FTIR-ATR結(jié)合膜富集技術(shù)測定中藥材地龍中微量銅的含量

蔡嘉華，尹嵩杰，陳超，王淑美，梁生旺

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FTIR-ATR結(jié)合膜富集技術(shù)測定中藥材地龍中微量銅的含量

蔡嘉華1，2，3，尹嵩杰1，2，3，陳超1，2，3，王淑美1，2，3，梁生旺1，2，3

（1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006；3.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州510006）

摘要：目的利用傅里葉變換-衰減全反射紅外光譜（FTIR-ATR）結(jié)合膜富集技術(shù)，建立中藥材地龍中微量銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的快速、經(jīng)濟(jì)的測定方法。方法首先，對30批校正集樣品進(jìn)行濕法消解，利用銅與金屬絡(luò)合劑1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（PAN）發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，優(yōu)化各種反應(yīng)條件，包括pH、PAN用量、反應(yīng)時間。再將絡(luò)合物抽濾富集在微孔濾膜上，采集其FTIR-ATR光譜，經(jīng)9點(diǎn)平滑、一階導(dǎo)數(shù)9點(diǎn)平滑等預(yù)處理后，利用隨機(jī)森林回歸算法建立其銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的定量校正模型。校正集按3∶1隨機(jī)分配為訓(xùn)練集和測試集，對模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化和評價。利用優(yōu)化后模型預(yù)測廣東、廣西和福建3個產(chǎn)地地龍樣品中銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并與ICP-MS測定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 最優(yōu)模型預(yù)測3個產(chǎn)地地龍樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5.85～6.98 mg/kg之間，與ICP-MS分析結(jié)果相比，相對誤差均小于20%。結(jié)論本方法利用膜富集技術(shù)提高了FTIR-ATR的檢測靈敏度，為中藥材重金屬元素的定量分析提供了一種新方法。

關(guān)鍵詞：膜富集；FTIR-ATR；隨機(jī)森林；地龍；重金屬

現(xiàn)今工業(yè)發(fā)展、環(huán)境污染等問題導(dǎo)致了中藥材重金屬污染問題日益嚴(yán)重，故中藥材的安全性問題益發(fā)受到中藥質(zhì)量控制研究工作的重視［1-2］。在2015年版《中國藥典》編制大綱中對提高中藥安全性控制水平特別提出了一條：“要大幅增加和完善安全性檢查項(xiàng)目，制定內(nèi)源性有毒成分和外源性重金屬及有害殘留物的控制方法和限度”［3］。

地龍有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的功效，是用于治療高熱神昏、驚癇抽搐、關(guān)節(jié)痹痛、高血壓等的一味常用嶺南道地藥材。地龍本身對泥土中的重金屬元素具有富集的特性［4-5］，或是因在加工炮制、儲存運(yùn)輸?shù)冗^程受到了重金屬的污染等，頻繁被查出重金屬含量超標(biāo)［1-2］?！吨袊幍洹分杏涊d地龍中重金屬的檢測方法為“通則0821第二法”［3］，即利用重金屬離子與硫代乙酰胺的顯色反應(yīng)原理進(jìn)行比色結(jié)果所得，標(biāo)準(zhǔn)為重金屬的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過30 mg/kg。本方法雖然快速簡單，但是檢測準(zhǔn)確度受主觀因素影響太大，且標(biāo)準(zhǔn)只限定了重金屬的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并沒有具體到每一種元素；而每種重金屬元素對人體產(chǎn)生危害的限量都是不一樣的，即使總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，個別也可能超出安全限量范圍。傳統(tǒng)的金屬離子檢測方法原子吸收光譜法（AAS）、原子發(fā)射光譜法（AES）、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）等，雖均有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但是其分析成本高、儀器昂貴，一般條件的實(shí)驗(yàn)室難以承擔(dān)。

本文以傅里葉變換-衰減全反射紅外光譜（FTIR-ATR）結(jié)合膜富集技術(shù)［6-8］，對中藥地龍中銅元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，即通過濕法硝解將所含的銅元素全部轉(zhuǎn)為游離態(tài)，然后與絡(luò)合劑在一定條件下進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，最后將絡(luò)合物富集于微孔濾膜之上，并采集光譜，應(yīng)用隨機(jī)森林算法建立Cu質(zhì)量分?jǐn)?shù)的定量校正模型。本法大大提高了紅外光譜的分析靈敏度［9-11］，使紅外光譜對重金屬元素的微量分析成為可能，并具有快速、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，為中藥材重金屬定量分析提供了一種新方法。

