一般在105℃時3 min即可，加熱時間過長會導致斑點發(fā)黑甚至消失，影響觀察效果；在金櫻子項中一般使用GF254硅膠板方法檢測藥材中的內(nèi)酯類成分，經(jīng)試驗后發(fā)現(xiàn)其主斑點不明顯，改用硅膠G輔以顯色劑后，主斑點清晰可見。

在質(zhì)量分數(shù)測定研究中，初期曾選用原兒茶酸作為壯腰健腎丸測定指標，但結果顯示狗脊單陰性及狗脊、金櫻子雙陰性對照組均出現(xiàn)干擾，故不能將原兒茶酸單獨用于本制劑的質(zhì)量分數(shù)測定，故未列入標準當中。最終確定以槲皮素、咖啡酸為指標進行質(zhì)量分數(shù)測定，結果顯示方法準確可靠、重復性好。

參考文獻：

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第3冊：WS3—B—0538—91［S］.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，1991：70.

［2］《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：120，200，426，751.

［3］劉菊香，范廣璞，劉長春，等.咖啡酸維生素C酯的合成、抑菌活性和抗氧化性研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33 （19）：218-221.

［4］蘇俊鋒，郭長江，韋京豫，等.槲皮素體內(nèi)外抗氧化作用的比較研究［J］.中國應用生理學雜志，2002，18（4）：382-385.

［5］張春輝，吳愛英，楊曉云，等.壯腰健腎片的質(zhì)量標準［J］.中國藥師，2006，12（9）：1121-1123.

［6］李光喜.首烏補汁的薄層色譜鑒別［J］.廣東藥學院學報，2003，19（1）：10-11.

［7］汪艷，陳曉燕，熊富良，等.椎痛安膠囊質(zhì)量標準的研究［J］.醫(yī)藥導報，2009，28（1）：100-102.

［8］李中娥.徵瘕消散丸質(zhì)量標準研究［J］.中國藥師，2012，15（6）：788-791.

［9］李軍蘭，張文麗，王德.豨薟風濕片的質(zhì)量標準研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2013，26（5）：762-765.

［10］金陽.補腎強身膠囊質(zhì)量標準研究［J］.安徽醫(yī)藥，2007，11（9）：800-802.

［11］蔣秋桃，孫輝，文慶.健腎壯腰丸質(zhì)量標準的研究［J］.海峽藥學，2011，23（9）：59-61.

［12］陳霞明，趙成.HPLC法測定壯腰健腎片中槲皮素的含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9（6）：44-45.

［13］張春輝，吳愛英，楊曉云.壯腰健腎片的質(zhì)量標準［J］.中國藥師，2006，9（12）：1121-1123.

［14］晏媛，劉世霆，許重遠，等.高效液相色譜法同時測定蒲公英中咖啡酸和阿魏酸的含量［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2006，23（3）：229-231.

（責任編輯：劉曉涵）

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0330-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032803

收稿日期：2016-03-28

作者簡介：胡偉杰（1990—），碩士，主要從事中藥制劑研究與開發(fā)，Email：18826420844@163.com；通信作者：王巖（1972—），博士，教授，從事中藥制劑研究與開發(fā)，電話：020-39352169，Email：gdpuwy@126.com。

Study on quality standard of Zhuangyao Jianshen pills

HU Weijie1，F(xiàn)U Jian2，TANG Xiaoyan2，WANG Yan1
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Guangdong Hengcheng Pharmaceutical Co.Ltd，Zhanjiang 524000，China）

AbstractObjective To improve the quality standard of Zhuangyao Jianshen pills.Methods Rhizoma cibotii Caulis Spatholobi Taxillus chinensis and Cherokee rose in the pills were identified by TLC both the contents of quercetin and caffeic acid were determined with HPLC.Results The TLC spots were clear and separated well without interference by the negative control.Quercetin had good linearity in the range of 0.099 9-2.498 0 μg r=0.999 9 .The average recovery was 102.15% with RSD of 1.77%.Caffeic acid had good linearity in the range of 0.024 7-0.628 2 μg r=0.999 9 .The average recovery was 100.96% with RSD of 1.40%.Conclusion The method was specific sensitive and repeatable which could achieve better quality control of Zhuangyao Jianshen pills.

Key wordsZhuangyao Jianshen pills quality standard TLC identification HPLC