1 儀器與試藥

Tensor 37型傅里葉變換紅外光譜儀（德國BRUKER公司，安裝有OPUS7.2紅外光譜軟件），DLATGS檢測器，水平3次全反射ATR附件，光譜范圍400～4 000 cm-1，掃描間隔為2 cm-1，掃描次數(shù)為16次；PHS-3C數(shù)顯酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；JJ-1A電動攪拌器（江蘇精密公司，100 W，0～3 000 r/min）；水系WX型微孔濾膜（上海新亞凈化器件廠，0.22 μm）。

200 mg/L銅離子標(biāo)準(zhǔn)液、1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（PAN）、1 mol/L HCl、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，按文獻(xiàn)［12］方法配制；實(shí)驗(yàn)用水全部為超純水，所用試劑均為分析純。

地龍藥材飲片采購自廣州清平藥材市場，經(jīng)廣東藥科大學(xué)李書淵教授鑒定為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）去除內(nèi)臟的干燥全體，產(chǎn)地分別為廣東、廣西和福建。

2 方法與結(jié)果

2.1 校正集樣品的前處理和光譜采集

為提高定量模型的適用范圍，本文采用合成樣品，擴(kuò)大校正集樣本的濃度范圍。取產(chǎn)地為廣東的地龍藥材1 g（所含Cu元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)經(jīng)中國廣州分析測試中心應(yīng)用ICP-MS準(zhǔn)確測定），精密稱定，粉碎后置于150 mL錐形瓶中，加HNO3和HClO4的混合酸（體積比4∶1）20 mL，進(jìn)行濕法硝解。待硝解液冷卻，過濾除去泥沙，用超純水多次洗滌濾渣，將濾液合并后加入一定體積的銅離子標(biāo)準(zhǔn)液，即得合成樣品溶液。重復(fù)上述操作，配制合成樣品的質(zhì)量濃度范圍為5～500 mg/L，共30份。將樣品溶液以NaOH中和至中性，然后以緩沖液調(diào)pH至9.5，置于電動攪拌器下，以800 r/min的速度一邊攪拌一邊緩慢加入PAN絡(luò)合劑11 mL，攪拌反應(yīng)7 min后，抽濾，將絡(luò)合物富集于0.22 μm的微孔濾膜上，晾干，標(biāo)記，采其光譜數(shù)據(jù)。同時做試劑空白。

2.2 絡(luò)合反應(yīng)條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)中絡(luò)合反應(yīng)的條件，包括pH值、絡(luò)合劑用量、反應(yīng)時間等，都對絡(luò)合物的生成產(chǎn)生影響，因此必須進(jìn)行優(yōu)化。

如圖1所示，Ⅰ為空白濾膜的紅外吸收光譜，Ⅱ?yàn)樵噭┛瞻椎募t外吸收光譜，Ⅲ為Cu-PAN絡(luò)合物的紅外吸收光譜。通過對比3個光譜，發(fā)現(xiàn)在1 174、1 010、907、787 cm-14處波長點(diǎn)只有絡(luò)合物有紅外吸收而空白濾膜和試劑沒有，因此可以認(rèn)為是絡(luò)合物的特征吸收。選定其中1個吸收較明顯的波長點(diǎn)1 174 cm-1作為參考指標(biāo)，通過單因素分析，分別考察了絡(luò)合反應(yīng)不同的pH、PAN用量和反應(yīng)時間生成Cu-PAN的FTIR-ATR光譜圖。

圖1　空白濾膜（Ⅰ）、試劑空白（Ⅱ）和Cu-PAN絡(luò)合物（Ⅲ）的紅外吸收光譜圖Figure 1 　IR absorption spectra of microporous filter membranes（Ⅰ），reagent blank（Ⅱ）and Cu-PAN complex compound（Ⅲ）

2.2.1 pH值的選擇 金屬絡(luò)合劑與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)都有其相應(yīng)的pH范圍，根據(jù)文獻(xiàn)［6-7］將考察的范圍設(shè)置為7.5～10，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，在所選取的Cu-PAN絡(luò)合物特征吸收1 174 cm-1的波長點(diǎn)上，同一質(zhì)量濃度的銅離子溶液在不同pH下反應(yīng)絡(luò)合反應(yīng)所產(chǎn)生的絡(luò)合物光譜吸光度大小具有明顯的差異。從pH 7.5到9.5，反應(yīng)所產(chǎn)生絡(luò)合物濃度不斷增大并在pH值為9.5時達(dá)到最大，在pH為10時絡(luò)合物減少，說明銅離子和PAN的絡(luò)合反應(yīng)最適酸堿度在pH為9.5附近的弱堿環(huán)境，當(dāng)堿性繼續(xù)增強(qiáng)反而不利于絡(luò)合物的形成，原因可能是銅離子的水解影響了絡(luò)合物的生成。故選定9.5為銅離子與PAN絡(luò)合反應(yīng)的pH值。

2.2.2 PAN用量的選擇 從試劑空白實(shí)驗(yàn)所采得光譜可以看出，試劑會產(chǎn)生明顯的試劑峰，如果絡(luò)合劑PAN用量過大，很可能會掩蓋絡(luò)合物在某些波段的吸收，在利用全譜建模時，就會影響模型的預(yù)測準(zhǔn)確性；

圖2　pH7.5～10環(huán)境下所生成Cu-PAN的FTIR-ATR光譜圖（從上往下依次為pH 9.5、9.0、8.0、8.5、7.5、10）Figure 2 　FTIR-ATR spectra of Cu-PAN in pH7.5-10（pH 9.5，9.0，8.0，8.5，7.5，10 from the top to down）

因此，必須在保證PAN的用量能把銅離子完全絡(luò)合的情況下，不因其過量而產(chǎn)生干擾。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)銅離子標(biāo)準(zhǔn)液和藥材地龍中含銅元素的量，確定對PAN用量的考察范圍為10～12.5 mL，結(jié)果如圖3所示。從圖3可看出，同一質(zhì)量濃度的銅離子標(biāo)準(zhǔn)液和不同用量的絡(luò)合劑反應(yīng)所產(chǎn)生絡(luò)合物的光譜吸收強(qiáng)弱是有差異的。加入絡(luò)合劑用量為10到11 mL時，生成絡(luò)合物的量緩慢增加，從11 mL開始，所產(chǎn)生絡(luò)合物的量隨著PAN用量增加而下降，因此選擇最適PAN用量為11 mL。

圖3　PAN用量為10～12.5 mL時所生成Cu-PAN的FTIRATR光譜圖（從上往下依次為11、11.5、10.5、10、12、12.5 mL）Figure 3 　FTIR-ATR spectra of Cu-PAN with PAN of 10-12.5mL（11，11.5，10.5，10，12，12.5 mL from the top to down）

2.2.3 反應(yīng)時間的確定 根據(jù)文獻(xiàn)［12］所記載的方法，考察了反應(yīng)時間為2～25 min的絡(luò)合物生成效果，結(jié)果如圖4所示。從絡(luò)合物的FTIR-ATR光譜可以看出，隨著同一質(zhì)量濃度的銅離子標(biāo)準(zhǔn)液和PAN進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)時間的不同，反應(yīng)所產(chǎn)生絡(luò)合物的光譜吸收強(qiáng)弱具有差異。從2 min到7 min的反應(yīng)時間內(nèi)，絡(luò)合物不斷地生成，并在7 min達(dá)到最多，從7 min開始緩緩下降，趨于平緩。由此可知在2 min時絡(luò)合反應(yīng)并沒有進(jìn)行完全，在7 min左右基本達(dá)到最大絡(luò)合程度，之后可能隨著劇烈的攪拌，少部分已經(jīng)生成的絡(luò)合物再次分解，因此絡(luò)合物的量緩緩下降，最后趨于平緩，基本達(dá)到動態(tài)平衡。因此，選取銅離子和PAN絡(luò)合反應(yīng)的時間為7 min。

圖4　反應(yīng)時間為2～25 min時所生成Cu-PAN的FTIR-ATR光譜圖（從上往下依次為7、12、15、20、25、2 min）Figure 4 FTIR-ATR spectra of Cu-PAN in reaction time of 2-25 min（7，12，15，20，25，2 min from the top to down）

2.3 隨機(jī)森林校正模型

紅外光譜源于多種化學(xué)基團(tuán)的倍頻和合頻吸收，不容易用某一特征峰進(jìn)行紅外光譜定量分析，基團(tuán)含量信息與其待測組分含量和性質(zhì)指標(biāo)之間也不能用簡單的數(shù)學(xué)關(guān)系式來定量，因此化學(xué)計(jì)量學(xué)方法常被用于解決紅外光譜定量分析中的多元校正難題［13］。本文以隨機(jī)森林算法建立FTIR-ATR光譜的多元校正模型。

隨機(jī)森林（random forest，RF）是由一系列決策樹分類器h（x，θk），k=1，...，n組成的分類器集合，由Leo Breiman和Adele Cutler共同提出［14］。RF算法首先對樣本的訓(xùn)練集進(jìn)行有放回抽取k個相互獨(dú)立的自助樣本集，即bootsrap過程，而未被抽到的樣本組成了k個用來預(yù)測分類結(jié)果正確率的袋外數(shù)據(jù)，然后對每個bootsrap樣本構(gòu)建ntree個決策模型構(gòu)成RF，用RF對未知樣本進(jìn)行判別分類，最終結(jié)果按照分類器投票結(jié)果所得，回歸的情況下，為決策樹輸出值的平均值［15］。

影響RF定量模型預(yù)測精度的主要有2個參數(shù)，分別是特征變量數(shù)（mtry）和決策樹個數(shù)（ntree）［16-17］，本文采用網(wǎng)格搜索方法，對 mtry和ntree 2個參數(shù)分別在10～1 000和10～3 000范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化。本文以校正集的原始光譜（OS）、9點(diǎn)平滑光譜（9S）和一階導(dǎo)數(shù)9點(diǎn)平滑光譜（1D9S）及其對應(yīng)的濃度數(shù)據(jù)，分別歸一化后，按3∶1隨機(jī)分配成訓(xùn)練集和測試集，運(yùn)行1 000次，以結(jié)果均值評價模型性能。

本文采用Abhishek Jaiantilal編寫的 RF Mex/ Standalone工具包，在 MATLAB2010b軟件中完成RF建模。

2.4 模型優(yōu)化與評價

模型評價指標(biāo)包括相關(guān)系數(shù)（R）、均方根誤差（RMSE）和平均相對誤差（MRE）。R越趨近于1，RMSE和MRE越趨近于0，模型的精度越高。其計(jì)算方法見本課題組已發(fā)表的論文［18-19］。

本文采用網(wǎng)格搜索方法對mtry和ntree 2個參數(shù)分別在10～1 000和10～3 000范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化，運(yùn)行1 000次，以訓(xùn)練集和測試集的R、RMSE和MRE作為模型評價指標(biāo)，結(jié)果如表1所示。篩選出OS光譜的最優(yōu)模型的R、RMSEC和MRE分別為0.988 5、0.362 4和0.232 1，模型參數(shù)mtry為40，ntree為500，對測試集的預(yù)測結(jié)果 R、RMSEP和MRE分別為0.966 5、0.024 8和0.258 6；9S光譜的最優(yōu)模型的R、RMSEC和MRE分別為0.986 7、0.332 2和0.135 2，模型參數(shù)mtry為840，ntree為500，測試集的R、RMSEP和MRE分別為0.945 1、0.033 8和 0.306 2；1D9S光譜的最優(yōu)模型的 R、RMSEC和MRE分別為0.983 3、0.353 9和0.225 7，模型參數(shù) mtry為800，ntree為500，測試集的 R、RMSEP和MRE分別為0.779 5、0.039 7和0.335 2。

從以上結(jié)果可知，1D9S光譜模型的預(yù)測效果并不理想，原因可能是導(dǎo)數(shù)光譜在消除基線和其他背景干擾的同時，把有用的光譜信息也一并去除了；相比之下，9S光譜和OS光譜所建模型的預(yù)測效果更佳，說明在本試驗(yàn)中，原始光譜包含的大量細(xì)節(jié)信息都比較重要。綜合考慮，本文選擇OS光譜建立的最優(yōu)模型進(jìn)行后續(xù)計(jì)算。

2.5 樣品測定

分別取廣東、廣西和福建3個產(chǎn)地的地龍藥材飲片1 g，精密稱定，粉碎后經(jīng)相同處理，包括濕法硝解、凈化、絡(luò)合、富集等過程，最后采集光譜。每個樣品平行測定6次，取平均光譜代入校正模型計(jì)算，預(yù)測Cu元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。同時將該3批藥材送中國廣州分析測試中心進(jìn)行電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）檢測，測定Cu元素的準(zhǔn)確質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果列于表2。

從表2可以看出，3個產(chǎn)地地龍所含銅元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測相對誤差均低于20%，說明本方法具有較好的準(zhǔn)確性，可對實(shí)際樣品進(jìn)行測定。

表1 RF模型參數(shù)優(yōu)化與評價結(jié)果Table 1 Optimization and evaluation results of RF model（ˉx±RSD，n=1 000）

表2 最佳RF模型對3批地龍藥材的預(yù)測結(jié)果Table 2 Prediction results of Pheretimae samples in optimal RF model

3 討論

紅外光譜多以透射譜形式出現(xiàn)，一般不直接用于微量或痕量分析；而衰減全反射（ATR）屬于內(nèi)反射光譜，它通過增加全反射的次數(shù)，增強(qiáng)了吸收譜帶的強(qiáng)度，提高了分析靈敏度；同時，本文采用了膜富集技術(shù)，更加有效地提高了分析靈敏度，為中藥微量重金屬元素檢測提供了新方法。在今后工作中，我們將對絡(luò)合劑、配制絡(luò)合劑用溶劑、微孔濾膜、緩沖溶液、其他離子干擾等因素進(jìn)行深入討論，以進(jìn)一步完善本方法。

本文以膜富集技術(shù)結(jié)合隨機(jī)森林回歸模型對地龍飲片中的微量銅元素進(jìn)行定量分析，最優(yōu)模型對訓(xùn)練集和測試集的預(yù)測結(jié)果的R、RMSE和MRE分別為0.988 5、0.362 4、0.232 1和0.966 5、0.024 8、0.258 6，對3批不同產(chǎn)地的實(shí)際樣品預(yù)測相對誤差均小于20%，取得較好結(jié)果。本方法有望成為中藥材重金屬檢測的一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的新方法。

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（責(zé)任編輯：劉曉涵）

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0325-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016040803

收稿日期：2016-04-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金 （81274059）；廣東省自然科學(xué)基金（S2012010009166）；廣州市珠江科技新星基金（2014J2200021）；廣東省教育廳優(yōu)秀青年教師基金資助項(xiàng)目（Yq2013102）

作者簡介：蔡嘉華（1990—），女，2013級碩士研究生，Email：jiahuacai@163.com；通信作者：陳超（1981—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量控制研究，Email：gdpuchenchao@163.com；梁生旺（1954—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量控制研究，Email：swliang371@163.com。

Quantitative analysis on Cu content in pheretimae by FTIR-ATR spectra combining with membrane enrichment technology

CAI Jiahua1，2，3，YIN Songjie1，2，3，CHEN Chao1，2，3，WANG Shumei1，2，3，LIANG Shengwang1，2，3
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.State Administration of TCM，P.R.China，Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica，Guangzhou 510006，China；3.Engineering and Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universites of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China）

AbstractObjective To establish a rapid economic method for the determination of Cu content in the TCM pheretimae by FTIR-ATR spectra combined with membrane enrichment technology.Methods 30 calibration samples were processed by wet digestion and complexed by PAN a metal complexing agent for Cu.The complexing conditions including pH PAN quantity and reaction time were optimized with characteristic absorption of complex compounds as index.Then complex compounds were filtered in microporous membranes and the FTIR-ATR spectra of which were collected processed by 9-point smoothing and 9-point smoothing coupled with first differential etc.for the calibration.A calibration model of Cu content in pheretimae was established using random forest algorithm in which the calibration set was randomly assigned as training set and test set in 3∶1 ratio and the parameters were optimized as well.Cu contents

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-06-12 15：13 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160612.1513.003.htmlof pheretimae in Guangdong Guangxi and Fujian were predicted by optimized model and compared with ICP-MS results.Resluts The prediction concentrations in pheretima samples of three different roots using optimized model were between 5.85-6.98 mg/kg with relative error less than 20%compared with ICP-MS results.Conclusion A new method for the quantitative analysis of heavy metals in TCM was established and the sensitivity of FTIR-ATR was improved combined with membrane enrichment technology.The content of microscale Cu could be predicted in pheretimae properly.

Key wordsmembrane enrichment FTIR-ATR random forest pheretima heavy metals